序 文
血中（1→3） -
β-D-グルカン（
β-グルカン）測定は
リムルス反応を応用した深在性真菌症の補助診断 法の一つであり，早期診断や治療効果判定に有用 である
1）．本邦の臨床現場では， 主にアルカリ前処 理−発色合成基質カイネティック法（ファンギ テック G テスト MK，生化学工業，東京） ，希釈加
改良アルカリ前処理法を用いた血中（1→3） - β -D-グルカン測定法の 基礎的検討
1）川崎医科大学呼吸器内科，2）長崎大学医学部歯学部附属病院検査部，3）生化学工業株式会社中央研究所，
4）東京都立駒込病院臨床検査科，5）長崎大学大学院医歯薬学総合研究科感染分子病態学講座
吉田耕一郎
1）二木 芳人
1）松田 淳一
2）平潟 洋一
2）小田 俊男
3）明田川 純
3）大林 民典
4）河野 茂
5）岡 三喜男
1）（平成 17 年 3 月 14 日受付）
（平成 17 年 5 月 13 日受理）
血中（1→3）-β-D-グルカン測定は深在性真菌症の補助診断法の一つであり，早期診断や治療経過観察に 有用である．これまで本邦では 5 つの測定キットが臨床使用可能であったが，アルカリ前処理−発色合 成基質カイネティック法を用いるファンギテック G テスト MK が簡便性や検体処理能力の高さから頻 用されている．しかし近年，本キットと他キットで測定値および判定結果に不一致を生じる検体や，本 キットの偽陽性と判断される症例のあることが指摘されていた．その原因の一つに本キットで比較的高 率に認められるβ-グルカンによらない非特異反応が指摘されてきた．今回，本キットで用いる前処理液 の組成を再検討し，KOH 濃度を下げ，塩濃度を高めることにより，非特異反応出現頻度を大幅に低下さ せることに成功したので報告する．改良アルカリ前処理液では，血漿ならびに血清への標準β‐グルカン
（パキマン）の添加回収試験において，80〜120％ と現行法と同様の良好な回収率が得られた．また改良 法による前処理後には検体由来の非特異的なアミダーゼ活性は検出されなかった．臨床検体の血漿 200 検体中，現行法では 139 検体で非特異反応がみられ，そのうち 7 検体でカットオフ値（20pg!mL）以上 の数値を示したが，改良法では非特異反応の出現を認めたものは 16 検体，カットオフ値以上の数値を認 めたものは 1 検体に減少した．同様に血清 170 検体中，現行法では 106 検体で非特異反応が認められ，
そのうち 7 検体ではカットオフ値以上の非特異反応が確認されたが，改良法では非特異反応が認められ たものは 22 検体に減少し，カットオフ値を上回る非特異反応を認めたものはなかった．また現行法の真 値と改良法による測定値の間には良好な相関を認めた．改良アルカリ前処理液を用いることにより，非 特異反応による偽陽性が少なくなり特異度が向上することが期待される．
〔感染症誌 79：433〜442，2005〕
要 旨
別刷請求先：（〒701―0192）岡山県倉敷市松島 577
川崎医科大学呼吸器内科 吉田耕一郎
deep seated mycosis，（1→3）-β-D-glucan,Limulusreaction, non-specific reaction Key words：
熱−比濁時間分析法 （
β-グルカンテストワコー，和 光純薬工業，大阪） ，希釈加熱−発色合成基質エン ドポイント法 （
β-グルカンテストマルハ， マルハ，
東京）が使用可能であり，とくにファンギテック G テスト MK は高い感度，簡便性，優れた検体処 理能力などから最も頻用されているキットであ る．しかし近年，本法による血中
β-グルカン測定 において，
γ-グロブリン高値検体や溶血検体など 一部の検体ではアルカリ前処理後に検体の白濁な どによる非特異反応を生じ，偽陰性や偽陽性につ ながる場合のあるこ と が 指 摘 さ れ て き た
2）〜6）． 我々は以前，本法の反応タイムコースの初期と後 期の吸光度変化率から独自の計算式で算出した非 特異反応インデックスを考案し，このインデック スの応用が非特異反応タイムコースの検出に有効 であることを報告した
