分子遺 伝学 的研究 遺 伝 性 高低 比重 蛋 白 症

金沢 大学 十 全 医 学 会 雑 誌 第^{1 0 7}巻 第⁵号 ^{3 5 7 ‑ 3 7 1}(^{1 99 8})

遺伝性高低比 重リ ボ蛋白 ^コ レ^ス テ ^{ロ ー ル}血症^の分 子 遺伝学的研 究

金 沢 大 学 医 学 部 医 学 科 内 科 学第^二藩 座 ( 主 任^: 馬 渕 宏 教 授)

野 原 淳

3 5 7

遺 伝 性 高 低 比 重リ ボ蛋 白コ レステロ ^ー ルO^{o w de n si}t ylipopr otein chole ste r ol, L D I:C) 血症^は幼 少 時^より 高^{L D しC} 血 症 が持 続し, 早 発 性 冠 動 脈 硬 化 症が高 頻 度に発 症 する^. 現 在 まで に低 比 重¹) ポ蛋 白 受 容 体 (^{lo w de n sit}y lipopr otein r e c ep to r,

L D I]R) 遺 伝 子 異常^{に よ}り生ずる家 族 性 高^{コ レ ス}テ^{ロ ー} ル血症 (^{fam ilial h}y pe r chole ste r olemia, F H) お よ び L D しR に結 合 する リ ガ^ンド であ^{る ア ポ リ ボ}蛋 白^{B‑1 0 0} (^ap^oli_pop^{r o}tein B^‑1 0 0, ap^O B^‑1 0 0) 遺 伝 子 異 常に より 生 ず^る家族 性 欠 陥^{ア ポ B} 血 症 (^{fa mili al} defe cせv e apolipopr otein B^‑1 0 0, F D B) が その原 因となる こ と が知ら れ ている^. 本研 究で は両 疾 患^の遺 伝 子 異 常 を検 討 する た め に, 近 年 点 変 異^を高 感 度^に検 出^できる新^しい方 法 と^{し て}注 目^{さ れ ている P C R} 変性 剤 濃 度 勾 配^ゲル電気 泳 動 (^{P C R･de n atu rin}g g^{r a}die ntgel ele ctr opho r e sis, P C R^‑D G G E) 法 を 用^いて以下の検 討 を行^った^. まず 臨床 像^{か ら F H ホモ}接 合 体^と考 えら れ た 5症

例^{と その}家 族 を 対象と し, そ^のL D し R遺 伝 子^の仝^エク^{ソ ン}お よ びプ^{ロ モ ー} タ ^ー 領 域^の遺 伝 子 異常^の有 無 を 検 討し た. 明ら か とな^っ た遺 伝 子 変 異に^ついて は, P C R制 限 酵 素切 断 多型 (^{P C R･r e Strictio n fra}gm e ntle ngth polym o rph is m, P C R^‑R F L P) 法 を用

