岡 山 医 誌(1995) 107, 131∼141
ア デ ノ シ ン関 連 物 質 に よる
外傷 性 て ん か ん 発 症 予 防 に関 す る研 究
岡山大 学 医学部 附属分 子 細 胞医学 研 究施 設神 経情 報学 部 門(指 導:森
昭 胤教 授)
当
真
純
二
(平成7年2月20日
受 稿)
Key words: adenosine, chloroadenosine, radical scavenger, post-traumatic epilepsy, experimental epilepsy
緒 言 頭 部 外 傷 後 に け い れ ん 発 作 が お こ る こ とが あ る こ とは 古 く ヒポ ク ラ テ ス の 頃 よ り知 られ て い る.こ の け い れ ん 発 作 は,受 傷 後1週 間 以 内 に 発 生 す る早 発 性 け い れ ん とそ れ 以 後 に 発 生 す る 晩 発 性 て ん か ん と に 大 別 さ れ て い る.一 般 に頭 部 外 傷 の 後 遺 症 と して 問 題 に な るの は 後 者 の 方 で は あ るが,早 発 性 け い れ ん を 経 験 し た 者 に は 高率 に 晩 発 性 て ん か ん が 発 症 す る こ とが 知 ら れ て い る.ま た,最 近 の 統 計 で は 全 頭 部 外 傷 症 例 の15%1)に,さ ら に 解 放 性 頭 部 外 傷 で は45%2)に 外 傷 性 て ん か ん が 発 症 す る と さ れ て い る.一 方, 外 傷 性 て ん か ん の 主 な発 症 原 因 は 脳 の 局 所 的 出 血 性 損 傷 で あ る こ とは 明 ら か で あ る が3),その 発 症 機 構 に は ま だ 不 明 な点 が 多 い. さ て, Willmoreら4-6)は 鉄 塩 を ラ ッ トや ネ コ の 大 脳 皮 質 の 脳 軟 膜 下 に 注 入 す る と,鉄 塩 投 与 30∼60分 後 の 脳 波 に は 投 与 側 よ り反 復 性 の て ん か ん 様 発 作 波 放 電 が 出 現 しは じめ,つ い に は 慢 性 反 復 性 の 発 作 放 電 焦 点 を形 成 す る こ と を見 い だ し た が,こ の 電 気 生 理 学 的 変 化 は て ん か ん 焦 点 に お い て観 察 され る変 化 に 類 似 す る7).ま た, 鉄 塩 投 与 に よ り形 成 され た発 作 焦 点 で は ゴル ジ 染 色 神 経 細 胞 の 減 少,星 状 神 経 膠 細 胞 の 異 常 増 殖,神 経 樹 状 突 起 の 棘 の 減 少,分 枝 数 及 び 腫 脹 部 の 減 少 が 認 め られ る な ど,外 傷 性 て ん か ん 患 者 の 焦 点 組 織 病 理 学 的 所 見 と極 め て 良 く一 致 す る8).この た め に 鉄 塩 を 投 与 した モ デ ルは 外 傷 性 て ん か ん の 良 い モ デ ル と考 え ら れ て い る.一 方, Rosenら9)はhemoglobin (Hb)を 大 脳 皮 質 内 に 注 入 して も鉄 塩 注 入 と 同 様 に て ん か ん 様 発 作 波 放 電 を 誘 発 で き る が,こ の た め に は数 日 を要 す る こ と を報 告 し た.近 年 こ れ ら の モ デ ル を使 用 して 外 傷 性 て ん か ん 焦 点 形 成 の メ カ ニ ズ ム の 研 究 を行 っ た 結 果, Hbあ る い はHbの 崩 壊 に よ り放 出 さ れ た 鉄 イ オ ン に よ っ て 形 成 さ れ る活 性 酸 素 種 が 神 経 細 胞 膜 の 脂 質 を過 酸 化 し て 神 経 機 能 障 害 を 起 こ す た め に 早 発 け い れ ん が 始 ま る こ とが 示 唆 され た10-16).こ の た め,発 生 し た 活 性 酸 素 種 を 消 去 す る こ とに よ り外 傷 性 て ん か ん の 発 症 は 予 防 さ れ 得 る こ と が 示 され た17). さ て, adenosine (Ado)は プ リン 塩 基 の 一 つ で あ るadenineとD-riboseが 結 合 し た ヌ ク レ オ シ ドで あ る が,細 胞 内 で 燐 酸 化 さ れ,高 エ ネ ル ギ ー 物 質 と し て エ ネ ル ギ ー 代 謝 に 関 わ っ て い る こ と は 衆 知 の こ と で あ る.ま た, Adoは 神 経 伝 達 物 質 あ る い は 神 経 調 節 因 子 と して も働 い て い る と考 え ら れ て い るが18),け い れ ん との 関 連 に お い て も内 在 性 抗 け い れ ん物 質 と し て働 くこ と が 指 摘 さ れ て い る19).一 方, Adoの 代 謝 産 物 で あ る 尿 酸 に は 活 性 酸 素 種 消 去 活 性 が あ る こ と が 知 ら れ て い る20). 本 研 究 で はAdoやguanosine (Guo)な ど の プ リ ン系 ヌク レ オ シ ドや, Ado誘 導 体 で あ る2 -chloroadenosine (Cl-Ado)の スー パ ー オ キ シ ドラ ジ カ ル(O2-)や ヒ ドロ キ シ ル ラ ジ カル(・OH) に 対 す る影 響 を ス ピ ン トラ ッ プ 法 を使 用 した 電 子 ス ピ ン 共 鳴(ESR)法21)を 用 い て 調 べ る こ と に よ り,こ れ ら の 物 質 の 活 性 酸 素 種 消 去 活 性 を 131
