腎糸球 体基底膜 をモデル と した
理想 的な透析 膜作 製 に関す る基 礎 的研 究
岡 山 大 学 医 学 部 第 三 内科 学 教 室(指 導:太 田 善 介 教 授)
長 宅 芳 男
(平 成5年1月6日 受 稿)
Key words:透 析 膜,腎 糸 球 体 基 底 膜,size barrier, charge barrler,ス ル ホ ン酸 基
緒 言 近 年,β2-microglobulin (β2-MG)が 透 析 ア ミロ イ ドー シ ス の ア ミ ロ イ ド線 維 形 成 蛋 白 と し て 沈 着 して い る こ とが証 明 さ れ て 以 来1),β2-MG の 除 去 を 目的 と した ハ イ パ フ ォ ー マ ン ス 膜 が 開 発 さ れ,種 々 の 臨 床 的 検 討 が 行 わ れ て い る2-5). しか し,ま だ 完 全 に は満 足 し た 結 果 は 得 ら れ ず, 従 来 の 膜 の 改 良 や 新 た な 膜 の 開 発 が 行 わ れ て い る の が 現 状 で あ る. 方,腎 糸 球 体 基 底 膜(GBM)は,Ⅳ 型 コ ラ ゲ ン を主 体 と し た網 目構 造 がsize barrier6-12) を 形 成 し,GBMの 内 透 明 層 お よ び 外 透 明 層 の ヘ パ ラ ン硫 酸 プ ロ テ オ グ リ カ ン(HS-PG)が charge barrier12-17)を 形 成 して い る.こ のsize barrierとcharge barrierの 両 作 用 に よ り蛋 白 の 透 過 性 は 規 定 さ れ て い る と考 え られ て い る. そ の た め,透 析 膜 を開 発 す る際 に,人 工 腎 臓 と して の 観 点 か ら,透 析 膜 のpore sizeの 制 御 の み な らず,透 析 膜 の 有 す るchargeの 重 要 性 は 以 前 よ り指 摘 さ れ て い た と こ ろ で あ るが,そ の 研 究 は ほ とん ど な さ れ て い な い の が 現 状 で あ る. そ の た め,今 回,GBMのcharge barrierを 形 成 し て い るHS-PGが ス ル ホ ン酸 基 を有 して い る こ とか ら,透 析 膜 に ス ル ホ ン酸 基 を付 加 し て,陰 性 荷 電 を有 す る 透 析 膜 を作 製 し た.こ の 透 析 膜 と,従 来 の ほ ぼ 中性 の 荷 電 を有 す る 市 販 の 透 析 膜 を対 照 と し て 使 用 し,蛋 白の 透 過 性 を 比 較 検 討 し た.そ し て 数 種 類 の 異 な るporeの 大 き さの 透 析 膜 で 同 様 の 検 討 を行 うこ とに よ り, 透 析 膜 に お け る透 析 膜 のporeの 大 き さ と陰 性 荷 電 の 相 互 関 係 を 明 ら か に し て,理 想 的 な 透 析 膜 の 開 発 の 基 礎 的 研 究 をお こ な っ た の で報 告 す る. 方 法 ハ イパ フ ォ ー マ ン ス メ ン ブ レ ン 研 究 会 の ワー キ ン グ グ ル ー プ に よ る透 析 膜 の 性 能 評 価 法18)に 準 じて,水 系 の 実 験 系 に お い て ふ る い 係 数 の 測 定 を お こ な い,透 過 性 を検 討 した.以 下 に そ の 概 略 を記 す. 1. 実 験 膜
クラ レ社 製 のethylene vinyl alcohol (EVAL) 膜 を使 用 し て い る ダ イ ア ラ イ ザ ー を,実 験 膜 と し た.そ の 数 あ るEVAL膜 の う ち,血 液 透 析 の ダ イ ア ラ イ ザ ー と して 作 製 さ れ て い るporeの 平 均 直 径 が4nmの 膜 お よ び5nmの 膜 と,二 重 濾 過 型 血 漿 交 換 の 二 次 膜 と し て 作 製 さ れ て い る poreの 平 均 直 径 が8nmの 膜 の 計3種 類 の 膜 を 使 用 し た.膜 厚 は,poreの 平 均 直 径 が4nmの 膜 と5nmの 膜 とは25μmで あ り,poreの 平 均 直 径 が8nmの 膜 で は50μmで あ る. こ れ らporeの 平 均 直 径 が 異 な る3種 類 の 膜 に,40℃ の 硫 酸 酸 性 条 件 下 で オ ル トベ ン ズ ア ル デ ヒ ドス ル ホ ン酸 ナ ト リウ ム に よ る イ オ ン化 を 施 して,ス ル ホ ン 酸 基 を付 加 した 陰 性 荷 電 膜 を 作 製 した.付 加 す る 陰 性 荷 電 の程 度 は,元 素 分 析 に よ る硫 黄 原 子 の 存 在 量 が0.45mol%と0.90 mol%の2種 類 に し た.対 照 膜 と して,ス ル ホ ン 酸 基 を付 加 し て い な い,ほ ぼ 中 性 の 荷 電 を有 す る 市 販 のEVAL膜 を使 用 し た. 317
