水溶性カルボジイミドによる酵素のカルボキシル基 の化学修飾

水溶性カルボジイミドによる酵素のカルボキシル基 の化学修飾

著者 岩間 正典

雑誌名 星薬科大学紀要

号 28

ページ 41‑49

発行年 1986

URL http://id.nii.ac.jp/1240/00000063/

Pr㏄． Hoshi Pharm． No．28，1986

水溶性力ルポジイミドによる酵素のカルボキシル基の化学修飾 岩 間

正  典

星薬科大学 微生物学教室

Chemical Modi丘cation of Enzymes with Water・Soluble Carbodiimide

MASANORI IwAMA

Z）⑳αγ物ε斑〔ヅ1辺cγobio1卿，πos万Co11β9θげP肋棚αo夕

1． はじめに

 酵素を研究するに当って，その酵素活性すなわ ち触媒作用がどの様な機構で発現されているかを 調べるのは一つの重要な命題となる．著者らはグ ルコアミラーゼ，リボヌクレァーゼ（RNase）な どの加水分解酵素の活性発現に関与しているアミ ノ酸残基について検索を行ってきた．

 酵素活性に関与しているアミノ酸残基を検索す る方法のうちもっとも一般的な方法の1つは化学 修飾法である．本稿で紹介する水溶性カルボジイ ミドはペプチド合成1），ヌクレオチドの重合反応2）

等に用いられてきたが，カルボジイミドを水溶性 にして酵素などの蛋白質が安定な条件で反応させ ることによって蛋白質中のカルボキシル基，即ち C一末端のカルボキシル基，およびアスパラギン 酸，グルタミン酸側鎖カルボキシル基の特異的な 修飾試薬として多用されている3）．次項で述べる ように，一般的にはカルボジイミドの反応は大過 剰のヌクレオフィルの共存下に行われてきた．

 著者らは水溶性カルボジイミドのうちアイソト

ー プ標識しやすい1−cyclohexyl−3−（2−morpho・

linyl−（4）−ethyl）carbodiimide methoヵ一toluelle−

sulfonate（CMC）の14C一標識体をヌクレオフィ

ル無しで単独で用い，数種の酵素の活性へのカル ボキシル基の関与についての検討を行った結果，

反応が極めて限られた環境のカルボキシル基に対 してのみ進行するため，良好な修飾方法であるこ

とを明らかにした．

2． 水溶性カルボジイミドの反応

 水溶性カルボジイミドによる蛋白質中のカルボ キシル基の修飾についてはIloareとKoshlandに

よって反応の機構が説明されている3）．その反応 の様子を図1に示す．蛋白中のカルボキシル基は カルボジイミドと反応してO一アシルイソ尿素を 形成し，（1）一部は分子内転移してアシル尿素とな り，（2）他の一部は水によって加水分解を受けて元 のカルボン酸に戻る．（3）この時，水以外のヌクレ オフィルが存在すると尿素と置換して安定なカル ボン酸誘導体になる．（3）の反応は大過剰のヌクレ オフィルの存在下では定量的に起こり，（1）の反応 は無視できると考えられていた．従って，通常の 酵素修飾法では大過剰のヌクレオフィルを加えて カルボキシル基と結合したカルボジイミドを定量 的にヌクレオフィルと置換し，結合したヌクレオ フィルを定量することによって修飾されたカルボ キシル基の数を計算している．しかしながら，

本研究の一部は昭和60年度星薬科大学大谷研究助成の対象となったものである（紀要委員会）．

Pr㏄． Hoshi Pham、． No．28，1986

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Fig．1． The reaction of water・soluble carbodiimide with carboxyl group in protein．

一輪

一6

叉

▲

ψ

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    _、

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▲

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0    0      0    0

10  5   2  1

  ︵ぷ︶﹂トヌFO＜OZ一Z一くΣ囚匡

        0    20   40   60       TjME（min）

Fig．2． Inactivation of Glucl on treatment with  CMC alone and CMC・taurine at pH 5．O and 25°C．

