doi : 10.3136/nskkk.63.78 http://www.jsfst.or.jp
技術論文
柿果実由来乳酸菌を用いた柿シロップ乳酸発酵飲料の開発
上田京子
1*，樋口智子
1，平野吉男
1，塚谷忠之
1，末永 光
1，齋藤浩之
1，横溝雅和
2 1福岡県工業技術センター 生物食品研究所 2プレットサンフーズ株式会社Development of a FermentedPersimmon Syrup Beverage
Using Lactic AcidBacteria Isolatedfrom Persimmon Fruit
Kyoko Ueda1*, Tomoko Higuchi1, Yoshio Hirano1, Tadayuki Tsukatani1,
Hikaru Suenaga1, Hiroyuki Saitoh1andMasakazu Yokomizo2 1Biotechnology andFoodResearch Institute Fukuoka Industrial Technology Center,
1465-5 Aikawa, Kurume, Fukuoka 839-0861
2PretosunfoodCo., 1961-5 Araki, Arakimachi, Kurume, Fukuoka 830-0063
We report here on the development of a fermented lactic acid beverage using syrup made from non-standard persimmons (Diospyros kaki Fuyu). BFRI 380-7, which was isolatedfrom persimmons, was selectedfrom growth assay results in persimmon syrup medium. BFRI 380-7 was identified as Lactobacillus plantarum. Furthermore, lactic acidbacteria (LAB) strains (including BFRI 380-7) that were capable of fermenting persimmon syrup exhibitedtannase (tannin acylhydrolase) activity. BFRI 380-7 was optimally culturedat a temperature of 30℃ and4 to 6 days incubation time, andlactic acidproduction was the highest at a syrup concentration of Brix 30. Fermented persimmon syrup (30℃, 5 days) contained1.1 % lactic acidandLAB at 4.8×108CFU/ml. We successfully produced trial products of the fermentedlactic acidbeverage using BFRI 380-7 from persimmon syrup without milk
components. （ReceivedJun. 30, 2015 ; AcceptedOct. 6, 2015）
Keywords : lactic acidbacteria, persimmon syrup, lactic acidfermentation, tannase キーワード : 乳酸菌，柿シロップ，乳酸発酵，タンナーゼ 農林水産省が実施している作物統計調査ⅰ）によると，福 岡県は全国第 2 位のカキ生産県であり，出荷量は 13 900 t である．品種は，富有柿（甘柿）が中心で，主な産地は， うきは市，朝倉市，久留米市など筑後川流域沿いである． これらの地域では，形が規格から外れている柿や賞味期限 が短い過熟柿であるために，流通出荷されない規格外の柿 が約 6 000 t/年排出されている．これら規格外柿の有効利 用方法として，柿生産地では，柿酢を製造する取り組みが 行われている1）2）．柿酢以外の新たな取り組みとして，著者 らは，規格外富有柿を粉砕後，減圧濃縮し，柿シロップや 柿ピューレに加工することで，長期保存可能な食品加工用 原料の製造技術を開発している3）． 他方で，規格外品や副産物の付加価値を高めるための乳 酸発酵技術が開発されている．河村らは，柿果実から分離 した乳酸菌で発酵したニンジン発酵液を使用し，長崎県の 特産品として，人参ジュースを開発している4）．また，広瀬 らは，沖縄県産のサトウキビ搾汁液原料の乳酸発酵飲料を 開発し，γ アミノ酪酸（GABA）は約 8 mg/100 ml まで乳酸 発酵により増強され，さらに DPPH ラジカル消去活性は 84 µmol-TE/100 ml であることを明らかにしている5）．