1 8 0 四国医誌 55 巻 5 号 801 ～158 OCTOBER ,52 9919 （平1 )1
遺伝子銃による生体への遺伝子導入：原虫感染症に対する
DNA
ワクチン
及びサイトカイン遺伝子治療への応用
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徳島大学医学部寄生虫学教室 （平成11 年9 月24 日受付） はじめに野
園
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分子生物学の発展に伴い生体へ遺伝子を導入・発現さ せることにより目的の遺伝子機能をn vi oiv で解明する 又は遺伝子導入技術を臨床治療に応用する研究が生命科 学の分野を問わず現在行われている 。生体への遺伝子導 入の手法としてはウイルスベクターやリポソームを用い る方法があるが，ベクターの病原性，毒性あるいは煩雑 な操作が必要などの点で改良すべき問題点も残っている 。 上記以外に生体への簡便な遺伝子導入法として遺伝子銃 を用いる手法があり その概要及び応用例について解説 したい。 1 .遺伝子銃による遺伝子導入の概要 遺伝子銃とは金粒子やタングステンなどの重金属パー テイクル （微小粒子）にプラスミドなどの遺伝子を付着 させ，その遺伝子／パーティクル複合体をヘリウムガス により高速に加速し生体の組織あるいは細胞に直接導入 するものである 。その基本原理があたかもけん銃に類似 しているため遺伝子を打ち込む銃として遺伝子銃と呼ば れている 。従来この遺伝子導入法は細胞壁があり遺伝子 の導入が困難な植物細胞の形質転換法として用いられて・ きた1）。しかしながらその遺伝子導入の簡便性及び高い 導入効率から動物個体への遺伝子導入技術の一手法と なってきているD 遺伝子銃システムは複数の遺伝子導入 が可能でありさらに常圧下での打ち込みが可能であるこ とから動物個体の特定臓器への遺伝子導入が可能であ る,32。 そのためこの遺伝子銃による遺伝子導入システ） ムはDNA ワクチンや遺伝子治療をはじめとする様々な 分野に応用されている。2
.
遺伝子銃を用いたマウスへの遺伝子導入 遺伝子銃による遺伝子導入効率は遺伝子／パーティク ル複合体を加速するヘリウムガス圧 コーティング時の PVP enodilorry(Pplynivylo ）濃度，導入に用いるパー ティクル及びDNA の量などにより左右される 。我々は H e l i o s Gene Gun を用い主にマウス皮膚へ遺伝子導入を 行っており，マウス皮膚への遺伝子導入至適条件につい て検討した結果について示す（図1。 ヘリウムガス圧） 及びPVP 濃度について様々な条件を設定してその条件 下でhocinelpmarolhC searefsnartlyetca (CAT ）発現プ ラスミドをマウス皮膚に遺伝子導入を行った。PVP 濃 度についてはヘリウム圧にかかわらずO 又は0.05mg/ml でCAT 遺伝子の発現がO. lmg /ml に比べ高い傾向が認 められた。ヘリウムガス圧については2isp00 及び、isp003 でCAT 遺 伝 子 の 発 現 が 高 か っ た。 またDNA をコー ティングした金粒子を導入した皮膚を組織学的に検討し てみると金粒子は皮膚上皮及び真皮に局在していた（図2）。3
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DNA ワクチンへの応用 DNA ワクチンとは病原体抗原遺伝子を動物細胞内で 発現できる発現プラスミドに組換えその構築したDNA を直接宿主に導入することにより病原体抗原に対する免 疫応答を惹起させ感染抵抗性を獲得させるものである。 従来の免疫方法に比べDNA ワクチンの持つ特徴及び利 点としては（1 ）抗原ワクチンでは誘導が困難な細胞傷 害性T 細胞（CD8+T 細胞）の誘導ができる（2) DNA を接種するため弱毒病原体株接種で時として認められる 副作用がない（ 3 ）抗原ワクチンに比べ精製・調製が簡 便であり熱に対しても抵抗性である（4）他の遺伝子と図l PVP mg/ml) 0( マウス皮膚への遺伝子導入条件の検討 PVP 50.0( mg/ml) PVP 1.0( mg/ml) 官30 C D ． 回・
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200 300 400 ( P S I ) PVP 濃度及びヘリウム圧がマウス皮膚への遺伝子導入効率にあたえる影響について検討を行 った。遺伝子銃を用いCAT 発 現 プ ラスミドを様々な条件下で遺伝子導入を行い42 時間後のCAT 遺伝子の発現を測定した。 図2 マウス皮膚への遺伝子導入後の金粒子の局在 遺伝子銃を用いマウス皮膚への遺伝子導入後，皮膚における金粒 子／ プラスミド複合体の局在を組織学的に検討を行 った。金粒子 は皮膚表皮及び真皮層に局在している 。 の共導入あるいはワクチンベクターの工夫（宿主細胞で 発現させる抗原を分泌型あるいは細胞内に留まらせる） ことで宿主免疫応答を増強及そして任意のMHC ssalc I I /MHC cssal I依存型免疫応答の制御が可能などがあげ られる 。現在DNA ワクチンにおける遺伝子導入法とし ては発現プラスミドを生理食塩水などに溶解し直接筋肉 接種を行う方法と遺伝子銃を用いる方法が主に用いられ ている 。