 Glucl was treated with CMC alone（circles）and  CMC−taurine（tアiangles）in the presence（open  symbols）and absence（closed symbols）of O．6M  maltose． Concentrations of reactants were 13．5  μMGIuc1，40 mM CMC， and O．6M taurine． The  enzyme activity was measured with soluble

 starch as a substrate．

ArikiとFukuiは家兎筋肉のphoshorylase b

の修飾でヌクレオフィルに定量的置換が起こらな いことを報告している4）．この場合には一部が図

1の（1）の経路をたどって安定なN一アシル尿素誘 導体になっているものと思われる．

 我々はこの結果を確認するために、R万2ψ爾属 菌のグルコアミラーゼを用いて実験を行ってみ た．図2にCMCで修飾した結果を示す5）．ヌク

レオフィルとしてタウリンを用いた結果では，反

応60分で残存活性は約10％となり，タウリン約 2．9残基とCMC約2残基が取り込まれていた．

この場合にもCMCが置換されずに酵素と結合し ていることが明らかになった．しかも，タウリン を用いずにCMCのみを用いてもほぼ同じ様な失 活をしている．従って，もし酵素が水溶性カルボ

ジイミド単独との反応でも反応が進むようであれ ば，ヌクレナフィルとの置換の不完全さに起因す る反応解析の困難さを避けることが出来ると考え られる．以下に述べるグルコアミラーゼ，リボヌ クレアーゼ等の酵素は何れもCMC単独の反応で 酵素活性の低下を起こした．

 CMCを単独で用いる場合蛋白中に結合した数 を知るためにはCMCをアイソトープで標識する 必要があり，SheehanとHlavkaの方法6）に従っ て［14C］CMCを合成した．

3．R厄29ρμ8属菌グルコアミラーゼのCMC

 修飾5）．

 グルコアミラーゼ［EC 3．2．1．3］は澱粉のα一 1，4グルコシド結合を非還元末端からグルコース 単位で加水分解するexo型の酵素である．グル コアミラーゼの活性中心にカルボキシル基が関与 しているであろうことは反応動力学定数のpH変

Proc． Hoshi Pharm． No，28，1986

化から推測されている7）．またGrayとJolley8）

は水溶性カルボジイミドとグリシンを用いて

∠4珍θ宿〃％sκ哲θγのグルコアミラーゼを修飾し，

カルボキシル基が活性に関与していることを推測 しているが，グリシンの取り込みが多過ぎて結果 の解析はあまりはっきりしなかった．そこで当教 室で扱っている2種の菌が産生するグルコアミラ

ーゼを用いて，CMC修飾を検討した．

 R〃斑抱S属菌の産生するグルコアミラーゼは 1978年に当教室において高橋らによって単離精製 され9），主成分Gluc、（Mr．74，000）とそのN一末 端の一部のペプチドを欠いたGluc2（Mr．58，600），

Gluc3（Mr．61，400）の3つのアイソマーが報告さ れている．このうちGluc1と分子量の一番小さい Gluc2をCMC修飾した．図3に基質であるマル トースの有無による活性の変化とCMCの取り込 み個数との関係を示す．Gluc1， Gluc2ともにマル トースで活性が保護され，そのときの修飾された カルボキシル基が0．6−0．8残基少なくなった．従 って，マルトースによって保護されたカルボキシ ル基は活性中心近傍に存在し，酵素活性の発現に 関与していることが推測された．このことを更に 確かめるため，あらかじめ非標i識CMCでマルト

ースで保護をしながら修飾したGluc、を透析し，

マルトースを取り除いた．この酵素は約76％の活 性を持っている．この酵素を［14C］CMCで再修飾 した．結果を図4に示す．約1．3残基が修飾され て失活するが，同時にマルトース存在下に修飾し たものでは活性はほぼ完全に保護され，約0．5残 基が修飾された．この差は約0．8残基であり，こ のことはやはりここで修飾された1残基のカルボ キシル基が活性に関与していることを示してい