ま た，富有柿に関する研究では，Lactobacillus plantarum（イ チジク分離源）を用いて，柿ペーストを原料にセルラーゼ 処理および乳酸発酵した結果，DPPH ラジカル消去活性が 51.5 mol-TE/100 g（加工前の約 5.6 倍）であったことが報 告されている6）7）．これらと比較して，著者らが開発した柿 シロップ（Brix 60）は，サトウキビ乳酸発酵飲料の約 2 倍 の GABA を含有し，さらに柿ペースト発酵液の約 10 倍の DPPH ラジカル消去活性を示した3）．DPPH ラジカル消去 活性について，柿ペースト発酵液より柿シロップが高い値 を示したのは，柿原料を真空減圧濃縮ニーダーで Brix 60 まで濃縮しているためであると考えられる． 一方，乳および乳製品の成分規格等に関する省令（昭和 26 年 12 月 17 日厚生省令第 52 号）により，乳酸菌飲料は 乳成分を含むと成分規格に定められている．現在の乳酸菌 1〒839-0861 福岡県久留米市合川町 1465-5，2〒830-0063 福岡県久留米市荒木町荒木 1961-5 *連絡先（Corresponding author），[email protected]
飲料の市場動向をみると，乳アレルギーや乳糖不耐症の 人々による乳酸菌を摂食したいというニーズが高く，乳由 来成分を含有しない商品が求められている．しかし現在市 販されている乳酸菌入りの乳成分 0 % 商品は「野菜の戦士」 （大塚チルド食品（株））のみである8）ⅱ）． そこで，本研究では，柿シロップのみを原料とし，柿シ ロップの原料である富有柿果実から新たに分離した乳酸菌 を用いて，柿シロップ乳酸菌飲料の開発に取り組んだので 報告する． 実 験 方 法 1． 試料および乳酸菌 （1）柿シロップ 平成 24 年度に福岡県久留米市田主丸地域で収穫された 規格外柿（富有柿）を原料に，前報3）の方法により製造され た柿シロップ（Brix 60）を（株）元山から入手し，使用時ま で−20℃で保存した．シロップは適宜試験時の濃度に滅菌 水で無菌的に希釈して使用した． （2）乳酸菌 使用した乳酸菌を表 1 に記載する．分譲株および分離株 は，試験時は実験方法で特に記載していない限り，MRS 培 地で 30℃，16 時間培養後，菌体を滅菌生理食塩水で 2 回洗 浄し，滅菌生理食塩水に同菌体濃度に再縣濁後，発酵試験 に供した．なお，乳酸発酵は静置で行った． 2． 成分分析 （1）糖度測定 手持屈折率計（（株）アタゴ）を用いて測定した． （2）分析用試料調製方法 試料を遠心分離（2 330×g，10 分）後，上清を蒸留水で 10 倍希釈し，0.45 µm のフィルター（アドバンテック東洋 （株））で除粒したものを分析用試料とし，糖および有機酸 の分析に供した． （3）糖定量 分析用試料を液体クロマトグラフ（日本ウォーターズ （株））にて分析した．測定条件は以下の通り． ・カラム：Cosmosil Sugar D 4.6 mm×250 mm（ナカラ イテスク（株）） ・移動相：70 % アセトニトリル ・流速 ：1.0 ml/min ・検出器：waters 410（示差屈折） ・装置 ：waters 510 （4）有機酸定量 分析用試料を，有機酸分析システム LC10 A（（株）島津製 作所）を用いて，分析を行った． （5）遊離アミノ酸定量 試料を遠心分離（2 330×g，10 分）後，上清を回収した． 次に上清をクエン酸リチウム緩衝液（pH 2.98）で 10 倍希 釈し，0.45 µm のフィルターで除粒し，アミノ酸分析装置 + キャベツの漬物
Lactobacillus plantarum subsp. plantarum
タンナーゼ活性b） 分離源 属・種 + ビール汚染物質 Lactobacillus paraplantarum 表 1 使用した菌株 Pediococcus pentosaceus サイレージ Lactobacillus dextrinicus サイレージ Lactobacillus brevis + コーンサイレージ Lactobacillus pentosus 発酵オリーブ Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides
乾燥アメリカビール酵母 Lactobacillus parabuchneri
a）ATCC, American Type Culture Collection；NBRC, NITE Biological Resource Center；JCM, Japan Collection of Microorganis； T，標準株．
*福岡県工業技術センター 生物食品研究所分離株
b）大澤ら（2000）18）
Lactococcus lactis subsp. lactis