6）．また筆者らはファンギ テック G テスト MK による
β-グルカン測定にお いて非特異反応相当値を通常測定値から差し引い て補正することで， 本法の特異度が約 10％ 上昇す ることを報告している
7）．しかしこれらの方法論 は， この問題の根本的な解決法ではない． したがっ て非特異反応を発生させない新たな
β-グルカン 測定方法の開発が求められていた．
今回，我々はファンギテック G テスト MK の現 行アルカリ前処理液の成分構成や分量を一部変更 した改良アルカリ前処理液で検体を前処理した 後，
β-グルカンを測定することにより現行法の測 定値との相関性を保ちつつ，非特異反応出現を著 しく減少させることに成功したので報告する．
材料と方法
1．血液検体
1）健常人検体：本研究の趣旨を説明し同意の 得られた健常人ボランティア 15 名（男性 11 名，
女性 4 名）から 2004 年 3 月および 7 月に採血して 得た血清ならびに血漿を用いた．
2）臨 床 検 体：
!川 崎 医 科 大 学 附 属 病 院 で 2002 年 1 月から 3 月の期間に深在性真菌症の疑 い，あるいは治療経過観察目的で
β-グルカン測定 が行われた 232 名の凍結保存血漿 584 検体のうち 顕著な非特異反応（14.1〜62.3pg
!mL 相当）を呈す る 24 検体，および非特異反応が認められないか
10pg
!mL 以下の 10 検体，
"川崎医科大学附属病 院で 2003 年 4 月から 6 月の期間に
β-グルカン測 定が行われた 129 名の凍結保存血漿 200 検体，
#長崎大学医学部歯学部附属病院で 2003 年 1 月か ら 5 月の期間に深在性真菌症の疑いで
β-グルカン測定あるいは各種真菌抗原測定がなされた 88 名の凍結保存血清 170 検体を用いた．
2．実験方法
まず，
β-グルカン測定における非特異反応の識 別と
β-グルカン真値の算出方法について述べる．
β
-グルカンによらない非特異反応の出現は，ファ ンギテック G テスト MK の主反応試薬（
β-グルカ ン特異的リムルス試薬）溶液に G 因子活性化阻害 剤
8）（GI）である laminaran oligosaccharides を 10
µg
!mL 以上の濃度で添加して，リムルス反応を完 全に抑制した後に残存する吸光度上昇の有無で確 認できる．すなわち GI 添加条件下で吸光度が上 昇し，数値が算出されることは非特異反応の出現 と判断できる．この数値を GI 無添加の主反応試 薬溶液を用いたときの標準品（パキマン：Poria
cocos
の菌核であるブクリョウから精製された
β-
グルカン）換算値で示し，非特異反応相当値とし た．また GI 無添加条件での測定値（見かけ値）か ら上記の非特異反応相当値を差し引いた数値を
β-グルカン真値（真値）とした．現行アルカリ前処 理液を用いた場合に GI 添加によってリムルス反 応が完全に抑制されることは既に報告した
6）．ま た改良アルカリ前処理液を用いた場合について も，ファンギテック G テスト MK による常法測定 で陽性を示す血漿および血清各 5 検体を改良アル カリ前処理液で前処理した後，反応系に GI を添 加・測定しリムルス反応が完全に抑制されること を確認した（未発表データ） ．
1）非特異反応出現が低頻度となる改良アルカ リ前処理液の開発とその基本性能評価
（1）アルカリ前処理液の改良検討
健常人ボランティア血漿に
γ-グロブリン（献血 グロベニン−I−ニチヤク，日本製薬，東京） ，およ び ヘ モ グ ロ ビ ン（Hemoglobin，from Human，
Code 080−07301，和光純薬工業，大阪） を添加し，
各 々 6,000mg! dL，1,200mg! dL の 濃 度 に 調 整 し
て非特異反応モデルを作成した．現行アルカリ前 処理液（0.15M KOH-0.3M KCl-20mM EDTA-0.1％
Polybrene） の KOH 濃 度 を 0，0.05，0.10，0.15M と変化させ，また KCl 濃度も 0，0.3，0.6，0.9M と 変化させ，さらに新しく Na
