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Academic year: 2021

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博 士 ( 医 学 ) 深 田 嘉 一

     学位論文題名

ヒ ト 末 梢 血 CD34 陽 性 細 胞 の 赤芽 球 系 への 特異的分化誘導とその脱核機序に関する検討

学位論文内容の要旨

    緒  言

  ヒ ト を 含uiと ん と 砌m孑 ば オ で はhk‑鹸 羇 あ 負frr球 にキ 劾 鴇 在 し な ぃ , こ れIま 骨 蜀 飲 あ 胃 お 蒋 律 聞 尠 舛蝉無 ク終 井ミ 制ピa正 色素陸 赤謝 球が Jb刻 喝 た め で あ る . こ れ ま 翻 滸 髑 執 こ つ い て の 縦 ヨ ま ヒ トJゴ 外 の 動 物I重 のadl lhrを 用 い た も 働 注 流 で あ っ た こtよ 荊 け 五 凱 だ 醪 あ 黼 を 分f蹴 を 均 一 に し て 大 昌 こ 集 め る こ と が 極 め て 困 難 な た め で , な か な カ,宛 功 堕 ま な し 汾 甥 で あ っ た 今 回 櫛 形gで 正 常 ヒ ト 赤 帝 璃 こ お け る 脱 核 髑 讀7) 潟 寸 を 行 う に あた り 、 分f l鴎H轡 ユ 均 一 な ヒ ト 赤 芽 球 を 高砲 勢 矧 這aこ@pI又 す る シ ス テ ム を 確 立 し たこ の シ ス テ ム を 用 い , 彡Hほ 鱒 さ れ る 坊 誘 蜑 競 碌 | 田 包 の 生 彬 黼 釧 生 炊 細 胞 胃 麓 湘 匿 望 詛 子 ¢ 繊 に お よ ほ す 景 簷 を 検 討 し た     材 料 と 方 法

  健 闘 捉 人 にrGCSF5Pg慥 を5日 間 連 口 投 与 し た 後 血 球 分 離 装 置 を 用 しq嵜 齟 血 や よ り 単 核 昧 を 分 離 ・ 搾 改 し 此 重 遭C怯 ナ イ 口 ン ウ ー ル に よ る 付 着 細 観 絃 法a〕 舛 モ ノ ク ロ ー ナ ル 淵 本 ・ 免 疫 謝 生 ビ ー ズ 法を 用 い て 津 嚠 匕 ( 弧 弭 陽 性馳 を 得 た こ ゲ ヌ 弸 包 を10頂 枷11 rIし3.I( ぬ 伽 |6CF.4L脚EPを 含 むf餅 日 啣 覯 争 触 音 地 を 用 い 券 欝 耐 い ザ 冴 異 離 創 ヒ ・ 増 魑 誘 導 を 行 っ た 純f匕 (D叫 陽 慴 綱 包 とfロ 湘 培 養 薩 の 細 餌 よ , 幵 態D缶j擦 例I皿 ニFACS卸 を 用 い た フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 法 に よ る 角 聯 斤 を 施 紜 造 血 育 備圏 皿 趣 ク 定 量 的 停j嘯 こは 2umIEP.50蜘16CF. ヌXmHdL′3. 鬟MnI| くM‐CSF. ヌu怖IlGCSFを 含 む フ ィ ブ リ ン ク ロ ッ ト 法 を 用 い た コ ロ ニ ー 形 嚠 去 を 行 い 検 討 した

  一 方 | 脱f如 〕 始 ま る12日 目 の 細J包 を 用 し 、 , サ イ ト カ イン 虹 ) ,dし6( ニF冫 含 有 お よ ひ 無 含 有 嚠 霞 担鰌 晒 幇 蔀 也 をf佃 捉 し 脱陵 に お い て 血 清 に 含 ま れ る フ イ ブロ ネ ク チ ン や サ イ ト カ イ ンな と 、 ・ の 影 響 を 網 伏 赤 血 球・ 裸 核 の 麓 田 紬 甜 觝 多 を みる こ と で 検 討 し た ま た 細 包 骨格 匪 睡 册 と し て , サ イ ト カ ラ シ ンD・ コ ル ヒ チ ン ・ ビ ン ブ ラ ス チ ンO、 ず れ も 終 〕 農 度5F劭nでi勃 め を 用 し 、 駐 骸 に お け る ア ク チ ン フ イ ラ メ ン ト お よ 斫 制 囓 噺 殳 吉 皿 こ つ い 々 餅H啣 音 含 有 培 地 で 同f為 擬 千 し た 一 尢 赤 芽 球 系 前g臨H胞Iコ オ す る 各 細 黼 儲 聞 害 因 子 の 影 響 め 検 討 を 〔 :R炬 を 最 も 多 く 含 む8日 目 の 細 胞 を 用 い , 液 梱 血 清 含 有 培地 お よ び フ ア プ リ ン ク 口 ット に よ る 半 固 形 暗 地 の 培 養 で険 討 し た     結  果