ラガービール酵母 Pediococcus damnosus Lactobacillus rhamnosus ヒトだ液 − セリビアのオリーブ Lactobacillus brevis トマト果肉 Lactobacillus buchneri Pediococcus parvulus ビール酵母 Pediococcus inopinatus ワイン Lactobacillus hilgardii − チーズ Lactobacillus casei 柿果実 Lactobacillus plantarum 生乳 Lactococcus lactis subsp. cremoris
Pediococcus acidilactici サイレージ 菌株a） JCM 8797T JCM 5890T JCM 5889T JCM 5886T JCM 12518T JCM 5887T JCM 1155T NBRC 3425T NBRC 15883T NBRC 12005 NBRC 3345 JCM 12493T JCM 1115T NBRC 106467T NBRC 107151T ATCC 14917T BFRI 380-7* NBRC 100496T NBRC 100676T JCM 5805T
（日本電子（株）JLC/V2）で生体アミノ酸分析用条件を用い て分析した． （6）ビタミン C 定量 既報9）に準じて，試料を遠心分離（2 330×g，10 分）後， 上清 5 ml をメスフラスコに採取し，5 % メタリン酸溶液で 20 mL に定容し，液体クロマトグラフを用いて，分析した． （7）総ポリフェノール定量 既報9）に準じて，試料を遠心分離（2 330×g，10 分）後， 上清 20 ml を終濃度 80 % となるようにエタノールを加え， 15 分間加熱還流し，フォーリン・チオカルト法により分析 した． （8）DPPH ラジカル消去活性測定 既報10）に準じて，試料を遠心分離（2 330×g，10 分）後， 上清 20 ml に終濃度 80 % となるようにエタノールを加え た．この前処理試料を試験に供し，DPPH ラジカル消去活 性を Trolox 相当量として測定した． 3． 乳酸菌数の測定11） 発酵液を適宜希釈し，MRS 白亜寒天培地（シクロヘキシ ミド 50 ppm，アジ化ナトリウム 10 ppm 含有）または BCP 加プレートカウント寒天培地（日水製薬（株））で混釈平板 培養し，30℃，48 時間培養後，コロニー数を測定した． 4． 柿シロップ発酵用乳酸菌株の単離および生育試験 （1）柿由来乳酸菌株の単離11） 平成 22 年 11 月中旬に福岡県久留米市田主丸町で収穫し た過熟果 3 個を MRS 培地（シクロヘキシミド 50 ppm，ア ジ化ナトリウム 10 ppm 含有）に個別に浸漬し，30℃，1 週 間，集積培養を行った．それぞれの集積培養液（A，B，C） を MRS 白亜寒天培地で 30℃，48 時間，嫌気培養（アネロ パック，三菱ガス化学（株））し，クリアゾーン形成コロ ニー（酸生産菌）を 10 株ずつ単離した． （2）柿シロップ（Brix 30）生育試験 柿果実より単離した菌株の前培養液（30℃，16 時間，MRS 培地）を生理食塩水（0.85 %）で 10 倍に希釈後，分光光度 計を用いて濁度（OD600）を測定した．その後，各前培養液 を OD600=0.4 になるよう滅菌生理食塩水で希釈した． 平底マイクロプレート（96 穴）にフィルター除菌した柿 シロップ（Brix 30）を 100 µl ずつ分注し，事前調整した菌 液を 5 µl ずつ各ウェルに植菌した．対照区には生理食塩 水を用いた．30℃，5 日間嫌気培養し，マイクロプレート リーダーを用いて経時的に濁度を測定した． 5． 柿果実由来乳酸菌の同定 （1）細胞の形態観察およびカタラーゼ試験 乳酸菌の形態観察はグラム染色および検鏡によった．ま た，カタラーゼ活性の有無を確認した12）． （2）乳酸光学活性 乳酸光学活性を F-kit（ロシュ・ダイアグノスティクス （株））で測定した． （3）糖資化性試験 糖資化性を API50CHL（シスメックス・ビオメリュー （株））で判定した． （4）遺伝子配列の決定および解析 微生物の分類・同定実験法13）に準じて実験を行った．菌
株を MRS 培地 5 ml で 30℃，16 時間培養し，Blood & Cell Culture DNA Mini kit（（株）キアゲン）を用いて DNA を抽 出，精製した．菌株の溶菌時には，リゾチーム，アクロモ ペプチダーゼおよび ProteinaseK を用いた．16 S rRNA 遺 伝 子 お よ び recA 遺 伝 子 の PCR に は PremixTaq（EX Taq version）（タカラバイオ（株））および TaKaRa PCR Thermal Cycler MP TP3000（タカラバイオ（株））を用い た．16 S rRNA 遺伝子の PCR にはプライマー 27f（5!-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3!）