る．

 以上のようにR海gψ俗属菌のグルコアミラー ゼの活性中心には少なくとも1残基のカルボキシ ル基が関与していることが明らかになったが，そ の関与の仕方を調べるためには，修飾後の酵素の 反応動力学定数を調べることが大切である．図5 にはCMC修飾と残存活性の関係を基質を変えて

測定した結果を示す．数種のマルトオリゴマーを 基質として測定した残存活性の割合は完全に等し かったが，かnitropheny1α一D・glucopyranoside

（PNPG）を基質として測定した残存活性の割合は 他の基質よりも大きかった．そこでさらに反応動 力学定数を測定したが（表1），PNPGを基質と したときのみ塩が増大し，また臨。。の減少 が少なかった．マルトオリゴマーを基質としたと きのK〔が変化していないことから，CMCで修 飾されるカルボキシル基は，加水分解触媒反応に

100

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5。

（×︶﹂F一≧↑O＜O≡≧＜芝山江

       0   1   2   3

    ［14C CMC］／［Cluc］］      11℃CMC〕／［Gluc2］

Fig．3． Inactivation of Glucl and Gluc20n treat−

 ment with［14C］CMC in the presence（○）and  absence（●）of O．6M maltose at pH 5．0．（a）

 Gluc1，（b）Gluc2．

ユ 

§：：

…・・

巨、。⁝

量1i

（a｝ （×︶﹀﹂SCO＜OZ一Z一くΣUエ

   0  20  40  60  80  100

     TIME（min〕      ［11C・CMCV［Gluc」］

Fig．4． Inactivation of Glucl previously treated  with CMC in the presence of maltose on treat−

 ment with the same reagent in the absence of  maltose．（a）Time course of inactivation of Glucl  pretreated with CMC in the presence of皿altose  （residual activity，76％）on treatment with 40mM  ［14C］CMC in the absence（●）and presence（○）of  O．6M maltose at pH 5．O and 25°C．（b）Relation  between the incorporation of［14C］CMC and enzy・

 matic activity during the course of inactivation．

 The experimental conditions and symbols are  the same as in Fig．4a．

Proc． Hoshi Pharm． No．28，1986

Table I． Kinetic parameters of CMC−modi丘ed Glucl at pH 5．0．

Substrate Maltotriose

Reaction time Activitya

  （皿in）    （％）   κm       （mM）

Maltose

PNPG

γm。×10−2 κm  γm。x×10−2 κm

（min一1）  （mM）  （min−1）  （皿M）

γm。x×10−2

（min−1）

0 10．5 22 45

100 57．8 33．1 11．7

0．709 0．719 0．693 0．749

り白337●  ︐  ．  ︐

5り072

2．11 2．24 2．48 2．47

7．01 3．54 1．87 0．70

2．53 3．36 3．95 5．52

0．069 0．045 0．027 0．016

aThe enzymatic activity was measured with soluble starch as substrate．

§136 ξllξ 220_三

菱1呈

 6

、▲．

、1▲一一一一

  、，

        0     20    40    60        TWE〔min〕

Fig．5． Inactivation of Glucl on treatment with  CMC， measured with soluble starch， maltose，

 maltotriose and PNPG as substrates． The reac・

 tion conditions were practically the same as in  Fig．2． The enzymatic activity was measured  with four substrates， soluble starch（●）， maltose  （○），maltotriose（×）， and PNPG（▲）．

直接関与しているかあるいは基質が加水分解され うるような結合をするために寄与しているかの何 れかと考えられる．PNPGを基質としたときの 塩，γ二。xの変化の違いからマルトースの1／100 程度という遅い水解速度の基質であるPNPGを 加水分解する際にはこのカルボキシル基はあまり 関与していない可能性が示唆された．