2SO
4を 0，50，100，
200，400mM の濃度で添加した溶液を作成した．
この溶液で非特異反応モデル検体を前処理した 後，主反応時の白濁や非特異的な吸光度上昇が軽 減されるか否かを検討した．またこのうち効果の あった 3 つの改良組成（現行組成の KOH のみを 0.05M としたもの，KOH を 0.05M とすると共に KCl を 0.6M としたもの，KOH を 0.05M とすると ともに KCl を 0.6M とし更に Na
2SO
4を 50mM 添 加したもの）の有効性を，2002 年 1 月〜3 月に川 崎医科大学附属病院で
β-グルカンが測定された 232 症例， 584 検体のうち非特異反応が特に著しい 24 検体（血漿）を用いて検証した．
（2）改良アルカリ前処理液による前処理済み検 体中の残存アミダーゼ（合成基質水解）活性
健常人血漿 3 検体，健常人血清 2 検体，それぞ れに
γ-グロブリンを 6,000mg
!dL の濃度で添加し て作成した検体，および川崎医科大学附属病院で 2002 年に採取された臨床検体のうち，検体中の
β-グルカン値が 21.0pg
!mL 以下で非特異反応の 認められない 3 検体を無作為に抽出して本検討の 材料に用いた． 改良組成中の KOH 濃度のみを 0，
0.03，0.04，0.05，0.15M と変化させた前処理液を 調製しこれらで検体を処理した後，主反応試薬か らカブトガニ血球ライセートを除いた試液を添加 し，残存する非特異的アミダーゼ活性による合成 基質水解活性を測定した．
（3）標準
β-グルカン添加回収試験健常人血漿（6 検体）と健常人血清（6 検体） ， 更に川崎医科大学附属病院で 2002 年に採取され た臨床検体のうち，検体中の
β-グルカン値が 21.0 pg
!mL 以下で非特異反応の認められない 5 検体 を無作為に抽出し，本検討の材料に用いた．これ らの検体に 20pg
!mL の濃度となるように
β-グル カン標準品（パキマン）を添加し，現行あるいは 改良アルカリ前処理液で処理した後，
β-グルカン 値を測定し添加回収率を算出した．
（4）
γ-グロブリン，ヘモグロビン，ビリルビン，
乳びの影響評価
健常人血漿 1 検体，および健常人血清 1 検体に，
γ
-グ ロ ブ リ ン を 0，1,500，3,000，6,000，9,000，
12,000mg! dL の濃度で，ヘモグロビン（Hemoglo- bin，from Human，Code 080―07301， 和 光 純 薬 工 業， 大阪） を 0，300，600，900mg
!dL の濃度で，
ビリルビン（Bilirubin，Code 020―01761， 和光純薬 工 業，大 阪）を 0，2.5，5，10，20，40，80mg
!dL の濃度で，静注用脂肪乳剤（イントラリピッド，
Fresenius Kabi AB）を 0，0.025，0.05，0.1％ の 濃度でそれぞれ添加し，本検討の材料に用いた．
これらの検体に現行および改良アルカリ前処理液 で前処理を行った後，GI 含有主反応試薬溶液を添 加し，反応タイムコースを観察するとともに非特 異反応相当値 （標準品パキマン換算値） を求めた．
2）現行および改良アルカリ前処理液を用いた 検体前処理による臨床検体中
β-グルカン測定に おける非特異反応出現の比較検討
川崎医科大学附属病院で 2003 年に採取された 血漿 200 検体と長崎大学医学部歯学部附属病院で 採取された血清 170 検体を，現行アルカリ前処理 液および改良アルカリ前処理液で前処理した後，
GI 無添加条件ならびに GI 添加条件下で
β-グルカ ンを測定した．算出された実測値および非特異反 応相当値を比較検討し，非特異反応出現頻度に及 ぼす前処理液の影響についても検討した．
成 績
1．非特異反応出現が低頻度となる改良アルカ リ前処理液の開発とその基本性能評価
1）アルカリ前処理液の改良検討
