論文審査の結果の要旨
氏名：齋 藤 五 月
博士の専攻分野の名称：博士（歯学）
論文題名：口腔扁平上皮癌細胞におけるウアバインのシグナル伝達について 審査委員：（主 査） 教授 鈴 木 直 人
（副 査） 教授 浅 野 正 岳 教授 飯 沼 利 光 教授 松 村 英 雄
口腔癌（oral squamous cell carcinoma; OSCC）の大部分は扁平上皮癌であり，恒常的な転写因子の活 性化により種々のサイトカインが構成的に産生されている。これらのサイトカインは腫瘍の進展・増 殖に関与するため，その産生を抑制することは，OSCCの浸潤増殖を抑止する有効な手段となりえる。
強心配糖体は，構造的に共通のステロイド骨格を有する物質であり，様々な生物学的効果を発揮す る。ウアバインは強心配糖体に属し，強心作用に加え抗癌作用があることが報告された。この報告以 後，様々な癌細胞への感受性が検討されてきたが，OSCCに対する効果は未だ明らかにされていない。
本研究では，OSCC に対するウアバインの抗癌作用について検索する前段階として，そのシグナル 伝達経路について検討を行った。
ヒト口腔扁平上皮癌由来株化細胞であるHSC3を0，30，60および120 μMのウアバイン存在下で1 時間培養し，培養上清中のIL-8およびIL-1α濃度をenzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）によ り測定した。また，カルシウムキレート剤であるBAPTA-AM（10μM）及びreactive oxygen species（ROS） 阻害剤であるL-glutathione（10μM）により1時間前処理することにより，カルシウムイオンおよびROS の IL-8 産生への関与について検討した。遺伝子発現の変化については real-time polymerase chain reaction（PCR）により検討した。Luciferase assay 用の reporter vector は，IL-8 遺伝子の非翻訳領域
（untranslated region: UTR）（TATA box上流1.3 kb）をPCRにより増幅し，pGL4 vectorにサブクロー ニングしNF-κB-long vectorとした。この領域に含まれる上流のNF-κB結合部位を欠失したNF-κB-short vectorをsite-directed mutagenesisにより作製した。HSC3細胞に5時間transfectionし，30 μMのウアバ イン存在下または非存在下で1時間培養後，細胞溶解液を回収し，Dual-Luciferase Reporter Assay System にてルシフェラーゼ活性測定を行った。Western blottingはHSC3細胞をウアバインで1時間刺激後，
細胞溶解液を0，15，30および60分後に回収し行った。免疫蛍光染色は細胞をウアバイン30 µMの 存在下または非存在下で6時間培養した後に行った。蛍光顕微鏡で画像を撮影すると同時に，蛍光強
度をImage Jを用いて測定した。
その結果，以下の結論を得ている。
1.
HSC3によるIL-8産生は，ウアバイン濃度依存的に抑制されたのに対し，IL-1α産生は増強した。2.
ウアバインによるIL-8産生抑制は遺伝子レベルで調節されており，カルシウムイオンとROSが 関与していることが明らかとなった。3.
IL-8遺伝子調節領域のTATA box上流約1 kbに存在するNF-κB結合部位が発現抑制に深く関与し ていた。4.
ウアバイン刺激15 ~ 30分後にc-Junおよびc-Fosのリン酸化が有意に増強した。5.
ウアバイン刺激によりNF-κB p65サブユニットは細胞質に移行する傾向を示した。本研究の結果は，ウアバイン刺激のシグナル伝達経路の一端を解明したものである。癌治療におけ る強心配糖体の使用は細胞特異的な反応を考慮し，その効果を事前に充分検討することが必要である ことを示唆するものであり，歯科医学の進展に寄与するものと考えられた。
よって本論文は，博士（歯学）の学位を授与されるに値するものと認められる。
以 上 平成３１年３月１２日