いて独 立し た 2 0 1家系^{のF H ヘ テロ}接 合 体を対 象と し頻 度調 査を行^っ た^. 次に臨床 診 断さ れ た F H ^ヘテロ接 合 体2 0 0症 例に お^い てap^o B^‑1 0 0遺 伝 子^{コ ドン}3 4 5 6 か ら 3 5 5 3 に おけ^る遺 伝 子 異 常^の有 無 を^{P C R‑D G G E} 法 を用^いて検 討^{し た. F H ホモ}接 合 体^{に お}け る検 討^の結 果, 2家 系に お^いて, L D し R遺 伝 子^エクソ ン1 7の7 9 0番 目^のア ミ^ノ酸リ ジ^ンを^{コ ー} ドする^コ ドンA A G が停 止^コ ドン であ^{る n G へ と}変化 す^る変 異, K 7 9 0 Ⅹを 見^{い だ し た. FI i}患 者^にお ける頻 度 調 査^の結 果, この変 異^{は 2 0.9 %} と高 頻 度^に認^{め ら} れ, 北 陸地 方^のF H に おける普 遍 的 遺 伝 子 変 異 (^{c o m m o n m utatio n}) と考 えら れ た^. また別^の1家 系に お^いて, L D しR遺 伝 子^エ ク^{ソ ン}5^の2 4 5番日^のア ミ^ノ酸ア^{ス パ}ラ ギ^ン酸 をコ ^ー ドするコ ド^ンG A T が ア ミ^ノ酸ア^{ス パ}ラ ギ^ンをコ ^ー ドするコ ド^ンである A A T ^へと変 化 す^る新たな 変 異, D 2 4 5 N を見^いだ し, F H Naha と命 名し た^. この他 既に報 告さ れ^{て い} る2つ の ミスセン ス変 異 (Ⅳ2 3 Ⅹ と P 6 64 I) ^{, お よ び 3 つ のサ イ レント}変 異 (^{C 2 9 2 C, P 5 1 8 P, V 6 3 2 V}) を そ^れぞれ見^いだ し た^. P C R D G G E 法に て異 常バ ン ドを 呈し た仝エクソ ンに D N A塩 基 配 列^の変 異^を認め た こ と か ら本 法^の有 用性^が示 唆^{さ れ た. a}p^o B^‑1 0 0遺伝 子 異 常^{につ いての} 検 討で は, 今 回対象^{と し た}領 域に遺 伝 子 変 異^は認め ら れなかっ た^. E 7 9 0 Ⅹ お よ び FIi Nabaを 含^め, 合 計1 1種^のL D しR 遺 伝 子 変異に より, 北 陸 地 方^{のF H} 患 者^{の3 8.8 % が}説 明^{さ れ た. 一} 方, 日本 人^{に お}ける遺 伝 性 高^{L D I/C 血}症の原 因と し て F D B は極 め て低^い頻 度と考 えら れ た^.

鮎_y w o rds fa m ilial h_{y p}e r ch ole ste r ole mia,fa milial defe ctiv e ap^oli_pop^{r o}tein B^‑1 00, de n atu ring g^{r a}die nt g^elele ctr opho r e sis

,lo w de n si_{t y}li_pop^{r o}tein r e c ep t^{o r},g^{e n e m u}tatio n

近年 高^コ レ ステ^{ロ ー} ル血症, 特に高 低比 重リ ボ蛋 白^{コ レ ス}テ ロ^ー ルq^{o w de n si}t ylipopr otein chole ste r ol, L D IJC) ^血症が冠動 脈硬化症 発 症^の主 原 因^であ り, L D しC 低下療 法に よ る冠 動 脈硬 化症の ^一 次 予阻 ^{二次 予 防効 果が明}ら か に さ れ てきた¹⁾²⁾.

遺伝 性 高L D しC 血症で は幼 少 時^より 高L D しC 血症が持 続し,

早発性 冠動 脈 硬 化 症が高 頻 度に発 症 する. 現 在 まで に低 比 重リ ボ蛋白受 容 体 q^{o w de n si}t yli_pop^{r o}tein r e c ep t^{o r,} L D I:R) ^{お よ び} ア ポリ ボ蛋 白BT^{l O O(a}p^oli_pop^{r o}tein B^‑1 0 0, apO B^‑1 0 0) ^の遺 伝 子 異常^が遺伝 性 高Ⅰ血 しC 血症の原 因^となる こ と が示^{さ れ て お}り³⁾⁴⁾,

遺伝子^{レ ベ ル}で^これを 同 定 す^{ること に よ}り 遺伝 性 高^{L D しC} 血 症 を確定 診 断し, 早 期^{か らのコ レ ステロ ー ル}低^下療 法を開 始 する ことが でき^る.

L D しR 遺伝 子 異 常に より 生 ずるのは家 族 性 高^{コ レ ス}テ^{ロ ー ル}

血症 (^{fa milial h}y p^{e r c}hole ste r ole mia, F H) ^である³⁾. 本症^は幼 少 時 斯か らの高L D し C 血症と, アキ レ^ス臆 をは じ め とする腱 黄 色 腫⁵⁾, お よ び早 発 性 冠 動 脈 硬 化 症^{6)を 3} 主 徴と し, 常 染 色 体 優 性 遺 伝 形 式を と る^. 遺 伝 子の変 異に よ り L D し R に構 造 異 常 もしくは欠 失が起^{こ っ}た結 果^{7) 別}, 低 比 重リ ボ蛋 白 (^{lo w} de n si_{t y} li_popr ot_ein