1.ヒ トQ瑚 剛 伽 胞 砺 弼 球 剰 寺異 的 荊 隗 黼

紺 脚 胞 土 蘓 緒 荊 材 兼 弸 包 か ら な りCD叫 陽 性 萪 よ 呪9% ,36% カ 勺 口 ニ ー を 形 成 し た 紺 ヒQ泓 剛 黌 胞 を12日 脚 蜘 讎 青 含 有 枷 F蹴 養 し 細 初 総 細 包 勘 囀 よ537土 175僧 で あ っ 鋤 ミ こ 堋 餌 よ 劉 姓 耕 噺 ゝ ら な る ′ おIJ・ 創 蹴 と も | こ ヶ 棚 ― 91±4% ガ 瀧 轆 賺Iこ 特・ おIな 麺 耐 亢 原 で あ るayAを う 観21% カ ゛ ゝ コ ロ ニ ー を 形 成 した

― 380 ‑

(2)

2 in vitroで の8嚇如 州齬 多

f鯑 暗 養 後12口 目 の キlrflaを1蝦jし てi給 有 皆H嚠 撒 蹴 諍 粕 甜f轍 こ つ し 丶 て 衡 寸 し た ネ . 圖 撒 は 培 養 をB駘 し て か ら 紐 噺 っI瑚 カ け る‑方azii舫 如 廊 り ↓ 睥 も 約 伽JC: r}JUし7.0 20% か ら4E】 間 で28.5±4.6%1JIl繖 撒 で み る と4日 間 で8.0土1.2僻 瑚 ロ し た裸f亥 につ いても 同係 ケ爛 占Jを示 した

3.8魁亥Iこ おけ るサ イトカ イン ゲ爛 与

  サ イ ト カ イ ン のt越 こ 関 わ ら ず48n綱 目 まd網IF7 u球 ・ 裸 キ 亥 と も ± 勧uを 詔 めtt48B綱 目 脚 織 成 甜 竃 じ ′ こ こO継 田 胞 教 も 減 少 ニ 転 じ , 同 囀 こ 生 細 毎 隣2妨 イ 匳Fを 認 め た こ と か ら , こ れ ら の 減 劣 封 咼 笠 す る 分 裂 嚇 ヒ 瓣 田 胞 栂 齒 彭F嚇 ヒ と な り 死 成 し た た め と 拙 剛 さ れ た 一 方 ,mgmi辮H‑V〕 椡 足 カ 血 球 お よ ひ 朝 駐 ワ 珊 葱 よcnr清 含 有 培Hヒ と 同 じ で あ ル サ イ ト カ イ ン の 有 憮 こ よ っ て も 差 を 認め なかっ た

4.脱 柳キ 聯圖 包胃ヰ 鮒培 吁ア 瑚果

  サ イ ト カ ラ シ ンDをirい たf i‑cci,綱 | 鳬irhR・ 裸 陵 と も 有 意Iyg)JuijiI制 さ れ た 一 尢 コ ル ヒ チ ン ・ ピ ン ブ ラ ス チ ン を 用 し 恫 様 甜 鑄寸 をカ【 反た とこ ろifJJI綾2日 目ま‑耳 |矧fn球と臠 繊aj'Jな増j[]を 言忍 めた が以 繃蜘び 牝 転じ た

s.荊 剛講 細餌 ニおけ る細 胞謝 郤晧薗 ア渤 果

  8日 目 の 細 泡 を 用 い#聞 包 酎 郤 啣 覇 こ っ き 検 討 し た フ ィ ブ リ ン ク ロ ッ ト 法 で はtjl爾 終500以 上 の コ ロ ニ ー を 形 成 し た の にt寸 し 添 1j腓dよ し 噺Lも8倒 :1ヒ のilr毛 肋 ` ら 成 る 赤 弟 柬 系 コ ロ ニ ーt斯 緘 さ れ な か っ た 同fコ 鰍 圉m離 陏 培aLr瑚 〕 衡 ヰ 刊 よ ヌ ヰ 照 洋 で 総 綱 殲7)t{gljc]を 認 め 励lj勃 腓dれ 、 ず れ も 繼 聞 包 鞄 メ 勧 ば 境 鉗 ヰ 臨 |Jさ れ た‑1鰯 軸 粥 謬 鱈I対 イ ト カ ラ シ ンDt6JjuKY:は 多 核rA硼 胞 を 認 ぬ コ ル ヒ チ ン や ビ ン ブ ラ ス チ ンjf<JjuxfrCiよ 核 が 嫋 霜 し た 細 胞 や ヰ ¢ 卿 赫fH泡 ア ポ ト ー シ ス 様 の 変I盤 馳 を 多 数 認 め た     考  察