4． A8ρθrgj〃μ88α」εoiの産生するグルコア  ミラーゼのCMC修飾1°・11）

いると考えている．図6にGIuc M、をCMC修 飾した結果を，図7にGluc M2の結果を示す．

両酵素とも同じ様な擬一次反応の失活曲線を示 し，マルトースの保護も同様である．［14C］CMC による取り込み個数を見ると，Gluc M2の方が遙 かに少なくなっている，図8と図9には両者をマ ルトース保護下にCMC修飾し，試薬を除去した のち再び［14C］CMCで修飾した結果を示す． Gluc MIはさらに約4残基， Gluc M2では約2残基が 修飾されて失活することが解った．両酵素の活性 中心付近の構造は同じと考えられるため，Gluc M2で修飾された2残基のカルボキシル基のうち

§

≧198

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…2・童

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（a）

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0   10   20   30   40

   TIME（min）

へ りむξ，。

…，。

…、。

i、。

臣 o

    （b）

＼

    ＼

 ・4．Sαπ励のグルコアミラーゼも高橋ら12）および 井口13）らによって精製されているが，R舵0ヵ俗 属菌のグルコアミラーゼと異なり等電点3．9付近 の酸性蛋白質である．主成分のGluc M1は分子 量約90，000，副成分であるGluc M2は分子量約 70，000で，Gluc M1のC一末端ペプチドを欠いて

0   4   8   12   〔1℃−CMC〕

Fig．6． Inactivation of Gluc MI on treatment with n−一

 CMC in the presence and absence of maltose at  pll 4．5．（a）Time course of inactivation of Gluc  MI on treatment with CMC． Gluc M1（33．3μM）

 was inactivated with 14C・labeled CMC（20 mM，

 72．2μCi／mol）in the presence（○）and absence  （●）of O．6M maltose at pH 4．5．（b）Relation  between the incorporation of［14C］CMC and enzy−

 matic activity during the course of inactivation．

 The experimental conditiolls and symbols were  the same as in Fig．6a．

Pr㏄． Hoshi Pharm． No，28，1986

00 80 60 00   20

  1      ︵邑・↑一≧↑O＜OZ≧＜＝山匡

10

0  ユ0  20  30    匂5   60

     TIME（mm）

oo 1

（^×︸

0    08    5

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0Z一Z一くΣ山ピ

竃

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      114C−C門Cl      n．

      161uc㌦）

Fig．7． Inactivation of Gluc M2 by treatment with  CMC in the presence and absence of maltose at  pH 4．5．（a）Time course of inactivation of Gluc  M2 by treatment with CMC． Gluc M2（16．7μM）

 was inactivated with［14C］CMC（10mM，72．2μCi／

 mol）in the presence（○）and absence（●）of O．6  Mmaltose at pH 4．5．（b）Relation between the  incorporation of［14C］CMC and enzymatic activity  during the course of inactivation． The experi・

  mental conditions and symbols were the same  as in Fig．7a．

（び︸ ﹀ヒ≧↑O＜ O〜±三くコ山 100

80

50

qo

20

●

●

       0             0     0．5    1．0    1．5    2，0

      114C−C門〔l        n垣       【Gluc H2；

Fig．9． Inactivation of Gluc M2 previousely treated  with CMC in the presence of maltose． Gluc M2  pretreated with CMC in the presence of nlaltose  （residual activity，70％）was treated with 10mM  ［14C］CMC at pH 4．5．

スによる阻害定数が増大した．

5．．鎚pθrσ」仇88α」 o元の産生する主成分リ   ボヌクレアーゼのCMC修飾14）

0  oo  1（_〉 巴

0 5

0 と⊆≧トO＜O≧Z﹁︵芝U匡 ・＼・

1

n＝一    一

し

2    3

［IC−CMC】

［Gluc M，｝

4

Fig．8． Inactivation of Gluc MI previousely treated  with CMC in the presence of maltose． Gluc Ml  pretreated with CMC in the presence of maltose  （residual activity，70％）was treated with 20mM  ［14C］CMC at pH 4．5．

に活性に関与しているカルボキシル基があると考 えられる．なお，Gluc M1で余分に修飾されるカ ルボキシル基はおそらくGluc M2に無くGluc M、にのみあるペプチド部分にあると考えられる．