および 1492r（5!-GGCTACCTTGTTACGACTT-3!）13）を 用 い，94℃，2 分 −（94℃，1 分-50℃，1 分-72℃，1.5 分）×30 サイクル− 72℃，3 分）の条件で行った．recA 遺伝子の PCR には recA 90F（5!-TAYGGVCCNGAAAGTTCDGG-3!），recA 500R（5!-CATVACVCCVACTTTYTCACG-3!）14）を用い， 94℃，2 分-−（94℃，20 秒-55℃，30 秒-72℃，20 秒）×30 サ イ ク ル − 72℃，3 分）の 条 件 で 行 っ た．PCR 産 物 は QIAGEN PCR Purification Kit（（株）キアゲン）により精製 した．2 種の PCR 産物を鋳型として BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（ライフテクノロジーズジャパン （株））によりシーケンス反応を行い，ABI PRISM 310 Genetic Analyzer（ライフテクノロジーズジャパン（株））で 塩基配列を決定した． 決定した 16 S rRNA 遺伝子配列は，DDBJ BLASTⅲ）を 用いて相同性検索を行った．さらに，recA 配列について， 近縁菌株の recA 遺伝子の一部配列 AJ286119（Lactobacil-lus plantarum ATCC 14917T），AJ286120（L. paraplantarum
LMG 16673T）および AJ286118（L. pentosus LMG 10755T） に対して，DDBJ Clustal Wⅲ） による系統解析を行い，Tree-view（ver 1.6.6）を用いて，近接結合法（NJ 法）に従い， 系統樹を作成した． 6． 乳酸菌分譲株・分離株の柿シロップ発酵試験 表 1 の乳酸菌を 5 ml の柿シロップ Brix 30 に菌液を 5 µl 植菌し，30℃，4 日間発酵後，有機酸の生産量を測定した． また，年齢 30∼40 代の 3 名で香りについて嗜好的に評価 した． 7． 乳酸菌のタンナーゼ活性測定 既報15）に従い，タンニン酸処理 MRS 寒天培地を作成し た．表面に表 1 の乳酸菌を画線し，クリアゾーンを形成し た菌株をタンナーゼ活性陽性と判定した． 8． 乳酸発酵前後の成分変化の検討 乳酸菌 BFRI 380-7 を用いて，発酵試験を行った．100 ml の柿シロップ Brix 30 に，菌液を 100 µl 植菌し，30℃で 4 日間発酵した．遠心分離を行い，上清を回収した．上清 について，遊離アミノ酸，有機酸，ビタミン C，総ポリフェ
ノールおよび DPPH ラジカル消去活性測定を行った． 実 験 結 果 1． 柿由来乳酸菌株の単離および選定 柿果実 3 個を集積培養した培養液（A，B，C）から MRS 白亜寒天培地上でクリアゾーンを形成したコロニーをそれ ぞれ 10 株，合計 30 株を単離した．分離した 30 株につい て，柿シロップ（Brix 30）で生育試験を実施した．その結 果，集積培養液 C から分離した 10 株は生育しなかった． 生育した 20 株（A，B）のうち，特に生育が良かったのは集 積培養液 A から分離した 10 株であった（図 1）． 顕微鏡観察の結果，集積培養液 A から分離した 10 株は， すべて桿菌であり，グラム陽性であった．また，カタラー ゼは陰性であり，糖資化性より L. plantarum（87.4∼94.4 % ID）と判定された． そこで，これら 10 株のうち，乳酸発酵特有の爽やかな香 りを一番強く感じた 1 株を以降の柿シロップ発酵試験に用 いた． 2． 選定柿由来乳酸菌の同定 乳酸光学活性を測定したところ，選定した株は，DL 型 であった．次に，選定株の 16 S rDNA 塩基配列（1 497 bp） を決定し，相同性を調べたところ，L. plantarum と L. pentosus に対して 100 % であった．さらに，recA 塩基配 列（347 bp）について，近縁菌株との系統樹を作製した（図 2）．これらの結果から，選定株は L. plantarum と同定し， L. plantarum BFRI 380-7 とした． 3． 乳酸菌分譲菌株・選定株の柿シロップ発酵試験およ びタンナーゼ活性 前述の通り，柿果実から分離した 30 株のうち，柿シロッ プ Brix 30 で旺盛に生育した株は 10 株であり，集積培養液 A から分離した菌株であった． 柿シロップの原料の富有柿と同じ完全甘ガキの品種であ る「次郎」は収穫時に可溶性タンニンを 150 mg/個，不溶 性タンニンを 150 mg/個程度含むことが報告されている16）． タンニンはポリフェノールの一種であり，抗菌作用があ る17）．これらの知見から，柿シロップには抗菌性があり，柿 シロップを乳酸発酵できる菌株が限られるものと推察され た．