  械 捫よ ヒト のIE艶 繃蜑Rをin vmo聯 詠こ より剛 財る 方法 を考 案健常 人か ら採 取し 嫦―flr CD34鯔 弛をEP.

rSCF. dL‑3を 用し、 て坊 弧I珂研 糾与 勲飢こ 彡Hヒ・±曽殖させlることで;分イほx皆カ吐争一なヒトの正琳あR芽封畄孫冊包をゴ圃こ´入手することカ嚇と と な っ た こ ゲ 〕細l包j土‑t?is日数ゲ 燗と とも にケH助 も蛍〒 し, 五ニ 鴬ヒト 乍捕 遼で 認め られゐ 魂ぢ 毎日 讀醐 沺髄鰰 ガ司 鰤と1fff上F乎一 ザ〕 分イ ヒ 過 程 を 示 し た こ のin vitroで の 荒 輯 頼 粥 興 的b懺 シ ス テ ム を 用 し 、 , 正 常 ヒ ト 赤 芽f瑚H;f iの めvitroで 矧 卿 笛 拗 醐 甜 鑓 オ を 行 っ た

  高 純 度 の 赤 芽 球 系H田 包 で 脱 陵 を 詔 め , 無 血i幇 笥t皿 こ お い で サ イ ト カ イン の 有 無 に 関 わ ら すW尉 劾Lt Tし た こ とか ら , ヒ ト 正 染 性 赤 芽 球 カ 司 泌 亥 す るI鴛 こサ イ ト カ イ ン や フ ィ ブ ロ ネ クチ ン , マ ク ロ フ ァ ー ジ な ど| ケ ) 食 細胞 をはじ めと した 非赤 芽球系 細胞 の存 在jj研 弼鬢 あるこ と を 明ら カqこし た

  さ ら に ア ク チン フ イ ラ メ ン ト 阻 害 因 子 で ある サ イ ト カ ラ シ ンDカ 司免 孩 を 阻 書 す る こ と か ら ア クチ ン フ イ ラ メ ン ト カ 司 竓 懴ニ rZ要‑である と 考 え た 一 尢 微 ′J堵 阻 害 囚 ヂ で あ る コ ル ヒ チ ン お よ ぴ ピ ン ブ ・ ラ ス チ ンcjuに よ っq臓 鯔 〒 を 認 め た カ ゛ 、 ,2日 目 川 昭 瑚 鑞 , 赤 血 珂 凌やq乗f亥 数¢ 凋沙を 詔め たこ ¢岫 は茄誘 蜑絣 !章 韓田包 を用 し、 た衡 ナ瑚堋 包分 暴め ぢを 全に扛 時I亅さ れて いる ことか ら,亜譛廿生糸芽耐ミカ 減 少す るため と考 えら れた このこ とI暫判 囓ザ 廂ヨ ョ期滸 鄰M甥醪 を件 とな らない こと を示 唆し ている .

    結  語

1.健 常 | か ら 掬 眦Sよ 囃fヒ し あ 財 齟 缸lコ 以 剛 盤 田 勵 、 らa).   rSCF.dL′3を 用 い 、 てin vibo萄 紬 嚇 剰 欄 飢 こ 創 ヒ ・ 増1 2rgし 分 ftj郵 皆カ湛rな ヒト の席 誘琴 顛弸包 を高 荊晒 ロっ1く 量に入 手す るシ ステム を開 発し た

    ー381―

(3)

2こ のt聞餌 #   ‑養 口数 の 経過 と とも に分 化 が進 行 し14日目 には多数の網状 荊血球の出現 を認めた培養 の過程で認め られる綱包よ正 常ヒト′胃髄嬬び)られる赤輯黼1馳麟剛鬪苅J球と7懲ヒ厨q)創b厮ヱを示した

3.高陶蔓 の赤芽球蠧n胞を用いたinrafn帯爺‑cの結 黝`ら,ヒト 赤芽う輔:おける脱隊こはサイトカインやフイフロネクチンおよびマク口 ファージなと'cD‑jj芽毛ぢ街田泡¢耳斎勘研司写であることカミfI 刀した