R海斑ρμS属菌のグルコアミラーゼと同じ様に両 酵素ともPNPGを基質としたときの残存活性の 割合が多かった．Gluc M2で反応動力学定数を測 定した結果を表IIに示す． R万2〔ψμS属菌の結果

と似て，PNPGに対するκmが多少増大し，ま たPNPGを基質として測定したときのマルトー

 ・4．sα鋤iの産生するリボヌクレアーゼは入江 によって精製され15），その主成分RNase Mは 分子量36，00016）で，活性中心にヒスチジン残基 が存在することが解っている17」8）．pH 5．0で RNase MをCMC修飾したところ，図10（a）に

00000864

1

0  02   1

（×︶﹀ト﹁﹀﹁トO＜OZ一Z一くΣU匡 §100：

⊆8°

巨・・

24。そ

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〔b）

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   0  10  20  30  40  50  60       0    2    4    6    8    10

         TIMε（mi［）      〔1℃・CMC〕

       リ コ       コ         〔RNaseM〕

Fig．10． lnactivation of RNase M on treatment  with CMC in the presence and absence of cytidine  at pH 5．0．（a）Time course of inactivation of  RNase M on treatment with CMC． RNase M  （26．3μM）was inactivated with［14CユCMC（15mM，

 72．2μCi／mol）in the presence（○）and absence（●）

 of IM cytidine at pH 5．0（0．1M MES buffer）at  25℃．（b）Relation between the incorporation of  ［14C］CMC and enzymatic activity during the  course of inactivation． The data were obtained  from the experiment described in Fig．10a． The  symbols are the same as in Fig．10a．

Proc． Hoshi Phar皿． No．28，1986

Table II． Kinetic parameters of CMC−modi丘ed Gluc M2 at pH 4．5．

Enzyme

（Enzymatic activity，％）a

Native Gluc M2

   （100％）

CMC−modi丘ed Gluc M2

       （48％）

CMC−modi丘ed Gluc M2

       （28％）

Kinetic

parameterb    1（m    γmax

（％or mM）（min−1）

Ki  κm  γm。x K1  κm  γmax Ki

（mM）（％or mM）（mir1）（mM）（％or mM）（min−1） （mM）

Substrate  Soluble starch  Maltose  Maltotriose

 PNPG

Inhibitor  Maltose  Maltito1

0．0352 1．83 0．388 3．27

2，590  374 1，660   17．2

2．19 0．349

0．0357 1．71 0．361 4．14

1，210  142  706

  10．8

2．80 0．351

0．0362 1．79 0．417 5．36

636 81．8 400  8．90

3．70 0．352

aThe activities were measured with soluble starch as a substrate．

 as％and those for other substrates as mM．

b1ζm for soluble starch is expressed

（a）

灘漣瀦郭総深膿．

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（b）

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      100％ 66．4％ 36．6％     100％

Fig．11． SDS Disc electrophoresis of CMC一皿odi丘ed RNase M．（a）RNase M modi丘ed with       CMC in the absence of cytidine．（b）RNase M modi丘ed with CMC in the presence       of IM cytidine． The enzymatic activity of each sample is given in the丘gure． The       electrophoresis in 7％polyacrylamide containing O．1％SDS was performed according       to the method of Weber and Osbornl9）．

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71．1％

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  ●5 3

Proc． Hoshi Pharm． No．28，1986

0   0

10  8   

（§^{ζ一≧トO＜}   64    2  00    0

0^{≡≡＜Σ山㏄}

      ［■4C・CMC1

         ほロへ

      〔RNas■M】

Fig．12． Inactivation of RNase M previously    treated with CMC in the presence of    cytidine with the same reagent in the    absence of cytidine． RNase M pre−

   treated with CMC in the presence of    cytidine（residual activity，78％）was    treated with 15mM［14C］CMC at pH    5．O and 25°C．