非特異反応モデルを用いてアルカリ前処理液組 成 を 種 々 検 討 し た 結 果，現 行 前 処 理 液 組 成 の KOH 濃 度 を 0.05M に，KCl 濃 度 を 0.6M に 設 定 し，これに 50mM の濃度で Na
2SO
4を添加した場 合に非特異反応の出現が最も減少した．この組成 を含めて効果の高かった 3 種の改良組成の有効性 を，非特異反応が著しい臨床検体 24 検体（血漿）
を用いて検証した結果，これらの臨床検体でも上
記組成使用時に最も高い非特異反応出現抑制効果
が認められた．現行アルカリ前処理法を用いた場
Fig．1 Amidolytic activity in plasma or serum after pretreatment.
The concentration of potassium hydroxide in the improved pretreat- ment solution was varied. Types of plasma or serum in each experi- ment are as follows：a）normal plasma #2（○）, normal plasma #2 plus γ-globulin（●）, normal plasma #7（△）, normal plasma #7 plusγ-globulin
（▲）, normal plasma #8（□）and normal plasma #8 plusγ-globulin
（■）；b）normal serum #3（○）, normal serum #3 plusγ-globulin（●）, normal serum #4（△）, and normal serum #4 plus γ-globulin（▲）；c）pa- cient plasma #112（○）,patient plasma #319（△）,and patient plasma
#385（□）.
Pretreatment Patient
plasma Current Improved 112.3%
115.3%
＃ 570
112.3%
120.6%
＃ 425
120.0%
118.8%
＃ 385
106.0%
107.5%
＃ 112
90.6%
100.9%
＃ 319
108.3%
112.6%
Ave
11.0%
8.2%
SD
Plasma or serum was pretreated with the current or improved reagent after addition of pachyman.
Pretreatment Normal
serum Pretreatment
Normal
plasma Current Improved Current Improved
83.3%
98.7%
S1 90.4%
102.2%
P1
87.6%
82.0%
S2 101.1%
92.6%
P2
88.9%
88.4%
S3 102.0%
104.9%
P3
85.8%
80.0%
S4 90.2%
98.7%
P4
86.0%
85.0%
S5 96.2%
103.7%
P5
80.5%
84.6%
S6 80.3%
92.0%
P6
85.4%
86.5%
Ave 93.4%
99.0%
Ave
2.8%
6.1%
SD 8.2%
5.6%
SD
Table 1 Recovery of standard（1 → 3）-β-D-glucan, pachyman, added to plasma or serum
Table 2 Interference with（1 → 3）-β-D-glucan measurement by other substances
Value of non-specific reaction（pg/mL）
Substance added Plasma Serum
Improved pretreatment Current
pretreatment Improved
pretreatment Current
pretreatment
＜ 3.9
＜ 3.9