318 長 宅 芳 男
2. 試 料
透 過 性 を 検 討 す る た め の 蛋 白の 試 料 と して, myoglobin (SIGMA社 製), chymotrypsinogen
A (SIGMA社 製), bovine serum albumin (BSA; SIGMA社 製)を 選 ん だ.各 々 の 蛋 白 の 直 径,分 子 量,等 電 点 を表1に 示 した .各 々 の 蛋 白 をpH 7.4の 燐 酸 緩 衝 液 に 溶 解 し0.1%の 溶 液 に して 用 い た. 3. 測 定 条 件 図1に 実 験 装 置 図 を示 し た.ダ イ ア ラ イ ザ ー の 入 口 流 量 を200±4ml/min,濾 液 流 量 を10± 2ml/(m2・min),溶 液 の 温 度 を36∼38℃ と した. 濾 液 は 再 循 環 させ た.実 験 を開 始 し て30分 後 に, ダ イ ア ラ イ ザ ー の 入 口側(Bi),ダ イ ア ラ イ ザ ー の 出 口 側(Bo),濾 液(F)よ り検 体 を採 取 して 濃 度(C)を 測 定 し た. 表1 試 料 の 蛋 白の 直 径,等 電 点,分 子 量 4. 蛋 白 定 量
蛋 白 の 定 量 はbio-rad protein assay kitに て お こ な っ た. 5. ふ る い 係 数(sieving coefficient; SC)の 測 定 SCの 測 定 に は, SC=CF/(C Bi+C Bo)/2 の 式 を 用 い た. 結 果 1. myog10binのSC(図2) 中性 荷 電 膜,陰 性 荷 電 膜 は 共 に,膜 のporeが 大 き くな るに 従 い,SCが 大 き くな る の を認 め た. しか し,陰 性 荷 電 膜 のSCは,中 性 荷 電 膜 のSC に 比 べ 低 値 を示 し,ま た 陰 性 荷 電 の 強 い 膜 のSC が,陰 性 荷 電 の 弱 い 膜 のSCに 比 べ,よ り低 値 を示 して い た. 図1 実験 回路 図 2. chymotrypsinogen AのSC(図3) 中性 荷 電 膜,陰 性 荷 電 膜 は 共 に,膜 のporeが 大 き くな るに 従 い,SCが 大 き くな る の を 認 め た. ま た,myoglobinと 同 じ く,陰 性 荷 電 膜 のSC は 中性 荷 電 膜 のSCに 比 べ 低 値 を 示 し,陰 性 荷 電 の 強 い 膜 のSCが,陰 性 荷 電 の 弱 い 膜 のSC
に 比 べ,よ り低 値 を示 し て い た. 3. BSAのSC(図4) 中性 荷 電 膜 で は,膜 のporeが 大 き くな る に 従 い,SCが 大 き くな る の を 認 め た.陰 性 荷 電 膜 も 同様 の 傾 向 を 認 め た が,特 にporeの 平 均 直 径 が4nmの 膜 と5nmの 膜 で は,BSAが ほ と ん ど透 過 して い な い の を 認 め た. 考 察 GBMは 濾 過 に よ り原 尿 を生 成 して い るが, そ の 際 にGBMは β2-MGな ど のalbuminよ り 小 さ い低 分 子 蛋 白 は 濾 過 させ る が,反 対 にalbu minやalbuminよ り大 きな 物 質 は ほ とん ど 濾 過 させ な い. 生 体 のGBMは3層 構 造 を呈 し て お り,内 皮 細 胞 側 か ら 内透 明 層,緻 密 層,外 透 明 層 よ り成 る.そ のGBMは,Ⅳ 型 コ ラー ゲ ン,プ ロ テ オ グ リカ ン お よ び 種 々 の 糖 蛋 白 よ り構 成 さ れ て い る.こ れ らの 物 質 は 互 い に 網 目構 造 状 に 密 に 結 合 しsize barrierを 形 成 して い る.教 室 の 太 田 ら6)は,こ のGBMの 網 目構 造 をnegative staining法 に よ り世 界 で初 め て 電 顕 で観 察 した. そ の 後 も,種 々 の 異 な る 方 法 で,そ の 網 目構 造 が 電 顕 で 観 察 され て い る7-10). 図2 myoglobinの 透 過 性 の 検 討