示すように活性は低下した．阻害剤であるシチジ ンの存在下ではこのCMCによる失活はかなり保 護された．この結果はヒスチジン残基以外にカル

ボキシル基が関与していることを示している．こ の時のRNase MのSDS一電気泳動を調べると図 11に示すように，シチジンを加えない場合には分 子間重合が起こっていることが解った．そこでセ ファデックスG−100でゲルろ過して得たモノマー のみについてCMCの取り込み数と活性の関係を 調べた．結果は図10（b）に示す．9−10残基のカル

ボキシル基が修飾されて失活し，その内の約5残 基はシチジンによって保護された．さらにシチジ

ン存在下にCMC修飾して78％の残存活性を有す るRNase Mを透析した後，再びCMC修飾し

たところ4−5残基が修飾されて失活した（図12）．

RNase Mでは活性に関与するカルボキシル基は これ以上限定することは出来なかったが，少なく とも1残基のカルボキシル基が関与していること は明らかになった．また，トリプトファン残基に 由来すると考えられる296nmのCDバソドが CMC修飾によって小さくなった．このことから CMC修飾されるカルボキシル基とトリプトファ ン残基とが相互作用していることが推測された．

6．R砺20ρμ8属菌の産生するリボヌクレアー  ゼのCMC修飾20）

 疏戯吻S属菌の産生するリボヌクレアーゼ

（RNase Rh）は分子量24，00021）で，反応動力学的 研究からpKa 3．3と7・2の官能基が活性に関与 していることが推測されており，後者はヒスチジ ン残基と考えられている22・23）．

 カルボキシル基の活性への関与を調べるため CMC修飾を行ったところ図13のように失活し た．中の図は活性と修飾残基数の関係で約2残基 の修飾で失活することが解った．図14にはシチジ ンを入れたときの保護効果を示した．図の点線は シチジンを加えて保護した後の再修飾の結果で，

新たに1残基程度の修飾で失活した．RNase Rh では，このように再修飾によって活性に関するカ ルボキシル基は約1残基存在することが明かとな ったので，この酵素をさらに還元カルボキシメチ ル化し，トリプシン消化後2次元電気泳動によっ

⌒決︶︾ト一≧トo＜O≧z一くΣ四㏄

        REACTION TIME（min）

Fig．13． Inactivation of RNase Rh on treatment    with CMC at pH 5．0． Time course of    inactivation of RNase Rh on treatment    with CMC． RNase Rh（43μM）was inac・

   tivated with［14C］CMC（8 mM）at pH 5．0    （0．1M MES buffer）． Insert：relation be−

   tween the incorporation of［14C］CMC and    the remaining activity during the course    of inactivation．

Proc． Hoshi Pham1． No．28，1986

1

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O        1       2       3   14C−CMC INCORPORATED

       （mo【／mot enz）

Fig．14． Inactivation of RNase Rh on treatment    with［14C］CMC in the presence and absence    of cytidine at pH 5．0． The relation be−

   tween the incorporation of［14C］CMC and    remaining activity during the course of    inactivation for 60 min is shown in this    丘gure． RNase Rh（56．8μM）was inactivated    with［14C］CMC（10 mM）in the presence（○）

   and absence（△）of IM cytidine at pH 5．0．

   The sample which was modi丘ed in the    presence of cytidine was re・modi丘ed with    ［14C］CMC after elimination of cytidine by    dialysis（…●…）for 45 min．

て分離を行った．図15に示すように，11番のペプ チドに放射活性が認められ，この部分のペプチド に活性に関係のあるカルボキシル基が含まれてい ると考えられる．

τ おわりに

 以上4種の酵素についてCMC修飾の結果を述 べたが，何れもヌクレオフィルを用いないで活性 が低下し，特に基質や拮抗阻害剤で保護しながら 非標識CMCで修飾しその後［14C］CMCで修飾 する2段階修飾法を用いることによって，活性に 真に関係のあるカルボキシル基のみに限定して修 飾することが出来るようになった．この一連の実 験によって，従来のヌクレオフィルによる置換法 に対して水溶性カルボジイミドを単独で使用する 修飾方法が種々の点で有利であることが明らかに なったと思う．今後さらに，［14C］標識ペプチド を分離して修飾されたカルボキシル基の一次構造 上の位置を解明していく必要があると考えてい