＜ 3.9
＜ 3.9
0
γ-Globulin（mg/dL）
＜ 3.9 6.6
＜ 3.9 6.3
1,500
＜ 3.9 10.2
＜ 3.9 12.3
3,000
＜ 3.9 38.7
＜ 3.9 40.8
6,000
＜ 3.9 12.9
＜ 3.9 22.6
9,000
＜ 3.9
− 12.4
＜ 3.9
− 16.3 12,000
＜ 3.9
＜ 3.9
＜ 3.9
＜ 3.9
0
Hemoglobin（mg/dL） 300 14.7 6.0 14.3 6.4
14.3 27.5
11.4 24.8
600
20.5 59.4
18.5 45.9
900
＜ 3.9
＜ 3.9
＜ 3.9
＜ 3.9
0
Bilirubin（mg/dL）
＜ 3.9 4.7
＜ 3.9 4.3
2.5
＜ 3.9 5.6
＜ 3.9 5.3
5.0
6.1 9.3
4.6 7.5
10.0
8.5 11.4
5.9 9.3
20.0
10.6 16.4
8.8 13.7
40.0
13.0 21.7
11.1 22.4
80.0
＜ 3.9
＜ 3.9
＜ 3.9
＜ 3.9
0
Intralipid（%） 0.025 ＜ 3.9 ＜ 3.9 ＜ 3.9 ＜ 3.9
＜ 3.9
＜ 3.9
＜ 3.9
＜ 3.9 0.05
＜ 3.9
＜ 3.9
＜ 3.9
＜ 3.9 0.1
合，24 検体中非特異反応相当値 20pg
!mL 以上が 16 検体，10〜19.9pg
!mL が 8 検体に認められてい たが，この改良組成 で は 10〜19.9pg
!mL が 1 検 体，3.9〜9.9pg
!mL が 13 検体で，残りの 10 検体は 3.8pg! mL 以下へと著明に減少することが確認さ
れた．以下の成績にはこの 0.05M KOH-0.6M KCl- 20mM EDTA-0.1％Polybrene-50mM Na
2SO
4の 改 良組成を用いた実験結果を示した．
2）改良アルカリ前処理液による前処理後の検
体中残存アミダーゼ（合成基質水解）活性
Table 3 Incidence of non-specific reaction in the measurement of（1 → 3）-β-D-glucan Improved pretreatment Current pretreatment
Non-specific reaction
（pg/mL）
Sample Medical
facility Samples % Samples %
92.0 30.5 184
61 0―3.8
Plasma samples
（200）
Kawasaki Medical School Hospital
7.5 54.0 15
108 3.9―9.9
0.0 12.0 0
24 10.0―19.9
0.5 3.5 1
7 20.0 ＝＜
87.1 37.6 148
64 0―3.8
Serum samples
（170）
Nagasaki Univ.
Hospital
11.2 45.9 19
78 3.9―9.9
1.8 12.4 3
21 10.0―19.9
0.0 4.1 0
7 20.0 ＝＜
Table 4 Incidence of false positive and false negative cases in Fungitec G test MK Improved pretreatment Current pretreatment
Sample Medical
facility Apparent content Apparent content
20 ＜
＝＜ 20
（pg/mL）
20 ＜
＝＜ 20
（pg/mL）
Plasma samples
（200）
Kawasaki Med. School Hospital
3 147
＝＜ 20 Real
content 15
137
＝＜ 20 Real
content 20 ＜ 0 48 20 ＜ 0 50
20 ＜
＝＜ 20 20 ＜
＝＜ 20 Serum
samples
（170）
Nagasaki Univ.