調 べ た.ま た, Ado及 びCl-Adoの 脳 波 や 循 環 器 系 に 対 す る影 響,鉄 塩 誘 発 脳 波 変 化 発 現 に 対 す る効 果 を調 べ る こ と に よ り, Adoや そ の 誘 導 体 を使 用 した 外 傷 性 て ん か ん 発 症 予 防 の 可 否 を検 討 し た. 材 料 と 方 法 1. 使 用 薬 物 Ado及 びGuoは 片 山 化 学 工 業 株 式 会 社(大 阪)
製 を, Cl-AdoはRBI Research Biochemicals
社(Natick, MA, USA)製 を, xanthine oxidase
(XOD,牛 乳 製)はBoehringer Ingelheim社
(Germany)製 を, hypoxanthine及 び
diethylenetriamine-pentaacetic acid
(DETAPAC)はSigma Chemical Co. (USA)
製 を, 5, 5-dimethyl-1-pyrroline-1-oxide (DMPO)は 第 一 化 学 薬 品 株 式 会 社(東 京)製 を使 用 し た.そ の 他 の 使 用 薬 物 は 高 純 度 品 を使 用 し た. 2. O2-消 去 活 性 及 び ・OH消 去 活 性 の 検 討 O2-消 去 活 性 の 測 定 に はhypoxanthine-XOD 系 を使 用 して 発 生 させ たO2-にDMPOと 被 検 薬 物 を5mMに な る よ う加 え, ESR分 析 装 置(JES -FE1 XG ,日 本 分光 工業 株 式会 社製)を 用 いて DMPO-OOHス ピ ン ア ダ ク トを分 析 す る こ とに よ り行 っ た.す な わ ち,試 験 管 に50μlのhypox anthine溶 液(2mM), 35μlのDETAPAC溶 液 (1mM), 15lのDMPO溶 液(89mM)及 び50 μlの 被 検 薬 物 溶 液(20mM)を 取 り, 50μlのXOD 溶 液(0.272unit/ml)を 加 え て攪 拌 後,反 応 液 を ESR装 置 用 セ ル に 移 し, XOD添 加50秒 後 に DMPO-OOHス ピ ン ア ダ ク トを 測 定 した.内 部 標 準 に はMnOを 使 用 した. ・OH消 去 活 性 の 測 定 に はFenton試 薬 に よ り 発 生 さ せ た ・OHにDMPOと 被 検 薬 物 を0.625 ∼5mMに な る よ う加 え , ESR分 析 装 置 を用 い てDMPO-OHス ピン ア ダ ク トを分 析 す るこ とに よ り行 った.す な わ ち,試 験 管 に75μlのH2O2 (1.03 mM), 20μlのDMPO溶 液(89mM)及 び50μlの 被 検 薬 物 溶 液(3.7∼29.5mM)を 取 り, 75μlの FeSO4溶 液(1mM)と75μlのDETAPAC溶 液 (1mM)を 加 え て 攪 拌 後,反 応 液 をESR装 置 用 セ ル に 移 し, FeSO4とDATAPAC添 加60秒 後 にDMPO-OHス ピ ン ア ダ ク ト を測 定 し た.シ グ ナ ル の 強 度 は4本 のDMPO-OHス ピ ン ア ダ ク ト の 第2番 目の ピー ク 高 に よ り測 定 した. ESR分 析 装 置 は 以 下 の 条 件 で 使 用 し た.マ イ ク ロ 波 強 度8mW,変 調 周 波 数100kHz,変 調 幅 0.1mT,時 定 数0.1s,ス キ ャ ン 時 間30s,磁 場 強 度335±5mT,増 幅 率630倍(DMPO-OOH測 定 時)及 び2500倍(DMPO-OH測 定 時). 3. Ado及 びCl-Adoの 鉄 塩 誘 発 脳 波 変 化 発 現 に 対 す る効 果 の 検 討 図1 ス ー パ ー オ キ シ ドラ ジ カ ル(O2-)に 対 す る guanosine (Guo), 2-chloroadenosine (Cl-Ado)及 びadenosine (Ado)の 影 響
O2消 去 活 性 の 測 定 に はhypoxanthine-xanthineoxidase (XOD)系 を 使 用 し て 発 生 さ せ たO2-にDMPOと 被 検 薬 物 を5mMに な る よ う加 え, XOD添 加50秒 後 にDMPO-OOH ス ピ ン ア ダ ク トを 測 定 した.各 々 の 薬 物(5 mM)を 加 え たESRス ペ ク トラ と 最 下 段 に 示 す 対 照 のESRス ペ ク トル との 間 に ピ ー ク 高 の 差 は 認 め ら れ な い. Ethylether麻 酔 下 で 気 管 内 挿 管 し た 体 重 250∼350gの 雄Sprague Dowley系 統 ラ ッ トを succinylcholineで 非 動 化 し人 工 呼 吸 下 に 実 験 を 行 っ た.ラ ッ トは 脳 定 位 固 定 装 置 に 固 定 し,ブ レ グ マ よ り前 方2mmで 左 右{則方2mm,及 び 後 方 4mmで 左 右 側 方3mmの4部 位 に 硬 膜 外 ビ ス 電 極 を 固 定 し脳 波 記 録 用 と し,さ ら に 背 側 頸 部 正 中 部 の 筋 肉 内 に 針 電 極 を刺 し て 不 関 電 極 と し た. 脳 波 記 録 に は 日本 光 電 社 製 脳 波 記 録 装 置(EEG -5200)を 使 用 し た .脳 波 は単 極 及 び双極 導 出法 で 記 録 し,そ れ ぞ れ,左 前 頭 部 電 極(LF)-左 後 頭 部 電 極(LO),右 前 頭 部 電 極(RF)-右 後 頭 部