遺伝子銃を用いると筋肉接種法に比べ約1 /10 0 から 1 /1, 000 程度のプラスミドで同程度の免疫応答を 誘導できるとされている4。 近年） DNA ワクチン に関 する研究が報告されつつあり，ウイルス, 65 ），細菌87, ）及 び原虫感染症9-11）での有効性が動物実験で明らかにされ ている 。 原虫感染のなかでもマラリア感染は世界中で8億人以 上が擢患さらに年間002 万人以上がその感染のために死 亡している地球上第l級の感染症である 。現在，宿主防 御免疫からのエスケープ機構が巧みなマラリア感染に対 する有効なワクチンは皆無である 。我々はマラリアワク チン開発の基礎研究として赤血球期のマラリア原虫に発 現し有力なワクチン候補抗原の一つであるセリンリピー ト抗原 （SERA ）遺伝子12 -14 ）を用いマウスにDNA 免疫 の実験を行った。遺伝子銃を用いSERA DNA 免疫をす ることにより免疫マウス血清中にSERA 特異的抗体が 出現した（図3）。 またSERA DNA 免疫による免疫応 答を増強そして制御する目的でy-norefretni (IFN-y ,) i n t e r l e u k i n (IL ) - 4 I-12L 及びGM-CSF とい ったサイ トカイン遺伝子を共導入した場合の影響について検討を 行った。いずれのサイトカイン遺伝子を共導入した場合 もSERA 特異的抗体価の上昇が認められた。 さらに1 型ヘルパーT 細胞（Th 1）の免疫応答の指標である IgG2 aレベルは特にIFN-y 及 び12IL- 遺伝子共導入で 高いことからこれらのサイトカイン遺伝子はDNA 免疫 による免疫応答をTh l型に制御したことを 示唆してい る（図 4) 51。 これらの結果よりサイトカイン遺伝子共） 導入はDNA ワクチンによる免疫誘導を増強及び制御す1 8 2 図3 SERA DNA 免疫による特異抗体の誘導 ” ・、 E C I I ) ， － 守 0 . 8 0 . 6
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SERA - 0 一一 ntrolCo 遺伝子銃を用いてSERA 発現プラスミドを2 週間間隔で 3 回マウ ス皮膚に導入し経時的にSERA 特異的抗体をELISA を用い測定 した。 る手法の一つである事が示された。 4. サイトカイン遺伝子治療への応用 I L -1 2 はTh 1細胞の分化誘導 リンパ球の細胞傷害 活性及びNK 細胞活性増強など様々な作用をもっ生理活 性物質である。これまでの研究で2IL-1 は様々な感染症 酒 井 徹 他 及び腫蕩に対し治療効果があることが実験動物レベルで 明らかになっている61。）Yang らは遺伝子銃を用い21L-I 遺伝子をマウスに導入し悪性腫蕩に対する治療実験を 行った。それによると腫蕩細胞をマウスに接種したのち I L -1 2 遺伝子を導入することにより腫蕩の増殖が抑制さ れ，またある種の腫蕩株においては腫蕩の消失が認めら れた,71 18）。我々は2IL-1 発現プラスミドを遺伝子銃によ りマウスに導入し原虫感染症に対する抵抗性が増強する か検討を行った。遺伝子銃により2IL-1 発現プラスミド を導入することにより皮膚導入局所に2L-1I 蛋白の発現 が認められた（図5 ）。シャーガス病の病原体であるク ルーズトリパノソーマを感染させたマウスに2-1IL 発現 プラスミドを導入した結果感染後血中に出現するク ルーズトリパノソーマの数がコントロールに比べ有為に 減少しており原虫感染症に対する治療効果が認められ た)91 （図6。）5
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ま と め 遺伝子銃を用いて行った原虫感染症に対するDNA ワ クチン及びサイトカイン遺伝子治療の結果を簡単に紹介 した。遺伝子銃を用いた生体への遺伝子導入法は他の手 法に比べ煩雑でなく簡便であることからDNA ワクチン 又は遺伝子治療以外の分野にも広く応用されるものと思 われる。 図4 DNA 免疫により誘導される特異抗体におけるサイトカイン遺伝子の影響 0 . 6 0 . 5 0 . 4 E C : 宮.30 守。
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皮膚組織への2-1IL 遺伝子導入による2-1IL 蛋白の発現 500 図5 1 . B,hcri G.R,. nda ,sknarF :.T tnemopelevD andnoitazimitpo o felitcejorporcim systems rof tnalp citeneg -snart f o r m a t i o n . .tsuA
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3 . Cheng, ,.Lr,effolhegeiZ P.R,. and Yang, :.S-.N nI
v i v o promoter ytivitca and enegsarnt noisesrpxe ni mammalian icatoms seussit edtuaalve by ugnsi -rap t i d e bombardment. .corP .ltaN d.aAc .icS USA, 0 : 9 4 4 5 5 -4 4 5 9 , 1 9 9 3 4. er,emtreP .T ,.M ,srteboR R.T,. and ,syneaH .J:.R I n f l u e n z a suriv nietorpoelcun cificeps nlibulonogmuim G sssalbcu and enkiotyc sesonspre deticile by DNA v a c c i n a t i o n rea dependent on the etor vfo orect DNA d.yrevile