Hospital
0 44
＝＜ 20 Real
content 4
41
＝＜ 20 Real
content 20 ＜ 0 125 20 ＜ 0 126
健常人血漿および血清，
γ-グロブリン添加血漿 および血清，臨床検体のいずれにおいても，0.04〜
0.05M の KOH 濃度では，非特異的なアミダーゼ 活性は検出されなかった（Fig. 1） ．
3）現行および改良アルカリ前処理液使用時の 標準
β-グルカン添加回収試験成績の比較
改良アルカリ前処理液使用時の回収率は，Ta- ble 1 に 示 し た よ う に い ず れ の 検 体 に お い て も 80〜120％ であり，現行アルカリ前処理液を使用 した場合と同等の良好な成績が得られた．
4）現行および改良アルカリ前処理液使用時の
γ-グロブリン，ヘモグロビン，ビリルビン，乳びが
β-グルカン測定値に及ぼす影響の比較
現行アルカリ前処理液では，1,500mg
!dL 以上 の
γ-グロブリン添加により非特異反応が認められ たが，改良アルカリ前処理液では 12,000mg
!dL の添加まで
γ-グロブリンによる測定妨害を回避で きた （Table 2） ．またヘモグロビンおよびビリルビ
ンによる非特異反応相当値は，Table 2 に示した ように現行法使用時に比して改良法使用時にはそ れぞれ減少した．一方，イントラリピッドでは調 べた濃度範囲（0〜0.1％）では現行法と改良法も非 特異反応出現による測定妨害は認められなかっ た．
2．現行および改良アルカリ前処理液を用いた 検体前処理による臨床検体中
β-グルカン測定に おける非特異反応出現の比較検討
1）非特異反応の出現頻度
血漿 200 検体において現行アルカリ前処理液使
用時には，139 検体で定量下限値（3.9pg
!mL）以
上の，そのうち 7 検体ではカットオフ値（20pg
!mL） 以上の非特異反応相当値が算出された．これ
に対し改良アルカリ前処理液使用時には，16 検体
で 3.9pg
!mL 以上の，1 検体で 20pg
!mL 以上の非
特異反応相当値が算出された （Table 3） ．このうち
現行アルカリ前処理液では，真値が 20pg! mL 以
下の陰性で見かけ値が 20pg
!mL を上回る偽陽性 が 15 検体認められたが， 改良アルカリ前処理液使 用時には偽陽性を示す検体は 3 検体と少ない結果 であった （Table 4） ．一方，血清 170 検体において は 現 行 ア ル カ リ 前 処 理 液 使 用 時 106 検 体 で 3.9 pg
!mL 以 上 の，そ の う ち 7 検 体 で は 20pg
!mL 以上の非特異反応相当値が算出された．改良アル カリ前処理液では 3.9pg! mL 以上の非特異反応相
当値が 22 検体で算出されたが，20pg
!mL を上回 る非特異反応相当値が算出された検体はなかった
（Table 3） ．このうち非特異反応による偽陽性は現 行アルカリ前処理液使用時に 4 検体認めたが，改 良法使用時には認めなかった（Table 4） ．
2）現行および改良アルカリ前処理液使用時に おける真値と見かけ値の比較
血漿 200 検体と血清 170 検体を，現行アルカリ
Fig．2 Comparison of non-specific reactions between the current and improved pretreatment reagents.Out of 200 plasma and of 170 serum samples, 180 plasma and 60 serum samples containing less than 100pg!mLβ-glucan are shown in these figures. Realβ-glucan contents were obtained by subtracting non-specific from apparent values.
前処理液および改良アルカリ前処理液で前処理し た後に GI 添加条件下と GI 無添加条件下で
β-グ ルカン測定を行い，見かけ値と真値を算出して両 者の関係を Fig. 2 に示した．血漿検体では現行ア ルカリ前処理液を使用した場合，見かけ値が真値 を上回る検体が多く認められたが，改良アルカリ 前処理液を使用した場合には見かけ値は低下し真 値との差が縮小した．一方，血清検体においても 血漿検体に比べて頻度は低いものの，現行アルカ リ前処理液では見かけ値が真値を上回る検体が少 なからず認められ，改良アルカリ前処理液使用に より血漿検体と同様に見かけ値は低下し真値との 差は縮小した．
3）現行アルカリ前処理液使用時の真値と改良 アルカリ前処理液使用時の見かけ値の相関
現行アルカリ前処理液を用いた測定で算出され た真値を X 軸に，改良アルカリ前処理液を用いた 測定で算出された見かけ値を Y 軸にプロットし 回帰分析した結果，血漿検体および血清検体とも に現行法の真値と改良法の見かけ値の間には良好 な相関が認 め ら れ た（0―100pg! mL の 検 体 に つ