そこで，柿シロップ発酵能とタンナーゼ（タンニンア シルヒドロラーゼ）活性との関係を検討した．乳酸発酵で 用いられている菌株やタンナーゼ活性を持つ菌株18）などを 指標に 19 株を選択し，これらの菌株と BFRI 380-7 の柿シ ロップ発酵特性およびタンナーゼ活性を比較した（表 2）． その結果，乳酸を 1 % 以上，かつ総有機酸を 2 % 以上生産し た菌株は，L. plantarum ATCC 14917，L. pentosus NBRC 106467，Pediococcus inopinatus JCM 12518 および BFRI 380-7 の 4 株であった．BFRI 380-380-7 と同様に L. plantarum ATCC 14917，P. inopinatus JCM 12518 は爽やかな好まし い乳酸発酵特有の香りも生じていたが，L. pentosus NBRC 106467 は発酵前後で香りの変化は見られなかった．これ らの菌株はタンナーゼ活性陽性（+）を示した．なお， BFRI 380-7 と同じく集積培養液 A より分離した 9 株もタ ンナーゼ活性陽性（+）であった． 4． 乳酸発酵条件の検討 （1）発酵時間の検討 柿シロップを Brix 30 に調製し，BFRI380-7 を用いて， 柿シロップ，Brix 30； 発酵温度，30℃ 図 1 分離菌株の生育検討 進化距離は DDBJ の CLUSTALW を用いて計算し，近接結合 法（NJ 法）で系統樹を作成し，TreeView で描画した．バー は塩基置換 % を示した（0.1 は 10 % 置換）．
図 2 BFRI 380-7 と Lactobacillus 属の 3 標準株の recA 遺伝子による系統樹
発酵試験（200 ml）を行った．有機酸と乳酸菌数を経時的 に測定した結果，図 3 に示すように，乳酸濃度は経時的に 増加し，5 日目に 1.1 % になった．乳酸菌数は 5 日で 4.8× 108個/ml に到達した．乳酸菌飲料の成分規格では乳酸菌 数は 1×107個/ml 以上であることから，発酵液が配合に よって希釈されることを考慮に入れて，乳酸菌数は 1×108 個/ml 以上を確保する必要がある．このため，最適発酵時 間は 4∼6 日とした． （2）柿シロップ Brix 濃度の検討 事前検討（Brix 10∼35 濃度発酵試験：データ未掲載）の 総有機酸（%） 乳酸（%） 有機酸 タンナーゼ 活性 乳酸菌 1.9 +
L. plantarum subsp. plantarum
表 2 タンナーゼ活性および柿シロップ乳酸発酵試験 P. parvulus 1.4 0.1 − L. hilgardii 1.6 0.8 − L. brevis 1.3 0.7 + L. paraplantarum 1.3 0 − L. lactis subsp. cremoris
1.4 0.8 − L. buchneri 2.5 柿シロップ（Brix 30）を 30℃，4 日間培養 タンナーゼ活性：3 段階で評価 +（陽性），±（わずか陽性），−（陰性） − P. acidilactici 2.4 1.8 + P. inopinatus 1.4 0.6 − L. casei 1.9 0.9 + 2.3 1.7 + L. plantarum 1.1 0.6 1.7 0.3 + L. parabuchneri 2.1 1.4 + L. pentosus P. damnosus 1.2 0.6 − L. dextrinicus 1.7 1.1 − L. rhamnosus 1.4 0.7 − L. brevis − L. mesenteroides subsp. mesenteroides
1.1 0.2
− L. lactis subsp. lactis
1.5 0.9 − P. pentosaceus 1.6 0.8 ± 1.2 0.0 柿シロップ（Brix 30）未発酵 1.8 0.9 JCM 5890 JCM 5889 JCM 5886 JCM 12518 JCM 5887 JCM 1155 NBRC 3425 NBRC 15883 NBRC 12005 NBRC 3345 JCM 12493 JCM 1115 NBRC 106467 NBRC 107151 ATCC 14917 BFRI 380-7 NBRC 100496 NBRC 100676 JCM 5805 JCM 8797 柿シロップ，Brix 30； 菌株，BFRI 380-7； 発酵温度，30℃ 図 3 発酵時間の検討