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.loriV : 607 ,51269-11 9691 5 . Fn,yan F.E,. t,rebseW G.R,.,relluF H.D,. ,sayneH.
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R . , te:.la DNA :seniccav evitcetorP nsatiomunizim by p,laretnera ,lasocum and nene-gug .snoitaluconi P r o c . .ltaN ad.Ac .icS .AS..U 0 : 19 ,28411-8741 9391 6. Yokoyama, ,.M ,angZh ,.J and ,ntothiW .J:.L DNA immunization onfersc tnoiectorp tsniaga lahtel lymphocytic sitignniemoirohc survi .noitcefni .J V i r o l . , : 269 ,8862-486 9519 7 . ,yrarB A.,M. ,iaL W. C,. and nosthnJo .S A: noitcetorP a g a i n s t lasampocyM noitcefni gnisu yrarbil-noisserpxe i m m u n i z a t i o n . e,turNa 773 : 6,3562-3 5991 8 . Tn,cosa E.R,. ,notsloC M.
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,gnoRa ,.S,soluoporvatS E . , ate:.l noiatinccaV tsnaiga sisolucrebut by DNA i n j e c t i o n . .taN .,deM 2 : 8,289-88 6919 9 . Sh,egaed ,.M Hedstrom, ,.R ,trbaoH ,.P and man,offH S . : .L noictetorP tsinaga ailarma by immunization w i t h midlasp DNA eigndocn eitzooorspmucric -orp t e i n . .corP .ltaN .Acad .icS USA, 19 : 9,0879-668 4919 1 0 . ,Xu ,.D and ,weiL .F:.YnoitcetorP tsniaga sisainamhsiel by iniotecjn DNA fo encoding a major surface g l y c o p r o t e i n , ,36pg fo .L.rojam Immunology, : 48 1 7 3 -1 7 6 , 1 9 9 5 1 1 . ,nnatharuGu ,.S ksSac .D,.L Brown, R.D,. ,renieR .S L ., te:.la Vaccination with DNA encoding the
献 文 遺伝子銃により12L-I 発現プラスミドをマウス皮膚に導入24 時間 後，導入部における012p7IL- 蛋白の発現をELISA により測定を した。
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図6 IL-12 遺伝子導入よるクルーズトリパノソーマ感染防御効果 5 0 0-E
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001 ‘ －c u l l . I L・12 一一仁ト－lortnoC ~ 3 5 Days retfa noitcefnI クルーズトリパノソーマ感染マウスに遺伝子銃を用い2L-1I 発 現 プラスミドを導入し，経時的に血中に出現するクルーズトリパノ ソーマの数を測定した。-12IL 遺伝子群は原虫数の低下が認められ， I L -1 2 遺伝子導入により感染抵抗性が増強した。 稿を終えるにあたり 共同研究者である大阪大学微生 物病研究所堀井俊宏博士，大阪大学医学部宮崎純一博士， 新田能朗博士及びご協力いただいた徳島大学医学部寄生 虫学教室の方々に感謝いたします。 0 1 0 百幸 謝1 8 4 immunodominant LACK etisarap negtina esrefnco p r o t e c t i v e immunity mot ice detcefni hitw niashmaLei m可.ro
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.pxE ,.deM 681 : 1,7141-713 7991 1 2 . ,grublesnI.