電 極(RO), LF-RF, LO-RO, LF-不 関 電 極(E),
ア デ ノ シ ン 類 に よ る 外 傷 性 て ん か ん 発 症 予 防 133 グマ よ り左 方1mm,後 方1mmの 大 脳 皮 質 感 覚 運 動 野 上 の 頭 蓋 骨 に 穿 孔 し 大 脳 皮 質 内 へ のFeCl3 投 与 用 と し た.心 電 図 は 左 右 前 腕 に 刺 し た 針 電 極 を 使 用 し て 記 録 し,体 温 は 成 茂 科 学 器 械 研 究 所 製(東 京)ラ ッ ト用 体 温 保 温 機 で保 温 し た. FeCl3は100mMに, Adoは2mg/mlに,ま た Cl-Adoは400μg/mlに 生 理 食 塩 水 で 溶 解 した.ま た, Ado及 びCl-Adoの 対 照 と し て は5mg/kgの sucroseを1mlの 生 理 食 塩 水 で 溶 解 して 使 用 し た. 手 術2時 間 後 に 脳 波 を観 察 し な が らAdo (5 mg/kg)あ る い はCl-Ado (1∼2mg/kg)を 腹 腔 内 に 投 与 し, 30分 後 に 大 脳 皮 質 内 にFeCl3溶 液 を 1μl/minの 速 度 で5μl(鉄 イ オ ン 量: 500nmol) 注 入 し た.こ の 後,脳 波 変 化,心 電 図 波 形 の 変 化 及 び 心 拍 数 を4∼5時 間 に わ た り観 察 した. 図2 ヒ ド ロ キ シ ル ラ ジ カ ル(・OH)に 対 す る guanosine (Guo), 2-chloroadenosine
(Cl-Ado)及 びadenosine (Ado)の 影 響 ・OH消 去 活 性 の 測 定 に はFenton試 薬 に よ り 発 生 さ せ た ・OHにDMPOと 被 検 薬 物 を 5mM加 え, FeSO4とDETAPAC添 加60秒 後 にDMPO-OHス ピ ン ア ダ ク トを 測 定 し た. 最 終 濃 度5mMのAdoを 添 加 す る とESRス ペ ク トル の ピ ー ク高 は 約40%に, Cl-Adoの そ れ は 約70%に な っ た.
図3 Adenosine (Ado)及 び2-chloroadenosine (Cl-Ado)の ヒ ド ロ キ シ ル ラ ジ カ ル(・OH) 消 去 活 性 ・OH消 去 活 性 の 測 定 に はFenton試 薬 に よ り 発 生 さ せ た ・OHにDMPOと 被 検 薬 物 を 0.625∼5mMに な る よ う 加 え, FeSO4と DETAPAC添 加60秒 後 にDMPO-OHス ピ ン ア ダ ク ト を 測 定 し た.シ グ ナ ル の 強 度 は4本 のDMPO-OHス ピ ン ア ダ ク トの 第2番 目の ピ ー ク高 に よ り測 定 した . N=2∼3の 平 均 で 表 す. 縦 軸:抑 制 率 図4 ラ ッ ト心 臓 活 動 に 及 ぼ す2-chloroadenosine (Cl-Ado)の 効 果 心 電 図 は 第1導 出 法 で 記 録 し, 2mg/kgの Cl-Adoを 腹 腔 内 に 投 与 し た. Cl-Ado投 与 後 著 明 な 心 拍 数 低 下 とR波 の 増 高 が 認 め られ る. 図5 ラ ッ ト心 拍 数 に 及 ぼ す2-chloroadenosine (Cl-Ado)の 影 響 Cl-Adoを1mg/kg腹 腔 内 に 投 与 し た. 縦 軸:投 与 前 に 対 す る 心 拍 数 の 変 化 率 横 軸:分(N=6,平 均 ± 標 準 偏 差)
結 果 1. O2-に 対 す る影 響 の 検 討
O2-に 対 す るGuo, Cl-Ado及 びAdo(各 々 最 終
濃 度5mM)の 影 響 を 図1に 示 す.各 々 の 薬 物 を 加 え たESRス ペ ク トラ と最 下 段 に 示 す 対 照 の ESRス ペ ク トル と の 間 に ピ ー ク 高 の 差 は 認 め ら れ ず,こ れ らの 物 質 に はOZ消 去 活 性 は な い こ と が 明 ら か と な っ た. 2. ・OHに 対 す る 影 響 の 検 討 最 終 濃 度5mMのAdoを 添 加 す る とESRス ペ ク トル の ピ ー ク高 は 約40%に な っ た.ま た, Cl -Adoの 添 加 で も ピー ク高 は 約70%に 減 少 した . しか し, Guoを 加 え て も ピー ク 高 に 変 化 は 認 め られ な か っ た(図2).図3に 示 す ご と く, Ado は 用 量 依 存 的 に 強 い ・OH消 去 活 性 を示 した.ま たCl-Adoに も弱 い が ・OH消 去 活 性 が 認 め られ た.