る．

〉 工江 く 匡O Oト

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  ⑲   1・1・

      x

        （一）ELECTROPHORESIS（＋）

Fig．15． Two dimensional皿apping of tryptic    peptides from［14C］CMC−modi丘ed RNase Rh    （residual activity，18％）． The丘rst dimen−

   sion： electrophresis in pyridine：acetic    acid：water（pH 6．5）． The second dimen・

   tion：paper chromatography in butano1：

   acetic acid：pyridine：water． The spot    having the radioactivity is indicated by    hatched lines．

 謝  辞

 本研究に対して昭和60年度大谷研究助成金を賜りま したことに感謝いたします．また本研究を進めるに当 たり，終始御指導御協力賜りました入江昌親教授はじ め微生物学教室の皆様に謹んで感謝の意を表します．

さらに，酵素原末を御供与下さいましたキヅコーマン 醤油株式会社，盛進製薬株式会社の吉田文彦博士なら びに天野製薬株式会社に感謝いたします．

文 献

1） F．Kurzer and K． Douraghi−Zadeh． C加功． Rερ．，67，107（1967）．

2） H．G． Khorana， Some recent developments in the chemistry of phosphate esters of biological in・

Proc． Hoshi Pharm． No，28，1986

︶︶︶︶︶︶︶︶︶︶︶︶︶︶︶︶︶︶︶︶︶

345678901234567890123        11111111112222

D．G． Hoare and D． E． Koshland， Jr．，∫．Bio／． C舵勿．，242，2447（1967）．

M．Ariki and T． Fukui，∫．捌06舵〃2．，83，183（1978）．

M．Iwama， R． Ohtsuki， T． Takahashi， and M． Irie，∫．、Bioc加〃2．，96，329（1984）．

J．C． Sheehan and JJ． Hlavka，∫．0η． Cんε勿．，21，439（1956）．

K．Hiromi， M． Kawai， and S． Ono，∫Bio6乃θ批，59，476（1966）．

C．J． Gray and M E． Jolley， FEBS Lθzオ．，29，197（1973）．

T．Takahashi， Y． Tsuchida， and M． Irie，∫＿8iocんθ〃2．，84，1183（1978）．

N．Inokuchi， M． Iwama， T． Takahashi， and M． Irie，ノ．βゴo吻〃2．，91，125（1982）．

T．Koyama， N． Inokuchi， M． Iwama， and M． Irie，∫． B606舵〃2．，97，633（1985）．

T．Takahashi， N． Inokuchi， and M． Irie，∫，、Biocμ勿．，89，125（1981）．

N．Inokuchi， T． Takahashi， and M． Irie，∫．．Bio吻〃￠．，90，1055（1981）．

H．Watanabe， S． Sugiyama， M． Iwama， R． Futaki， and M． Irie，∫．βioc乃θ〃z．，94，63（1983）．

M．Irie，ノ．疏06加〃z．，62，509（1967）．

K．Ohgi， and M． Irie，∫． B oc舵卿ひ77，1085（1975）．

M．Irie，∫．8 oc加勿．，66，569（1969）．

M．Harada， M． Irie， T． Negi， and T． Samejima，1． Bioc舵〃2．，69，881（1969）．

K．Weber and M． Osborn，∫．8io／． C舵幼．，244，4406（1969）．

A．Sanda， T． Takizawa， M． Iwama， and M． Irie，∫．βioc舵〃3．，98，125（1985）．

M．Tomoyeda， Y． Eto， and T． Yoshino、∠4γc乃．βioc加勿．．召鋤吻s．，131，191（1969）．

T．Komiyama and M． Irie，ノ．．召ioc舵〃2．，75，419（1974）．

A．Sanda and M． Irie， C乃θ〃2． P功夕〃z． B〃1．，27，2310（1979）．