結果，Brix 25∼35 の範囲に乳酸生産量が高くなる Brix 濃 度があることが示唆されたため，本試験では，Brix 25∼35 まで，2.5 刻みに濃度を調製し，発酵試験を行った．なお， 発酵時間は乳酸最大生産能力を検討するため，1 週間とし た．柿シロップ 5 ml に対して，BFRI 380-7 菌液を 5 µl 加 え，30℃，1 週間発酵後，乳酸生産量を測定した．図 4 に示 す通り，乳酸生産量が最も高かったのは Brix 30 であった． また，Brix 濃度あたりの生産量をみると Brix 25∼30 まで はほぼ同程度であるが，Brix 32.5 より高くなるほど生産量 が低くなる傾向が見られた．そこで，以降の検討は Brix 30 で行った． 5． 乳酸発酵前後の成分変化 柿シロップを Brix 30 になるように調製後，BFRI 380-7 を用いて，30℃で 4 日間乳酸発酵した．発酵後の成分変化 を表 3 に示す．乳酸発酵を行うことにより，ブドウ糖：1.2 %，果糖：0.7 % を消費し，乳酸を 1.4 % 生じた．なお，一般 的な乳酸菌飲料に含まれているショ糖，乳糖などは柿シ ロップには含まれていなかった（データ未掲載）． また，発酵に伴い，リンゴ酸が 0.8 % から 0.3 % に減少し た．一方，GABA は発酵に伴って，微増した．グルタミン 酸は，発酵前は 2.4 mg/ml 含まれていたが，発酵後は検出 限界以下であった．総ビタミン C は発酵することにより， 発酵前の約 25 % に著しく減少した．また，DPPH ラジカ ル消去活性は微増し，総ポリフェノール量（没食子換算） に変化はなかった． 6． 柿シロップ乳酸発酵飲料の試作 乳酸発酵させた柿シロップを原料として，滅菌水で希釈 して柿シロップ乳酸発酵飲料を試作した．味を見ながら濃 度調整したところ，Brix 17 に希釈した飲料で，酸味と甘味 のバランスが良好であった．試作品の乳酸菌数および成分 を表 4 に示す．試作品の乳酸菌数は 5.6×108個/ml，乳酸 は 0.8 % であった．これらの結果から，原料に柿シロップ のみを使用し，BFRI 380-7 で発酵を行い，乳成分不使用の 製品（写真 1, 2）を試作した． 考 察 本報では，柿シロップ乳酸発酵用乳酸菌を選定し，柿シ ロップ発酵能とタンナーゼ活性の関係について検討を行っ た．また，乳酸発酵させた柿シロップを原料として乳酸発 酵飲料を試作した． 1． 柿シロップ乳酸発酵用分離乳酸菌について 富有柿から分離した乳酸菌 30 株の中で，柿シロップ中 で生育が良かった乳酸菌は 10 株であった．糖資化性試験 の結果で判定したところ，これらは L. plantarum と判定 され，類似の株であると推察された．これら 10 株のうち， L. plantarum BFRI 380-7 は乳酸発酵特有の爽やかな香り が特に強く，柿シロップ発酵用乳酸菌として有用であると 考えられた． 5.6×108 乳酸菌数（個/ml） 試作品 項目 表 4 試作品の乳酸菌数および含有成分 クエン酸 7.5 果糖 7.7 ブドウ糖 %（w/v） 17 糖度（Brix%） 1.1 総有機酸 0.8 乳酸 0.1 リンゴ酸 0.0 糖度は手持屈折計により計測． 試作品は Brix 17 となるように乳酸発酵液を滅菌水で希釈した． 14.6 ブドウ糖 %（w/v） 発酵後 項目 17.2 果糖 表 3 乳酸発酵による柿シロップ成分および機能性の変化 0.8 酸化型ビタミン C 17.4 GABA（mg/100 ml） 0.0 クエン酸 %（w/v） 乳酸 柿シロップ（Brix 30）を BFRI 380-7 で 30℃，4 日間培養した． 624 DPPH ラジカル消去活性（µmolTE/100 ml） 5.2 総ポリフェノール量（mgGE/ml） 1.4 2.0 総有機酸 0.3 リンゴ酸 2.6 総ビタミン C 1.7 還元型ビタミン C（mg/100 ml） 0.0 グルタミン酸 発酵前 538 10.3 4.1 6.2 5.2 2.4 16.2 1.2 0.0 0.8 0.1 17.9 15.8 菌株，BFRI 380-7； 発酵温度，30℃； 発酵時間，7 日 図 4 柿シロップ Brix 濃度の検討
2． 柿シロップ発酵能とタンナーゼ活性の関係
柿シロップ乳酸発酵試験の結果から BFRI 380-7 と同様 に L. plantarum ATCC 14917，L. pentosus NBRC 106467， P. inopinatus JCM12518 は柿シロップを発酵させる能力が 高い菌株であることが明らかとなった．これらの菌株はす べてタンナーゼ活性が陽性であり，柿シロップの発酵には タンナーゼ活性が有利に働くことが示唆された．今回検討 を行った BFRI 380-7 は，抗菌性を有する機能性が高いタ ンニン15）（加水型ポリフェノール類）を多く含む素材であ る茶，果物，野菜などの発酵に利用できると期待される． ところで，緑茶カテキンは没食子酸エステル型カテキン で存在することが多く，たんぱく質と複合体を形成するた めに，体内に吸収されにくいことが課題であったが，タン ナーゼ活性を有する乳酸菌は，この没食子酸エステル型を 非エステル型に乳酸菌が変換し，カテキンの体内吸収を促 進すると報告されている17）．BFRI 380-7 もタンナーゼ活性 を有することから，同様な効果が期待できると考えられる． 