(A)
(B)
図6 鉄 イ オ ン 誘 発 発 作 波 発 現 に 及 ぼ す2-chloroadenosine (Cl-Ado)の 抑 制 効 果 FeCl3は 生 理 食 塩 水 に100mMに 溶 解 し て そ の5μlを 大 脳 皮 質 感 覚 運 動 野 内(ブ レ グ マ よ り尾 側1mm,左 側1mm)に 投 与 し た.ま た, sucrose (5mg/kg)あ る い はCl-Ado (1mg/kg)はFeCl,投 与30分 前 に 腹 腔 内 に 投 与 した.A-1: sucrose投 与30分 後 の 脳 波. A-2: FeCl3を 投 与 し て15分 後 の 脳 波.投 与 側 で は 高 振 幅 徐 波 が 出 現 しLFに ス パ イ ク 活 動 が 認 め ら れ る. A-3: FeCl3を 投 与 し て91分 後 の 脳 波 に は 激 しい 発 作 波 が 認 め
ら れ る.
B-1: Cl-Ado投 与30分 後 の 脳 波. B-2: FeCl3を 投 与 して30分 後 の 脳 波. B-3: FeCl3を 投 与 し て 60分 後 の 脳 波. B-4: FeCl3を 投 与 し て90分 後 の 脳 波. Cl-Adoを 投 与 し て30分 後 にFeCl3を 投 与 し て も 発 作 波 は 誘 発 さ れ な い.
LF:左 前 頭 部 か ら の, LO:左 後 頭 部 か ら の, RF:右 前 頭 部 か ら の,そ し て, RO:右 後 頭 部 か ら の 単 極 誘 導. ECG:心 電 図.
ア デ ノ シ ン類 に よ る外 傷 性 て ん か ん 発 症 予 防 135 3. Ado及 びCl-Adoの 脳 波 及 び 循 環 系 に 及 ぼ す 影 響 Ado (5mg/kg)を 投 与 し た ラ ッ トの 脈 拍 数 に 明 らか な 変 化 は 認 め られ な く,脳 波 に も 変 化 は 認 め られ な か っ た.一 方, 2mg/kgのCl-Adoを 投 与 す る と,投 与 直 後 よ り心 拍 数 が 減 少 を 始 め, 10分 後 に は 約50%と な っ た.こ の 時-過 性 に 心 電 図 上R波 の 増 高 も認 め ら れ,脳 波 も速 波 が 減 少 し て 基 礎 波 は 徐 波 化 し た.心 拍 数 は30分 後 よ り し だ い に 増 加 し て90∼120分 後 に は 回 復 し (図4),心 拍 数 の 増 加 に 従 い 脳 波 変 化 も消 失 し た.ま た, 1mg/kgのCl-Adoを 投 与 し て も投 与 直 後 よ り心 拍 数 が 減 少 を始 め て15分 後 に は 約85 %と な っ た が,脳 波 活 動 に は 変 化 は 認 め ら れ な か っ た.心 拍 数 は30分 後 よ り しだ い に増 加 し, 75∼90分 後 に は 回 復 し た(図5). 4. Ado及 びCl-Adoの 鉄 塩 誘 発 脳 波 変 化 発 現 に 対 す る 影 響 の 検 討 Sucrose溶 液 を 腹 腔 内 に 投 与 して30分 後 に 大 脳 皮 質 内 にFeCl3を 注 入 す る と,注 入10∼60分 後 よ り投 与 側 に スパ イ ク活 動 が 出 現 し始 め, 30∼90 分 後 よ りは 両 側 の 大 脳 皮 質 か ら左 右 同期 した ポ リ スパ イ ク ス やpostictal depressionを 伴 っ た
ictal pattern (IP)な ど の 発 作 波 が5∼30分 間
隔 で繰 り返 し 出現 した(図6).注 入60分 後 に は 全 例 の ラ ッ ト脳 波 に ス パ イ ク 活 動 が 出 現 し (図7),ま た,注 入150分 後 に は ほ ぼ 全例(9匹 中8匹)の 脳 波 に ポ リス パ イ クス が 認 め ら れ た (図8).さ ら に, IPはFeCl3投 与90分 後 に は44% の, 120分 後 に は67%の, 150分 以 後 は78%の ラ ッ ト脳 波 に 認 め ら れ た(図9). 図7 FeCl3に よ り誘 発 さ れ る スパ イ ク活 動 の 累 積 出 現 率 の 経 時 変 化
Sucrose(対 照), adenosine (Ado)あ る い は2-chloroadenOsine (Cl-Ado)を 腹 腔 内 に 投 与 し, 30分 後 に 大 脳 皮 質 内 にFeCl3溶 液 を 注 入 し た.縦 軸:累 積 出 現 率,横 軸: FeCl,注 入 後 の 経 過 時 間. ○; sucrose (5mg/kg, N=9), ●; Ado (5mg/Kg, N=7),及 び ◆; Cl-Ado (1mg/kg, N=6) 図8 FeCl3に よ り誘 発 さ れ る ポ リ ス パ イ クス の 累 積 出 現 率 の 経 時 変 化