, L D L), お よ び中 間 比 重^{リ ボ}蛋 白 (inte r med iate de n si_{t y}li_pop^{r o}tein) が 血中で増 加 する^3). L D L^‑ R 遺 伝 子^の対 立 遺 伝 子^の両 方^に異 常^があ^{る ホモ}接 合 体^の頻 度 は約1 0 0万人 に 1 人であ り, 有 効な治 療が行わ れ なけれ ば平均 2 6歳で全 例が心 臓 死 を 遂 げる⁹⁾. 対 立 遺 伝 子^{の 一} 方^{のみ に}異 常がある^ヘ テ^ロ接 合 体^{は 一} 般人 5 0 0人に 1 人以 上と極め て高頻 度に存在^し, 若 年性 冠 動 脈 硬 化 症^の主 要 な原 因疾 患である. し た が^っ て F Ⅲ を早 期に確 定 診 断し, 最 適な時 期^より 治 療^{1)2)1 0)}を

平成10 年9 月²⁹ 日受付^, 平 成^{1 0}年^{1 1}月² 日受 理

A bbr evi ati o n s : ap^o B^‑1 0 0_, ap^Oli_pop^{r o}tein B^‑1 0 0_; b_p,ba s e pair; F D B_,fa mili al defe c伽e ap^oli_pop^{r o}tein B^‑10 0_; F H,

払milial h_{y p}e r chole ste r ole mia; H D L,high ^{de n si}t yli_pop^{r o}tein;H D I]C, high ^{de n si}t yli_pop^{r o}tein ch ole ste r ol_; L DL ^{lo w} de n sity ^lip^op^{r o}tein;I D IJC,lo w de n si_{t y}lip^op^{r o}tein chole ste r ol;I D I)R ,lo w de n si_{t y}lip^op r^otein r e c ep t^{o r};P C R^･D G G E,

開 始 する こ と が生命予 後^の改 善^につなが る と考 え^{ら れ る.} 特 に黄 色腫や家 族 歴が確 認できな^い症 例に は, 遺 伝 子 診 断が必 要 不 可 欠^であ^る.

Y am am OtO ら^{1 1)}に より^ヒトⅠ^一D しR 遺伝 子^のcD N A が ク^{ロ ー ニ ン} グ さ れ て以 来, 本 症に対 する遺 伝 子レベ ルでの検 討が 可能に な

っ た^. 以 後 報告さ れ た Ⅰ皿 しR ^の遺伝 子 変 異 数^{は 1 9 9 2}年^{のHob bs}

の総 説^{で は 1 5 0}種 類に 上り^{1 2)}現在で は 4 00種を越 えて^いる^13). L D しR 遺 伝 子 変 異^{の ス}ク リ ^{ー ニ}ング お よ び確 定^{のた め に}ま ず サ ザ ^ンブ^ロツ テ^{ィ ン}グ法¹⁴⁾を中 心と し た技 法が用^い ら れ てき

た^. 当 科に お^いても^K頑^{n a mi ら1 5卜1 8)が サ ザンブロツティ ング}

法に て F H To n a mi^‑1, F H To n a mi^‑2, F H O kaya m a

, F H

Ea n a z a w a^‑1 の遺 伝 子 異 常 を 確 定 し^{た. し か し サ}ザ^ンプ^ロ ツテ

ィ ング法で変 異が確 定さ れ た^の は全 症 例^の1 0 数% ^のみ であり,

こ の方 法^{で は}見^い 出せな^い数 塩 基 対 以 内^の小 変 異が残る約 9 0 % を 占^{め る と}考^{えら れ ていた.}

1 9 8 9 年^のP C R ^{‑ 一} 本 鎖構成 体多型 (P C R^‑Single str a nd

c o nfo r m atio n alpol ym ^{O r}phis m , P C R,S S C P) 法^{Ⅰ9卜 2 3)の出 現に よ} り, 遺伝 性 疾 患に おける遺 伝 子 異 常^の検 討が ^一気に加 速し た^. 当 科^でも八木^{お よ び}東 方^{が F H の L D し R} 遺 伝 子 変 異^の検 索に P C R^‑S S C P法 を導^入し, 5^つの新たな 遺伝 子 変 異F H Ts u r uga,