き：血 漿：Y＝1.10X＋1.46，r＝0.988，n＝179．
血 清：Y＝1.05X＋0.86，r＝0.969，n＝59．X：現 行前処理液，Y：改良前処理液） （Fig. 3） ．
考 察
ファンギテック G テスト MK においては，血液 検体を従来の前処理液で処理した後に主反応試薬 を添加して反応させる際に，
β-グルカンによらな い非特異的な濁度上昇が認められる場合がある．
これは検体に含まれる蛋白質が前処理段階でアル カリおよび加熱により変性不溶化するとともに，
一部は一旦可溶化した後，主反応試薬により中和
される過程で再び徐々に不溶化してくることが主
な原因と考えられる．そこで，アルカリ濃度を下
げることにより変性不溶化する蛋白質量を減らす
とともに，KCl 濃度を上げることにより緩衝液で
中和した後の蛋白質の溶解度を上げることをねら
い，組成の改良検討を開始した．しかし，検体中
に共存するリポ蛋白質や脂質，あるいは主反応試
薬中のカブトガニ血球ライセート由来の蛋白質成
分なども複雑に相互作用して，非特異反応を生じ
ているようで，良好な結果を得るには試行錯誤を
Fig．3 Correlation ofβ-glucan contens between the current and improved pretreatments.重ねる必要があった．
なお，不溶物形成に関与する検体側の原因物質 がビリルビンや，今回の研究で再確認されたヘモ グロビンおよび
γ-グロブリン以外にないか否かは 今後さらに基礎的検討を行っていく必要が残され ている．また，今回の改良アルカリ前処理液を用 いた基礎検討では，高度のヘモグロビン検体や高 ビリルビン検体など，非特異反応相当量の大きい ものでは，これによる測定妨害を完全には除去す ることが出来ず，正確な値が得られない場合もあ り得るので注意が必要である．しかしながら，2 施設から収集された臨床検体 370 検体の非特異反 応出現に関する検討では，現行検体前処理液のア ルカリ（KOH）濃度を低下させるとともに KCl 濃度を上昇させ，同時に Na
2SO
4を添加する改良 法により，非特異反応出現を著しく減少させるこ とが可能であった．また本改良アルカリ前処理法 でも残存アミダーゼ活性は検出されず，リムルス 反 応 に 影 響 を 及 ぼ す 血 中 セ リ ン プ ロ テ ア ー ゼ
（Xa，thrombin，trypsin など）やプロテアーゼイ ンヒビター（
α1-antitrypsin，antithrombin III，
α2- plasmin inhibitor など）が完全に不活化されてい ることも確認した．
真菌由来の
β-グルカンは多様な糖鎖構造をも つ物質で， リムルス反応の G 因子を活性化する．
G 因子の活性化には
β-グルカンの分子量とともに その高次構造が重要であるとされ，三重らせん構 造の
β-グルカンに比して一重らせん構造のもの はより強力に G 因子を活性化することが示され ている
9）．改良アルカリ前処理液のアルカリ濃度 を現行の 1
!3 程度に下げても，算出された見かけ 値は現行アルカリ前処理液使用時の真値と極めて 高い相関が保たれていた．したがってこの範囲で のアルカリ濃度変更は，臨床検体中の
β-グルカン の高次構造に影響を与えないものと考えられた．
茂呂ら
10）は（1→3） -
β-D-グルカン測定キットを比 較しファンギテック G テスト MK では，真菌感染 症否定群において陽性判定結果の割合が他キット と比べ多いことを指摘している．また堀口
11）は侵 襲性アスペルギルス症の早期診断において，ROC AUC 解析の結果から本法のカットオフ値を 24.9
pg
!mL に設定した場合，診断効率が最も向上する と指摘している．ただしこれらの検討では現行ア ルカリ前処理液を用いて
β-グルカン測定が行わ れているため，材料に用いられた臨床検体の中に は非特異反応を示した検体が含まれていた可能性 を否定できない．
今回の検討から，この改良アルカリ前処理液を ファンギテック G テスト MK による
β-グルカン 測定に応用することによって，非特異反応の出現 が著しく減少することが明らかとなった．これに より本法の特異度が改善され，深在性真菌症の診 断効率も大きく向上するものと期待される． 一方，
臨床的感度が低下しないか，あるいは現在のカッ トオフ値が妥当かどうかなど，今後はさらに臨床 的にも検討を進める予定である．
文 献
1）Obayashi T, Yoshida M, Mori T, Goto H, Yasuoka A, Iwasaki H,et al.：Plasma（1→3）-β-D-glucan measurement in diagnosis of invasive deep myco- sis and fungal febrile episodes . Lancet 1995 ； 345：17―20.