Sucrose(対 照), adenosine (Ado)あ る い は2-chloroadenOsine (Cl-Ado)を 腹 腔 内 に 投 与 し, 30分 後 に 大 脳 皮 質 内 にFeCl3溶 液 を 注 入 した.縦 軸:累 積 出 現 率,横 軸: FeCl3注 入 後 の 経 過 時 間. ○; sucrose (5mg/kg), ●; Ado (5mg/kg),及 び ◆; Cl-Ado (1mg/kg)
図9 FeCl3に よ り誘 発 さ れ るictal patternの 累 積 出 現 率 の 経 時 変 化
Sucrose(対 照), adenosine (Ado)あ る い は2-chloroadenosine (Cl-Ado)を 腹 腔 内 に 投 与 し, 30分 後 に 大 脳 皮 質 内 にFeCl3溶 液 を 注 入 し た.縦 軸:累 積 出 現 率,横 軸: FeCl3注 入 後 の 経 過 時 間. ○; sucrose (5mg/kg), ●; Ado (5mg/kg),及 び ◆; Cl-Ado (1mg/kg) Ado投 与 後 にFeCl3を 注 入 す る と,ス パ イ ク活 動 の 出 現 や そ の 全 般 化 は 遅 れ,ポ リ スパ イ ク ス やIPは 約 半 数 に現 れ た だけ であ っ た(図7∼9). Cl-Ado 1mg/kgを 腹 腔 内 に 投 与 し て30分 後 に FeCl3を 投 与 す る と,ス パ イ ク活 動 の 出 現 や そ の 全 般 化 の 遅 れ はAdoよ り も さ ら に 著 し く,ポ リ ス パ イ ク スやIPは6例 中1例 に 現 れ た だ け で あ っ た(図7∼9).ま た, Cl-Ado投 与 の2例 で は5時 間 の 間 スパ イ ク活 動 は 認 め られ ず, 1例
で は ス パ イ ク が 出 現 し た の は3時 間 半 後 で あ っ た.図6に 対 照 群 ラ ッ ト及 びCl-Ado投 与 群 ラ ッ トか ら 記 録 し た 代 表 的 脳 波 変 化 を 示 す. 考 察 Adoは 細 胞 内 で 燐 酸 化 さ れ た 高 エ ネ ル ギー 物 質 と し て エ ネ ル ギ ー 代 謝 に 関 わ っ て い る こ と は 周 知 の こ とで あ る.一 方, Adoは 中 枢 神 経 系 や 末 梢 神 経 系 で 神 経 伝 達 物 質,あ る い は 神 経 伝 達 の セ カ ン ドメ ッ セ ン ジ ャ ー と して の 役 割 も担 っ て い る18).中 枢 神 経 系 で はAdo作 動 性 神 経 系 は 抑 制 系 と し て働 き22), Ado作 動 神 経 系 とけ い れ ん との 関 係 が 注 目 を 集 め て い る. Ado拮 抗 物 質 のcaffeineやtheophyllineは け い れ ん を 誘 発 す る23).一 方, Adoは 聴 源 性 け い れ ん 発 作24), kainateやpicrotoxinに よ り誘 発 さ れ た け い れ ん 発 作25)を抑 制 す る作 用 を持 つ こ とが 報 告 され て い る.ま た,キ ン ド リ ン グ 実 験 て ん か ん モ デ ル に お い て もAdoア ゴ ニ ス トが 発 作 を抑 制 す るこ とが 知 ら れ て い る26,27).さら に,三 環 系 の 抗 て ん か ん 薬 で あ るcarbamazepineはAdo結 合 部 位 でAdoの ア ゴニ ス トと して働 くこ とが 示 唆 され28), Adoは 内 在 性 の 抗 け い れ ん 物 質 と も見 な さ れ て い る19). 本 研 究 で 検 討 した 物 質 に はO2-の 消 去 活 性 は ま っ た く認 め られ なか ったが, AdoやCl-Adoは ・OH 消 去 活 性 を持 つ こ とが 明 ら か と な っ た. Adoや Cl-Adoは プ リ ン環 の2-3位 間, 4-5位 間, 1-6位 間 及 び7-8位 間 に二 重 結 合 を持 ち, Guo は2-3位 間, 4-5位 間 及 び7-8位 間 に 二 重 結
合 を持 つ.こ の た めAdo及 びCl-Adoの ・OH消
去 活 性 はAdoやCl-Adoは 持 つ がGuoは 持 た な い プ リン環 の1-6位 間 の二 重 結 合 部 位 へ の 付 加 反 応 に あ る こ と が 示 唆 さ れ た.一 方, 2位 の 水 素 原 子 が 塩 素 原 子 に 置 換 し たCl-Adoの ・OH消 去 活 性 はAdoよ り弱 か っ た.こ れ は2位 に 分 子 半 径 の 大 き な塩 素 イ オ ン が 結 合 す る こ と に よ り 1位 の 窒 素 イ オ ン の 電 子 配 位 が 変 化 し た た め に, ・OH消 去 活 性 部 位 で あ る1-6位 間 の 二 重 結 合 に 影 響 が 及 ん だ た め と思 わ れ る. 心 臓 に 対 しAdoは 冠 血 流 量 を増 加 す る と と も に,負 の 変 伝 導,変 力 作 用 を持 つ こ とが 報 告 さ れ29,30),その 誘 導 体 は 狭 心 症 な どの 治 療 薬 と して 使 用 され て い る.