3． 乳酸発酵による成分および機能性への影響 試作した柿シロップ乳酸発酵飲料の乳酸は 0.8 % であっ た．製品買い上げ調査の結果，生菌タイプの市販乳酸発酵 飲料は，乳酸含有量が 0.4∼0.6 % であった（データ未掲載）． この結果から，今回の試作品は市販品より少し高めの乳酸 含有量であった．また，リンゴ酸は L. plantarum のマロ ラクティック発酵により変換されて減少したと推察された． 次に各成分および機能性への乳酸発酵の影響並びに試作 品の評価について，項目ごとに考察した． （GABA） 発酵前の柿シロップ（Brix 30）は GABA を多く含んで いるが，その乳酸発酵後も GABA（17 mg/100ml）は失わ れることなく，含まれていることが明らかとなった．ま た，GABA の前駆体であるグルタミン酸は，発酵前は 2.4 mg/ml 含まれていたが，発酵後は含まれておらず，GABA に変換若しくは乳酸菌に資化されたと考えられる．GABA は市販品では 10∼20 mg/100 g で特定保健用食品として許 認可されているが，試作した乳酸発酵飲料（Brix 17）にも 特定保健用食品と同等の約 10 mg の GABA が含まれてい た． （ビタミン C，ポリフェノール） 発酵後，総ビタミン C は約 25 % まで減少しており，発 酵の過程で菌株に資化された可能性がある．また，柿シ ロップ（Brix 30）中には総ポリフェノール（没食子酸換算） で 5.2 mgGE/ml 含まれており，発酵後も維持していた． （DPPH ラジカル消去活性） 総ビタミン C 量の減少により乳酸発酵液では DPPH ラ ジカル消去活性が，低下することが推察出来た．しかしな がら，発酵前は 538 TE/100 ml，発酵後は 624 µmol-TE/100 ml と約 1.2 倍に増加しており，乳酸菌による抗酸 化能増強が認められ，既報4）∼6）と同様な乳酸菌による DPPH ラジカル消去活性増強効果が得られた．他の発酵 液と比較すると，サトウキビ搾汁液は 68 µmol-TE/100 ml で，乳酸発酵後では 84 µmol-TE/100 ml と 1.2 倍に増加し たことが報告されている4）．サトウキビ乳酸発酵飲料と比 較すると，今回試作した柿シロップ乳酸発酵飲料（Brix 17） が約 4 倍程度高かった．乳酸発酵による抗酸化能の増強効 果は柿シロップ発酵と同様に約 1.2 倍であるため，この抗 酸化能の違いは，柿シロップそのものの成分に起因してい ると考えられる． 柿シロップを原料に柿から単離した乳酸菌を用いて，乳 酸発酵させることにより，乳成分を含まない乳酸菌飲料を 試作した．試作品は，柔らかい酸味と，柿シロップの甘味 がある素朴な味であり，乳酸発酵由来の爽やかな香りで あった．さらに，乳酸発酵によって，GABA，ポリフェノー ルを含む柿シロップの特徴を維持しつつ，DPPH ラジカル 消去能の増強が認められた．柿シロップを乳酸発酵するこ とによりさらに機能性を付与され，機能性素材としての利 用が期待される． 要 約
規格外の富有柿（Diospyros kaki Fuyu）を原料とした柿
1，柿シロップ（Brix 30）発酵前 2，柿シロップ（Brix 30）発酵後 3，試作品（Brix 17）
写真 1
シロップの乳酸発酵飲料開発について報告する．柿シロッ プでの生育試験の結果から柿果実分離乳酸菌 BFRI 380-7 を選定した．BFRI 380-7 は Lactobacillus plantarum と同 定した．さらに，BFRI 380-7 を含む，柿シロップを発酵す ることが可能な乳酸菌は，タンナーゼ活性（タンニンアシ ルヒドロラーゼ）を有することを明らかにした．BFRI 380-7 を用い，発酵温度 30℃で，最適発酵条件を検討した 結果，発酵時間 4∼6 日であり，最も高い乳酸生産量を示し た柿シロップ濃度は Brix 30 であった．30℃，5 日間発酵 で，乳酸菌濃度は 1.1 %，乳酸菌数は 4.8×108 個/ml に達し た．さらに BFRI 380-7 を用いて，乳成分を含まない柿シ ロップのみを原料とした乳酸発酵飲料を試作した． 本研究を遂行するにあたり，ご助言頂きました神戸大学 大学院農学研究科 大澤朗教授並びに上田宗平氏に謝意を 表します． 文 献 1） 渡部 忍，土佐典照，山崎幸一，大坪睦己，西条柿の有効利 用 乳酸菌を利用した発酵調味料の開発，島根県産業技術 センター研究報告，43，11-15 (2006). 2） 山下浩一，山中信介，クエン酸含有柿酢の製造，奈良県工業 技術センター研究報告，29，17-21 (2003). 3） 平野吉男，塚谷忠之，樋口智子，黒田理恵子，山下聡子，上 田京子，林 伊久，冨田和夫，須田 博，井上忠男，林田 武，岩永伸一，右田英訓，未利用柿を利用したピューレ及び シロップの製造並びに成分特性，福岡県工業技術センター 研究報告，20，36-39 (2010). 