F H Ka n a z a w a^‑2, F H N an a O, F H Yokote, F H M o riokaを 確 定 し た^{24)25 ).} しか し こ れ らを あ^{わ せ て}も 北 陸 地 区^{のF H の}う ち 1 7.5 % を 説 明しうる に過 ぎ な^い. 以上 の結 果は F H に おける L D I:R遺伝^{子 変 異の}多様 性 を 示 唆 す^{る と と}もに, P C RTS S C P 法

に て遺 伝 子 変 異が突 き止め ら れ な^い症 例が数多く 存 在^{し ている} 可能 性^を示^{し ている. し た がっ て}, より 検 出力^の高^い遺 伝 子 変 異^スク リ ^{ー ニ} ング法^の確^{立が求め ら れ ている.}

F H 同様^に遺 伝 性 高^{L D し C} 血 痕 を きたすap^o B^‑1 0 0 遺 伝 子 異 常 症と し て家 族 性 欠 陥^ア ポ B 血症 (^{fa milial defe ctiv e}

ap^olipopr otein B^rl O O, F D B) ^がある^4). 血中^のL D L は, その蛋 白 成 分であるapo B^‑1 0 0 が¹) ガ^ン ド と し て働^{いて L D しR と}結 合 し, 細 胞 内に取 り 込 まれ る^. F H で は L D L R遺 伝 子 変 異^{に よ}り 高L D しC 血症^{が 生}ず^{る が},

一 方^{l) ガン}ドであるap^o B^‑1 0 0側^の 遺 伝 子 変 異に よ る高L D し C 血 症が F D B である^. So ria ら²⁶⁾は,

ap^o B^‑1 0 0の3 5 00番目^{のア ミノ}酸^{に おいて アルギニ ンか ら グル} タ ミンヘ の置 換が高L D L C 血症 を きたす^こと を 明^{ら か に し た.} こ れ が F D B R 3 5 0 0Q ^である. F D B は常 染 色 体 優 性 遺 伝 形 式 を 示

す 黄 色 腫 を 伴っ た高L D しC 血症 を 呈し, 早 発 性 冠 動 脈 硬化 症を き^たす^{な ど}臨 床 像^{は F H と}同^一 で, そ^の診 断はap^o B^‑1 0 0遺伝子 変 異^の同定に よ^っ て成さ れ る^. F D B R 3 5 0 0Q ^は白 色 人種で は^→ 般 人口 5 0 0 人 に 1 人と F H に匹敵 する頻 度で確 認さ れて いる^2刀.

我^々は馬 渕ら^の診 断基 準^{2別に よ}り 臨 床 像^{か ら F H と}診 断さ れ た独 立し た 3 5 0 家 系 を 対 象と し て, P C R^一利 限 酵 素 切 断多型 (P C R,r e Strictio n fragm e ntle ng th pol ym O rPh is m, P C R^‑R F L P)

に よ る^スク リ ^{ー ニ ン}グを 行^{っ た が}, F D B R 3 5 0 0Q ^{は 1}例 も認め ら れな^{か っ た2 9).} し か し F D B に は R 3 5 0 0Q 以外に R 3 5 31 C,

R 3 5 0 0 W な どの報 告^{3 0)3 1)}があり, 未 知^の変 異 も含め て 鮎 50 0Q以 外^のapo B^‑1 0 0遺 伝 子 変 異が 日本 人 遺 伝 性 高L D L^‑C 血症^の原因 と なっ て^い る可 能性^があ^{る. し た がっ てa}po B^‑1 0 0の新た な遺 伝 子 変 異 を 検 出できるスク リ ^{ー ニ} ング法^の確 立が必 要である^.