ま た, Adoや そ の 誘 導 体 は 洞 房 結 節 で の イ ン パ ル ス 発 生 を抑 制 し た り,房 室 結 節 で の イ ン パ ル ス の 伝 導 を 阻 止 す る こ と に よ り心 拍 数 を 減 少 させ る こ と も報 告 さ れ て い る29). 本 研 究 で は2mg/kgのCl-Adoに よ り心 拍 数 が 約 50%に 低 下 す る と脳 波 活 動 は 抑 制 され て 基 礎 波 は徐 波 化 し た が, 1mg/kgのCl-Ado投 与 で は 心 拍 数 は85%に 低 下 し た も の の 脳 波 活 動 に 影 響 は 認 め られ な か っ た. Barracoら31)は 中 枢 神 経 系 に 対 す るAdoや そ の 誘 導 体 の 影 響 は 血 圧 の低 下 あ る い は 脳 血 流 量 の 低 下 に よ る 二 次 的 影 響 も含 ま れ て い る と警 告 して い る.本 研 究 で2mg/kgの Cl-Ado投 与 に よ り脳 波 活 動 が 抑 制 さ れ た の は こ の た め も あ る と 思 わ れ る.一 方,血 圧 を 低 下 さ せ る た め に は 中 枢 神 経 系 に 影 響 を 与 え る 量 よ り さ ら に 大 量 のAdoや そ の 誘 導 体 を使 用 しな け れ ば な ら な い こ と も報 告 され て い る32).この た め 鉄 塩 誘 発 脳 波 変 化 発 現 に 対 す る効 果 の 検 討 に は1 mg/kgのCl-Adoを 腹 腔 内 に 投 与 し て検 討 した. さ て,神 経 化 学 の 発 展 に と も な い 外 傷 性 て ん か ん の 成 因 に つ い て の 研 究 が 進 み,外 傷 性 て ん か ん の 焦 点 形 成 に 活 性 酸 素 種 が 関 与 して い る こ とが 明 ら か とな っ た10-16).す な わ ち,頭 部 外 傷 の 際 に 脳 内 に 出 血 し た赤 血 球 よ り遊 離 したHb, あ る いはHb中 に含 まれ る 鉄 イ オンは 脳 内 のH2O2 な ど と反 応 して,・OHやO2-な どの 活 性 酸 素 種 や ア ル キ ル ラ ジ カ ル な ど の フ リー ラ ジ カ ル を発 生 させ る10,33,34).神経 細 胞 な どの 細 胞 膜 を構 成 す る 不 飽 和 脂 質 は 発 生 し た 活 性 酸 素 ラ ジ カ ル に よ り 過 酸 化 を受 け る35,36).特に ・OHの 作 用 は 強 く, 不 飽 和 脂 質(Lipid-H)の 水 素 原 子(H)を 引 き 抜 き脂 質 ラ ジ カ ル(Lipid・)を 生 成 す るが,酸 素 の豊 富 な 環 境 で はLipid・ はO2-と 反 応 して 過 酸 化 脂 質 ラ ジ カ ル(Lipid-OO・)と な る.次 にLipid -OO・ は 他 分 子 のLipid-Hか らHを 引 き 抜 き Lipid・ と し,自 身 は 非 ラ ジ カ ル の 脂 質 ヒ ド ロペ ル オ キ シ ド(Lipid-OOH)と な る.こ れ ら の 反 応 は 連 鎖 反 応 で あ る た め に 細 胞 膜 に 重 篤 な傷 害 を 与 え る14,37).神経 細 胞 は 不 飽 和 脂 質 を豊 富 に 含 有 し て い る た め 強 く傷 害 さ れ 易 い.こ の た め, 神 経 細 胞 内 外 の イ オ ン環 境 を保 つ と と もに 活 動 後 に 細 胞 膜 電 位 を修 復 す る た め に 必 要 なNa+, K+-ATPase活 性 が 低 下 し38),神経 細 胞 は 脱 分 極
ア デ ノ シ ン 類 に よ る外 傷 性 て ん か ん 発 症 予 防 137 を起 こ して け い れ ん 閾 値 は 低 下 す る.ま た,神 経 伝 達 物 質 の 含 量 や 放 出 量 に も 異 常 を き た し39-42),興 奮 性 神 経 伝 達 物 質 で あ るaspartic acidの 放 出 量 は 増 加 し て 興 奮 性 は 高 ま り,抑 制 性 神 経 伝 達 物 質 で あ る γ-aminobutyric acidの 放 出 量 は 低 下 して 抑 制 機 能 は 低 下 す る.さ らに, creatinineが ・OHに よ り酸 化 分 解 され て 生 成 さ れ る43)内在 性 け い れ ん 誘 発 物 質 のmethyl guanidine44,45)も 早 期 よ り脳 内 で 増 加 す る46).こ れ らの た め に 神 経 細 胞 の 正 常 活 動 は 妨 げ ら れ て 早 発 性 け い れ ん が 発 現 し,外 傷 性 て ん か ん 焦 点 が 形 成 され る もの と考 え ら れ て い る.外 傷 性 て ん か ん の 発 現 機 構 を上 記 の よ うに 捉 え る と抗 酸 化 剤 を 使 用 し て 外 傷 性 て ん か ん の 発 現 を阻 止 し よ う とい う試 み は 当 を得 た も の と い え, α-toco pherol, (-)-epigallocatechin, L-ascorbic acid 2-[3, 4-dihydro-2, 5, 7, 8-tetramethyl