4） 河村俊哉，晦日房和，玉屋 圭，松本周三，榊原隆三，野嶽 勇一，県内資源を活用した加工食品の開発 ∼長崎県産物由 来の植物性乳酸菌及び酵母を活用した加工食品の開発∼， 平成 23 年度長崎県工業技術センター研究報告，41，1-6 (2012). 5） 広瀬直人，氏原邦博，照屋 亮，前田剛希，吉武 均，和田 浩二，吉元 誠，γ-アミノ酪酸（GABA）を増強したサトウ キビ乳酸発酵飲料の開発，日本食品科学工学会誌，55， 209-214 (2008). 6） 園元謙二，善藤威史，孫 燕旗，柴田圭右，野田義治，植木 達朗，藤野武彦，柿の抗酸化活性機能増強法および健康食 品素材，特許出願 2009-108276（2009.4.27）． 7） 善藤威史，孫 燕旗，植木達朗，野田義治，藤野武彦，園元 謙二，柿に機能性を賦与する乳酸発酵技術の開発，第 61 回 日本生物工学会大会講演要旨集，p. 74，名古屋 (2009). 8） 大塚食品（株），発酵ベジタブル飲料「野菜の戦士」の誕生， 食品工業，45，52-58 (2002). 9） 上田京子，塚谷忠之，村山加奈子，倉田有希江，竹田絵里， 大塚崇文，高井美佳，宮崎義之，立花宏文，山田耕路，ブ ロッコリーのビタミン C，S-メチルメチオニン，ポリフェ ノール含有量の部位別解析と細胞機能への影響，日本食品 科学工学会誌，62，242-249 (2015). 10） 沖 智之，DPPH ラジカル消去活性評価方法，「食品機能性 評価マニュアル集 第Ⅱ集」，第 1 版，食品機能評価支援セ ンター 技術普及資料等検討委員会編，（日本食品科学工学 会，茨城），pp. 71-78 (2008). 11） 内村 泰，岡田早苗，Ⅱ．乳酸菌の分離・保存法，「乳酸菌 実験マニュアル─分離から同定─」，第 1 版，（朝倉書店，東 京），pp. 6-19. 12） 内村 泰，岡田早苗，Ⅲ．乳酸菌の同定実験法，「乳酸菌実 験マニュアル─分離から同定─」，第 1 版，（朝倉書店，東 京），pp. 34-42. 13） 平石 明，リボソーム RNA 遺伝子の塩基配列，「微生物の 分類・同定実験法─分子遺伝学・分子生物学的手法を中心 に─」，第 1 版，鈴木健一朗，平石 明，横田明編，（シュプ リンガー・ジャパン，東京），pp. 48-60 (2001).
14） Torriani, S., Felis, G.E. andDellaglio, F., Differentiation of Lactobacillus plantarum. L. pentosus, and L. paraplantarum by recA gene sequence analysis andmultiplex PCR assay with recA gene-derived primers. Appl.Environ.Microbiol., 67, 3450-3454 (2001).
15） Osawa, R., Formation of a clear zone on tannin-treatedbrain heart infusion agar by a Streptococcus sp. isolatedfrom feces of koalas. Appl. Environ. Microbiol., 56, 829-831 (1990). 16） 平 智，松本尚子，小野未来，甘ガキおよび渋ガキ果実の発 育過程におけるタンニンの蓄積と不溶化，園芸学会雑誌， 67，572-576 (1998).
17） Scalbert, A., Antimicrobial properties of tannins. Phytochem-istry, 30, 3875-3883 (1991).
18） Osawa, R., Kuroiso, Goto, K., S. andShimizu A., Isolation of tannin-degrading lactobacilli from humans and fermented foods. Appl. Environ. Microbiol., 66, 3093-3097 (2000). 19） 大澤 朗，タンナーゼ活性を有する乳酸菌を利用した新規 プロバイオティクスの開発，腸内細菌学雑誌，25，1-5 (2011). 引用 URL ⅰ） 作況調査（果樹）確報（平成 23 年産果樹生産出荷統計かき の 都 道 府 県 別 の 出 荷 量） http://www. e-stat. go. jp/SG1/ estat/List.do?lid=000001102790（2015. 8. 5）
ⅱ） http://www. otsuka-chilled. co. jp/product/yasainosenshi/ index.html（2015. 9. 3）
ⅲ） http://www.ddbj.nig.ac.jp/index-j.html（2015. 6. 15）