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,tsruhtaB .I,.C ,soponKan ,.J,dlefhcraB G . ,.L te:.la evictoetrP immunity induced by in Aotus monkeys by a ritannbmoce SERA nietorp foPlasmodium arumcipfal : Adjuvant e旺stce on i-cudn t i o n pfoeivtcteor i.ytunmmi .tcefnI Immun., 16 : 2 0 4 1 -2 0 4 7 , 1 9 9 3 1 3 . ,grublesnI ,.],tsruhtaB .I,.C sopon,Kan
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et.la evit: cetorP immunity dceuidn ni Aotus mon-k e y s by a rntinabmoce SERA nietorp fo Plasmodium f a l c i p a r u m : herFurt seiduts ginsu SERA 1 and MF 7 5 . 2 a.tanvujd .tcefnI ,.numIm 16 : 2,250-2840 9391 1 4 . ,uezSu ,.K,otI ,.M Matsumoto, ,.Y ,kaoniaT ,.Y ate:.l P r o t e c t i v e immunity dducein nilerriuqs monkeys w i t h inantrecomb enires teaepr neigtna (SERA) fo P l a s m o d i u m f a l c i p a r u m . .lotisaraP ,.tnI 46: ,52-71 7919 1 5 . ,iakaS ,.T,iiroH ,.T ,adeasiH ,.H ,ngahZ ,.M te:.la DNA immunization with Plasmodium falciparum
酒 井 徹 他 s e r i n e taeper negitna noi: talugeR hfoloraum immune r e s p o n s e by cnoitaluconio cfo neiokyt niosesprex p l a s m i d . .lotisaraP ,.tnI 8 : 24 ,33-7 9991 1 6 . ,ireihcinrT :.G21-niukelretnI : A ceniokty tta he i n t e r f a c
e inflammation fo and immunity. Adv. I m m u n o l . , : 807 ,342-3 8919 1 7 . h,cvileihmkaR LA.,.,.],renruT ,droF M. ],. McCabe, D . , ate.l : Gene daetmedi-nug niks noitcefsnart thwi i n t e r l e u k i n 21 gene stluser ninoisserger fo-batse l i s h e d yprimar and citatsatem murine .sromut .corP N a t l . d.Aca .icS USA, : 639 ,96261-92 6991 1 8 . ,hcvieilmhkRa A. L,. ,nessnaJ ,.K ,ernruT
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,pluC ,.J e t.la : neokiCyt gene yperaht cfo recna gnsiu gene gun gy:technolo roierpuS antitumor ytivitca fo i n t e r l e u k i n -1 2 . Hum. Gene ,.rehT 8 : 1303 ,1131 7919 1 9 . ,iakaS ,.T,adeasiH ,.H,awaikhsI N.H ,oanka .Y ate:.l Gene gun-mediated yreivled fo LI ・21 niosesprex p l a s m i d stcetorp from snoitcefni thwi ralullecartni p r o t o z o a n ,setisarap ainamhsieL major and ηT panosoma c r u z i ni.ecim ni()tnirpGene gun approches for DNA vaccine and cytokine gene therapy in protozoan parasite
infection
Tohru Sakai, and Kunisuke Himeno
Department of Parasitology and Immunology, The University of Tokushima School of Medicine, Tokushima
SUMMARY
The particle-mediated method for gene delivery with a gene gun utilizes a shock wave to accelerate DNA-coated gold particles into target cells or tissues. This gene delivery method is effective in various somatic tissues in vitro and in vivo. We have, herein, applied this gene delivery system to DNA vaccine and cytokine gene therapy for protozoan parasite infections. We used cDNA encoding 47 kDa of Plasmodiumfalciparum serine repeat antigen (SERA) that is a vaccine candidate antigen and did SERA DNA immunization with mice using gene gun. Significant SERA-specific antibodies (Abs) were observed by SERA DNA immunization. Furthermore, these Ab responses were enhanced and regulated by coinoculation of cytokine expression plasmid. For other application, we examined the ef-fects of in vivo IL-12 gene treatment on the course of infection with obligate protozoa,
Trypanosoma cruzi. Transfer with IL-12 expression plasmid in vivo regulated systemic immune responses and furthermore this treatment controlled the progression of experimen-tal trypanosomiasis. Therefore, this gene gun approach may be a useful for DNA vaccine and gene therapy in a wide spectrum of diseases other than the protozoan parasite infection.