-2 (4, 8, 12-trimethyltridecyl)-2H-1-ben-zopyran-6-ylhydrogenphosphate] potassium salt (EPC)な どの 活 性 酸 素 消 去 剤 を使 用 し た 研 究 も報 告 さ れ て い る17,47-55).し か し,上 記 の 物 質 は活 性 酸 素 種 の 消 去 活 性 は 強 い もの の 抗 け い れ ん 作 用 は持 っ て い な い.こ の た め 本 研 究 で は ・ OH消 去 活 性 を持 つ と共 に け いれ ん の 伝 播 抑 制 効 果 を持 つ19)Ado及 びCl-Adoの 鉄 塩 誘 発 け いれん に 対 す る効 果 を検 討 し た. 本 研 究 で は, Cl-Adoを 投 与 し た 後 に500nmol のFeCl3溶 液 を大 脳 皮 質 感 覚 運 動 野 内 に 投 与 す る と, FeCl3が 誘 発 す る発 作 波 の 出 現 が 強 く抑 制 さ れ る こ と,ま た, Adoに もCl-Adoと 同 様 の 作 用 の あ る こ と を 見 い だ し た.し か し,そ の 抑 制 効 果 は ・OH消 去 化 活 性 の 低 いCl-Adoの 方 が 強 か っ た.外 傷 性 て ん か ん モ デ ル 脳 内 で は ・OHば か りで な くO2-な ど の 多 種 の 活 性 酸 素 種 も発 生 し て い る と報 告 さ れ て い る10-12).本 研 究 で 使 用 し たAdoやCl-Adoに はO2-の 消 去 活 性 は 認 め られ なか っ た が 鉄 イ オ ン 注 入 に よ り誘 発 さ れ る脳 波 変 化 は 抑 制 し た. AdoやCl-Adoと 同 様 に ・OH の 消 去 活 性 は 持 つ がO2-の 消 去 活 性 は 持 た な い EPC56)も 外 傷 性 て ん か ん モ デ ル の 脳 波 変 化 発 現 を抑 制 す る こ とが 報 告 され て い る53,54).この た め, 鉄 イ オ ン 誘 発 性 脳 波 変 化 を抑 制 す る た め に は 細 胞 膜 傷 害 性 の よ り強 い ・OHを 消 去 す る こ とが 重 要 で あ る こ とが 示 唆 さ れ た.一 方,鉄 イ オ ン 誘 発 性 脳 波 変 化 発 現 の 抑 制 作 用 は ・OH消 去 活 性 の 弱 いCl-Adoの 方 が 強 か っ た.こ れ はCl-Ado がAdoよ り代 謝 を受 け に くい こ と,あ る い は 抗 け い れ ん 活 性 が 強 い こ とに よ るの か も しれ な い. 本 研 究 の 結 果 は, AdoやCl-Adoが 速 や か に 脳 内 に 移 行 して 鉄 イ オ ン に よ り発 生 す る ・OHを 消 去 す る と と も に,抗 け い れ ん 薬 と して も働 くこ とに よ り鉄 イ オ ン の 誘 発 す る脳 波 変 化(早 発 性 け い れ ん)を 予 防 して い る こ と を示 唆 す る.始 め に も述 べ た よ う に 早 発 性 け い れ ん を経 験 し た 者 に は 高 率 に 晩 発 性 て ん か ん(外 傷 性 て ん か ん) が 発 症 す る こ とが 知 ら れ て い る.こ の た め, Ado あ る い はCl-Adoに よ り早 発 性 け いれ ん の 発 生 を 抑 制 す る こ と に よ り外 傷 性 て ん か ん が 予 防 さ れ え る こ とが 示 唆 さ れ た. 結 論
1. Ado, Cl-Ado及 びGuoはO2-に は 影 響 を
与 え な か っ た.一 方, Ado及 びCl-Adoは ・OH
を 用 量 依 存 的 に 消 去 し た.し か し, Guoに は ・OH 消 去 活 性 は 認 め ら れ な か っ た. 2. 腹 腔 内 に 投 与 し た5mg/kgのAdoは 心 拍 数 に も脳 波 活 動 に も影 響 は 与 え な か っ た.一 方, 腹 腔 内 に 投 与 した2mg/kgのCl-Adoは 心 拍 数 を 強 く抑 制 し,脳 波 活 動 も抑 制 し た.し か し, 1 mg/kgのCl-Adoは 心 拍 数 を約1時 間 に 渡 り最 大 15%抑 制 し た が,脳 波 活 動 に 変 化 は 認 め られ な か っ た. 3. ラ ッ トの 大 脳 皮 質 内 にFeCl3溶 液(100 mM, 5μl)を 注 入 す る と発 作 波 が 誘 発 さ れ た. 4. Adoを5mg/kg腹 腔 内 に 投 与 し て30分 後 にFeCl3を 注 入 す る と,発 作 波 の 出 現 や そ の 全 般 化 が 遅 れ た.ま た, Cl-Adoを1mg/kgを 腹 腔 内 に 投 与 して30分 後 にFeCl3を 注 入 す る と,発 作 波 の 出現 や そ の 全 般 化 の 遅 れ はAdoよ りも さ らに 著 しか っ た. 5. 本 研 究 の 結 果,脳 内 に 注 入 した 鉄 イ オ ン に よ り発 生 す る ・OHをAdoやCl-Adoに よ り消 去 す る とて ん か ん 焦 点 が 形 成 さ れ な い こ とが 明 らか と な っ た. 最 後 に,本 研 究 に 対 し終 始 御 懇切 な御 指 導 と御 校