図3 chymotrypsinogen Aの 透 過 性 の 検 討 図4 BSAの 透 過 性 の検 討
ま たGBMの 内透 明 層 と外 透 明 層 と に は,HS PGに 富 む グ リ コサ ミ ノ グ リ カ ン に よ り構 成 さ れ る,陰 性 荷 電 を 保 持 す る 格 子 形 成 が あ り, charge barrierを 形 成 し て い る12-17). こ の よ う に,GBMは,albuminを は じめ と す る 蛋 白 に 対 して,構 造 的 に, size barrierと charge barrierの 両 作 用 に よ り,高 い 透 過 選 択 性 を 保 持 し て い る と考 え ら れ て い る. と こ ろ が,現 在 の 透 析 膜 は,ほ ぼ 中性 荷 電 か, 若 干 の 陰 性 荷 電 を有 す る膜 が 主 流 で あ る.そ の た め 村 上19)は,GBMを モ デ ル と し て,透 析 膜 に 陰 性 荷 電 を付 加 す る こ とに よ り,透 析 膜 が 改 良 で き る 可 能 性 を述 べ て い る. そ こ で,今 回 の 検 討 で は,GBMを モ デ ル と し て,陰 性 荷 電 と し て ス ル ホ ン酸 基 を付 加 し た 透 析 膜 を 作 製 し た.そ の透 析 膜 と してEVAL膜 を選 ん だ が,そ の 理 由 は,EVAL膜 は い っ た ん 膜 が 製 造 され た 後 に 化 学 処 理 を施 す こ と に よ り 荷 電 を付 加 で き る か ら で あ る.し か も化 学 処 理 の 時 間 を 変 え る こ と に よ り,荷 電 の 程 度 も 自 由 に 変 え る こ とが で き る. た だ し,GBMの 厚 さ は300nmで あ る の に 対 し,EVAL膜 の 厚 さ は25μmも し くは50μmで
320 長 宅 芳 男 あ り,EVAL膜 はGBMの 約80∼160倍 以 上 の 厚 さ を有 して い るが,EVAL膜 の 強 度 を保 つ た め に は,現 在 の と こ ろ,こ れ 以 上 に 膜 厚 が 薄 い EVAL膜 を 作 製 す る こ と は 困 難 で あ る.そ の た め,GBMのporeよ り も大 き なporeをEVAL 膜 が 有 さ な い と,GBMで 濾 過 さ れ る 物 質 が EVAL膜 で 濾 過 さ れ な い とい う事 態 が 起 こ り得 る.そ の た め 太 田 ら6)が 観 察 し たGBMのpore よ り も大 き なporeを 有 す るEVAL膜 を,今 回 の 実 験 で は 使 用 し た. ま た,蛋 白 の 透 過 性 を検 討 す る た め の 試 料 と して, myoglobin, chymotrypsinogen A, BSA を選 ん だ.BSAは, GBMが 透 過 性 を規 定 して い る最 も 重 要 な 蛋 白のalbuminの 試 料 と して 用 い た.myoglobinは,β2-MGと ほ ぼ 同 じ分 子 量 の 低 分 子 蛋 白 で あ る た め使 用 し た.た だ し, β2-MGは 弱 い 陰 性 荷 電 を 有 して い る の に 対 し, myoglobinは 弱 い 陽 性 荷 電 を有 し て い る の が, 両 者 の 相 違 点 で あ る.chymotrypsinogen Aは, myoglobinよ り分 子 量 が 大 き く,albuminよ り 分 子 量 が 小 さ い 蛋 白 と し て 試 料 に 用 い た.な お, chymotrypsinogen Aは,myoglobinと 同 じ く 弱 い 陽 性 荷 電 を有 し て い る. そ の 結 果,poreの 平 均 直 径 が4nmの 膜 の み な らず5nmの 膜 で も,ス ル ホ ン酸 基 を付 加 す る こ とに よ り,BSAは ほ とん ど透 過 性 を認 め な く な っ た.