2）稲田捷也，遠藤重厚：リムルス試薬を用いた血中 エンドトキシンおよびβ-グルカン定量における カイネティック法での特異反応と非特異反応の 判別．医学と薬学 1999；42：885―97.
3）森 健，原田和明，松村万喜子：（1→3）-β-D-グル カン測定に及ぼす血漿蛋白の影響．真菌症フォー ラム第 1 回学術集会抄録集，p. 21―2（2000）． 4）吉田耕一郎， 二木芳人， 見手倉久治， 中島正光，
川根博司，松島敏春：測定キット間の血中（1→3）- β-D-グルカン測定値不一致の原因に関する検討．
真菌誌 2001；42：237―42.
5）吉田耕一郎，二木芳人，宮下修行，松島敏春：血 中（1→3）-β-D-グルカン測定法の非特異反応検出 に関する検討．感染症誌 2002；76：754―62.
6）吉田耕一郎，二木芳人，毛利圭二，宮下修行，小 橋吉博，松島敏春：アルカリ処理−発色合成基質 カイネティック法による血漿中（1→3）-β-D-グル カン測定における非特異反応出現とその対策．感 染症誌 2004；78：435―41.
7）吉田耕一郎，二木芳人，毛利圭二，森祐一朗，尾 長谷靖，福田 実，他：血漿中（1→3）-β-D-グルカ ン測定法における非特異反応出現に関する検討．
感染症誌 2005；79：329―40.
8）Tanaka S, Aketagawa J, Takahashi S, Shibata Y, Tsumuraya Y, Hashimoto Y：Inhibition of high- molecular-weight-（ 1 → 3 ）-β-D-glucan-dependent
activation of a limulus coagulation factor G by laminaran oligosaccharides and curdlan degrada- tion products. Carbohydr Res 1993；244：115―
27.
9）Aketagawa J, Tanaka S, Tamura H, Shibata Y, Saito H：Activation of limulus coagulation factor G by several（1→3）-β-D-glucans：comparison of the potency of glucans with identical degree of polymerization but different conformations. J Bio-
chem 1993；113：683―86.
10）茂呂 寛，塚田弘樹，小原竜軌，諏佐理津子，田 邊嘉也，鈴木栄一，他：臨床検体を用いた血中
（1→3）-β-D-グルカン測定キット 4 種類の比較検 討．感染症誌 2003；77：227―34.
11）堀口祐司：侵襲性アスペルギルス症の早期診断 におけるβ-グルカン測定およびガラクトマンナ ン抗原測定法の有用性．感染症誌 2004；78：
566―73.
Evaluation of an Improved Pretreatment Method for the Measurement of（1→3） -
β-D-Glucan in Blood Samples
Koichiro YOSHIDA
1）, Yoshihito NIKI
1）, Junichi MATSUDA
2）, Yoichi HIRAKATA
2）, Toshio ODA
3）, Jun AKETAGAWA
3）, Taminori OBAYASHI
4）, Shigeru KOHNO
5）& Mikio OKA
1）1）Division of Respiratory Diseases, Department of Medicine, Kawasaki Medical School,
2）Department of Laboratory Medicine, Nagasaki University School of Medicine and Dentistry,
3）Central Research Laboratories, Seikagaku Corporation,
4）Clinical Laboratory, Tokyo Metropolitan Komagome Hospital,
5）Department of Molecular Microbiology and Immunology, Nagasaki University Graduate School of Biomedical Sciences