点 変 異^の新^しい検 出 法^{と し て}, P C R 変 性剤 濃 度 勾 配ゲル電気 泳 動 (^{P C R‑de n atu ring gr ad ie nt gel ele ctr oph o r e sis, P C R･} D G G E) 法^が非 常^に有 用^である こ と が最 近 報 告さ れ た^. 本法は P C R^‑S S C P 法に比^べ, 検 出 力お よ び再 現 性^の点^で優^れており,

P C R^‑S S C P法で検 出 困 難であ^っ た点 変 異が P C R^‑D G G E 法で は検 出 可 能であ^{っ た との}報 告^が多く な^{さ れ ている32 卜 35)}

本研 究で は遺 伝 性 高L D しC 血 症を呈し臨床 的に F H と診 断^さ れ た患 者 を 対 象と し て P C R^‑D G G E法 を 用^{いて L D IJR お よ びa}po

B^‑1 00 遺伝 子 変 異^の検 出 を 行^い, そ^の有 用 性を検 討し た^. 対 象 及 び 方 法

Ⅰ. 対 象

F H ^ヘ テ^ロ接 合 体^の診 断^は, 馬 渕^らの診 断 基 準²⁸⁾, すな わち 1) ^血清 総コ レ ス テ^{ロ ー ル}(^total chole ste r ol, T C) 2 3 0m g/^{dl 以}

上 で腱 黄 色 腫 を 認^{め ること}, .

2) ^一 親 等に本 症があ り, T C 2 3 0m g/dl 以 上 であること, の いずれ かを 満 足 す^るも^{のと し た･} F H ホ^モ接 合 体^の診 断^は血 清^{T C} 値, ア キ^{レ ス}腱 黄 色 魔^の程度,

家 系 調 査な どの臨 床 像か ら行^っ た^{. こ}れ ら F H 症 例 を^以下^の 3 つに分 け, そ れ ぞ れの検 討^の対 象と し た^,

1^. 臨床 診 断さ れ た F Ii ホ^モ接 合 体⁵症 例 (表¹) ^{に お}けるL D し R遺伝 子 変 異^の検 討

2^. 臨床 診 断^{さ れ た F H ヘテロ}接 合体^{1 6 0}家 系2 0 0 症例に お け るapo B^‑1 0 0 遺 伝 子^コ ドン3 4 5 6 か ら 3 5 5 3 に お け る遺 伝 子 変異^の 検 討

Tablel. Clini_{c a}l data ofthep^at ints wit h ho m o zy go u sfa mi^lial h y p^erchole str ole mia

諾^:f, 諾^{) Se x (}品^{) (}品⁾ 蒜呂 芯 ^{I H D Co n s a nguln lty}

几 冊 息 且 Y M M Y C H

/

b 2 4 3 0

つ J

4

つ J

1 5

M M F F F

n フ

0 5 4 3 8 0

つ J

8 3 5 5 5 5 5

̀U

1

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リノ

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4 2 2 つ

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3 つ

]

T h ick T b ick T h ick No tt h ick

T C A A BG

=

P C

T h ick C A B G

0 0 0 0 0 N N N N N

M, m ale;F,f bm ale; TC,tOtal chole ste r ol; TG,tri gly^{c e r}ide; HD L^‑C, high ^{density li popr otein choles t e r ol; A T T,Ach i lle s}

te ndo nt hickn e s so n X^‑r ayfilm; T h i^ck_,equ al t^{o o r m o r e}than 9 m m; Not th ick,le s st ha n9 m m;IH D_,is che mic he ar td is e a s e;

‑

,lo ad n eg^{ativ e;}P T CA ,Pe r C u t a n e O u S tr a n Sl_{u m}in alc o r o n a ry ^{a n}g^{l O}P^{la s ty ;} CA BG, C O r O n a ry ^{art e r}y b y p^{a s s}g^{r a}fting ; N^o,nO C an S a ng^{u l n lt}y^･

All valu e s w e r eobtain edduringp^{r e‑t r e a}tm e nt p^{e r}iod･

p c R de n aturing g^{r a}die nt g^el ele ctr opho r e sis; P C R^･R F L P, P C R r e stricdo n frag ^{m e n}tle ng也p^olym ^{O r}Phis m ;P C R S S C P^, P C R singl^{e str an} d c o m fo rm atio nal p^o吋^{m o r}ph i$ m;T C,tOtal chole ste r ol;T G,tri g ly^{c e r}ide;

′n n,mid_point t^{e m} p^{e r a}tu r e