し か し,myoglobinで は,poreの 平 均 直 径 が4nmの 膜 と5nmの 膜 と で は透 過 性 が 異 な り,4nmの 膜 の 透 過 性 が よ り低 下 して い た. 従 っ て,BSAとmyoglobinの 透 過 性 を み る 限 り で は,平 均 直 径 が5nmの 膜 に ス ル ホ ン酸 基 を 付 加 し た 陰 性 荷 電 膜 が,よ り良 好 な 透 過 選 択 性 を有 し て い た と考 え られ る.し か し,あ ま りに 強 い 陰 性 荷 電 を付 加 す る と,poreの 平 均 直 径 が 5nmの 膜 で も,myoglobinの 透 過 性 が 低 下 す る 可 能 性 が あ る た め,ス ル ホ ン 酸 基 の 付 加 の 程 度 は 慎 重 に 決 定 す る必 要 が あ る. 一 方,β2-MGよ り分 子 量 が 大 き く,albumin よ り分 子 量 の 小 さ い 領 域 の 尿 毒 素 に 関 す る研 究 は ほ とん ど な され て お らず,従 っ て この 領 域 の 物 質 の 除 去 の 必 要 陛の 有 無 に 関 して,異 論 も 多 い.し か し,GBMで はalbuminよ り分 子 量 の 小 さい 蛋 白 は ほ と ん ど濾 過 さ れ る こ とが 知 られ て い る た め,こ の 領 域 の 物 質 は 可 能 な 限 り除 去 す るべ き と思 わ れ る. 今 回 の 検 討 で は,こ の 領 域 に 属 す る 蛋 白 と し て,chymotrypsinogen Aを 試 料 と して 選 ん だ. そ の 結 果,陰 性 荷 電 を 付 加 し た 膜 で は, chymotrypsinogen Aの 透 過 性 の 低 下 を 認 め, さ らに 改 良 の 余 地 は 残 さ れ て い る と思 わ れ る. 以 上 の よ うに,透 析 膜 に ス ル ホ ン酸 基 を付 加 し た 陰 性 荷 電 を有 す るEVAL膜 は,理 想 的 な 透 析 膜 に な る 可 能 性 が あ る こ とが 示 さ れ た.し か し,EVAL膜 を さ らに 薄 くす れ ば,さ ら に 透 過 選 択 性 の 高 い 膜 が 開 発 で き る 可 能 性 も残 っ て い る.そ の た め に は,EVAL膜 を さ ら に 薄 い 膜 に して も充 分 な 強 度 を保 ち,ま た 膜 のporeの 大 き さ の 制 御 も損 な わ な い 技 術 開 発 が 必 要 と考 え られ る. 結 語 GBMのcharge barrierを 形 成 し て い るHS PGが ス ル ホ ン 酸 基 を有 し て い る こ とか ら,透 析 膜 に ス ル ホ ン酸 基 を付 加 し て,陰 性 荷 電 を 有 す る 透 析 膜 を作 製 し た.こ の 透 析 膜 と,従 来 の ほ ぼ 中 性 の 荷 電 を有 す る市 販 の 透 析 膜 を対 照 と し て使 用 し,蛋 白 の 透 過 性 を 比 較 検 討 した.そ の 結 果,ス ル ホ ン酸 基 を付 加 した 陰 性 荷 電 膜 は 高 い透 過 選 択 性 を有 し,理 想 的 な 透 析 膜 に な り 得 る こ と を認 め た. 本 研 究 は財 団法 人 岡 山県 腎 臓バ ン クの 血 液 浄化 法 及 び 腎臓移 植 に関 す る研 究助 成金 に よ った. ま た本研 究 は第34回 日本 腎 臓学 会 総会(平 成3年 11月 岡山)に おい て発 表 した. 稿 を終 え る にあ た り,御 指 導,御 校 閲 を賜 りま し た太 田善 介教 授 に 深甚 な る謝 辞 を捧 げ る と ともに, 終 始 研 究 の御 指 導 をい ただ い た槇 野 博 史 講 師,柏 原 直樹 先 生 に深 謝 い た します.ま た,透 析 膜 の作 製 な らびに 貴重 な ご意 見 を賜 りま した,株 式 会社 クラ レ の犬 飼 雄一 氏,河 田一 郎 氏,重 久 隆 秀 氏,赤 須 弘幸 氏 に心 か ら感 謝 の 意 を表 し ます.