閲 を賜 りま した 森 昭 胤教 授,ま た直接 御 指導 い ただ き ま し た横 井 功 助 手 と加 太 英 明 文 部 技 官,さ らに ESR測 定 を御 指 導 下 さい ま した劉 健 康 院 生,そ の 他 実験 の 遂 行 に 御協 力 くだ さ い ま した研 究 室 の 皆様 に 心 よ り御 礼 申 し上 げ ます. 文 献
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ア デ ノ シ ン 類 に よ る外 傷 性 て ん か ん 発 症 予 防 141
Adenosines
as preventive
preparations
of post-traumatic
epilepsy
Junji TOMA
Department of Neuroscience, Institute of Molecular and Cellular Medicine,
Okayama University Medical School,
Okayama 700, Japan
(Director:
Prof. A. Mori)
As oxidation of neural membranes by reactive oxygen species (ROS), especially hydroxyl radicals (・OH), is involved in the biochemical pathogenesis of post-traumatic epilepsy, post
traumatic epilepsy is thought to be prevented by treatment with ROS scavengers. In the present study, Ⅰ first examined the effects of adenosine (Ado), 2-chloroadenosine (Cl-Ado) and guanosine on ・OH and superoxide anion (O2-), generated by the Fenton reagent and the
hypoxanthine-xanthine oxidase system, respectively, using electron spin resonance spectrometry. Ⅰ also examined the effects of Ado and Cl-Ado on the occurrence of epileptic discharges on the electrocorticogram (ECoG) induced by FeCl3 injection (500nmol) into the sensorimotor cortex of rats, i.e., a model of an experimental post-traumatic epilepsy.
Although O2- was not scavenged, ・OH were scavenged by Ado and Cl-Adodose-dependently.
The scavenging activity of Ado was 4times stronger than that of Cl-Ado. On the ECoG of rats given FeCl3, sporadic spike discharges, polyspikes and/or ictal patterns started to be observed
15-90min after the injection. Epileptic discharges did not appear or their occurrence was delayed by the intraperitoneal injection of Ado (5mg/kg) or Cl-Ado (1mg/kg) 30min prior to the FeCl3 injection, although Cl-Ado showed a chronotropic action. Thus Ado and Cl-Ado may be useful in the prevention and the attenuation of progression of post-traumatic epilepsy by scavenging ・OH and by their anticonvulsant effect.