文
献
1) Gejyo F, Yamada T, Odani S, Nakagawa Y, Kunimoto T, Kataoka H, Suzuki M, Hirosawa Y,
Shirahama T, Cohen AS and Schmid K: A new form of amyloid protein associated with chronic
hemodialysis was identified ƒÀ2-microglobulin. Biochem Biophys Res Commun (1985) 129, 701-706.
2) 酒 井 良 忠,小 林 拓 一,片 岡 浩,国 友 哲 之 輔,武 山 高 之:β2-microglobulin除 去 用 透 析 膜 の 開 発.腎 と透 析 別 冊 (1988) 13-17. 3) 小 林 裕 之,小 野 利 彦,山 本 則 之,福 田 豊 史,片 岡 浩,国 友 哲 之 輔,山 田 智 子,田 山 敏 一:β2-microglobulin 除 去 膜 の 長 期 使 用 効 果 の 検 討,腎 と 透 析 別 冊 (1991) 105-108. 4) 佐 々 木 義 夫,牟 田 俊 幸,高 杉 昌 幸:各 種 血 液 浄 化 膜 に よ る 小 分 子 量 蛋 白 の 除 去 性 能.腎 と透 析 別 冊 (1989) 95-99. 5) 星 野 敏 久,峰 島 三 千 男,田 中 嘉 彦,佐 藤 洋,北 野 優 里,江 良 和 雄,鈴 木 利 昭,阿 岸 鉄 三,太 田 和 夫: High performance membrane dialyzerに お け る 低 分 子 量 物 質 の 除 去 特 性.透 析 会 誌 (1990) 23, 1191-1195.
6) Ota Z, Makino H, Miyoshi A, Hiramatsu M, Takahashi
K and Ofuji T: Electron microscopic
demonstration
of meshwork structure in human and bovine glomerular basement membrane.
Acta
Med Okayama
(1977) 31, 339-342.
7) Makino H: Molecular sieve in rat glomerular basement membrane as revealed by negative staining.
Acta Med Okayama
(1982) 36, 371-382.
8) Ichiyasu A and Makino H: Molecular sieve of the rat glomerular basement membrane:
A transmis
sion electron microscopic study of enzyme-treated
specimens. Acta Med Okayama (1988) 42, 317
-325.
9) Yamasaki Y, Makino H, Hironaka
K, Hayashi Y, Shikata K and Ota Z: Three-dimensional
architecture
of rat glomerular
basement membrane
by ultra-high
resolution scanning electron
microscopy.
Acta Med Okayama
(1990) 44, 333-335.
10) Shikata K, Makino H, Ichiyasu A and Ota Z: Three-dimensional
meshwork structure of glomerular
basement membrane revealed by chemical treatment.
J Electron Microsc (1990) 39, 182-185.
11) Batsford SR, Rohrbach R and Vogt A: Size restriction in the glomerular capillary wall: Importance
of lamina densa. Kidney Int (1987) 31, 710-717.
12) Olson JL, Rennke HG and Venkatachalam
MA: Alterations in the charge and size selectivity barrier
of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats.
Lab Invest (1981) 44, 271-279.
13) Chang RLS, Robertson CR, Deen WM and Brenner BM: Permselectivity of the glomerular capillary
wall to macromolecules III.
Restricted transport of polyanions.
Kidney Int (1975) 8, 212-218.
14) Kanwar YS, Farquhar MG: Isolation of glycosaminoglycans
(heparan sulfate) from glomerular
basement membranes.
Proc Natl Acad Sci (1979) 76, 4493-4497.
15) Kanwar YS,
Linker A and Farquhar
MG: Increased permeability
of the glomerular basement
membrane to ferritin after removal of glycosaminoglycans
(heparan sulfate) by enzyme digestion. J
Cell Biol (1980) 86, 688-693.
16) Kanwar YS: Biology of disease: Biophysiology of glomerular filtration and proteinuria.
Lab Invest
(1984) 51, 7-21.
17) Bohrer MP,
Baylis C, Humes HD, Glassock RJ, Robertson CR and Brenner BM: Facilitated
filtration of circulating polycations.
J Clin Invest (1978) 61, 72-78.
18) ハ イ パ フ ォ ー マ ン ス メ ン ブ レ ン研 究 会 ワー キ ン グ グルー プ:膜 の 性 能 評 価 法.腎 と透 析 別 冊 (1989) 167-175. 19) 村 上 瑛 一:糸 球 体 基 底 膜 を モ デ ル と し た透 析 膜 改 良 の 可 能 性.腎 と透 析 別 冊 (1988) 35-38.
322 長 宅 芳 男