4.辛I珊包酎甜珊害因Tザ舛鋸劫`ら,アクチンフイラメン卜ケ珂チ在カ弼骸にゼ凄ヨであるカ 、麓ヤ珂チ甜よゼ要翁淋とならなし、ことカ泳された

(4)

学位論文審査の要旨

     学位論文題名

ヒト末梢血 CD34 陽性細胞の赤芽球系への 特異的分化誘導とその脱核機序に関する検討

   ヒトを含むほとんどの哺乳類では成熟循環赤血球に核が存在しなぃ。これは骨髄で赤芽球 系細胞の成熟の終末分化で正染性赤芽球が脱核するためである。これまで脱核機序について の報告はヒト以外の動物種の細胞株を用いたものが主であった。これは、分化の進んだ正常 赤芽球を分化段階を均一にして大量に集めることが極めて困難なためであった。そこで申請 者は、分化段階の均ーな正常ヒト赤芽球を高純度で大量に回収するシステムを、正常ヒト末 梢血CD34 陽性細胞の赤芽球系への特異的分化誘導により開発した。このシステムで得ら れる細胞を解析するとともに、回収された細胞を用いて正常ヒト赤芽球における脱核機序を 検討することとした。健常成人にG ‐CSF を投与した後、血球分離装置を用い末梢血中より 単核球を分離・採取し、比重遠心法、ナイロンウールによる付着細胞除去法、CD34 モノク ローナル抗体・免疫磁性ビーズ法、ペプチド法を用いて純化CD34 陽性細胞を得た。この 細胞をIL − 3 .SCF . EPO を含む液相血清含有培地を用い赤芽球への系特異的分化・増殖誘 導 を行った。―方、脱核の始まる 12 日目の細胞を用い、サイ卜カイン(IL ― 3 ・ SCF . EPO) 含有および無含有の液相無血清培地を作成し、血清のフアブロネクチンやサイ卜カイ ンなどが脱核におよばす影響を検討した。また、細胞骨格阻害因子として、微小管阻害因子 であるコルヒチンおよびビンブラスチン、またアクチンフィラメント阻害因子であるサイ卜 カラシンD を用い、脱核における微小管およびァクチンフアラメントの役割を検討した。さ らに、赤芽球系前駆細胞の増殖に対する各細胞骨格阻害因子の影響をCFU −E を最も多く含 む 8 日目の細胞を用い、液相血清含有培地およびフィブリンクロットによる半固形培地で 検討した。その結果、純化CD34 陽性細胞を12 日間液相血清含有培地で培養した時の総細 胞増加率は 537 倍で、主に多染性赤芽球からなる系列・分化段階ともに均一な細胞集団で あり、 91 %が赤芽球系に特異的な表面抗原である GlyA を発現してぃた。14 日目には形態 的に正染性赤芽球・網状赤血球・裸核を主体とする細胞群に分化した。―方、脱核機序の検 討では、まず無血清培地を用いた検討でサイトカインの有無に関わらず網状赤血球・裸核と も経時的に増加を認めたことから、血清中のフアブロネクチンやサイ卜カインは脱核におぃ て必須の因子ではなぃことが示された。また、サイ卜カラシンD を用いた検討では、網状赤 血球・裸核とも増加が抑制されこの抑制はサイ卜カラシンD の除去により解除されたことか ら、アクチンフィラメントが脱核に重要な役割を果たしてぃると考えられた。さらに、コル

夫 敬

隆  

  正

池 木

小 吉

授 授

教 教

査 査

主 副

(5)

ヒチンおよびビンブラスチンを用い同様の検討を加えたところ添加後 2 日目まで網状赤血 球と裸核の経時的な増加を認めた。以後はプラ卜―に達したが、同時に正染性赤芽球の増加 が抑制されてぃたことから、正染性赤芽球の供給が阻害されてぃるために脱核の進行が抑え られたと考えられ、微小管の存在は脱核に必須ではなぃと考えられた。また、8 日目の細胞 を用いた検討で、いずれの阻害因子の添加におぃても、フアブリンクロッ卜法ではCFU −E コロニーは形成されず、液相血清含有培地では総細胞数の増加は完全に抑制された。これら の阻害因子はぃずれも細胞分裂を完全に抑制してぃると考えられた。以上の結果より、健常 人から採 取した高純 度の末梢血 CD34 陽性細胞を IL ‐ 3 .SCF ・EPO を用いて赤血球系特異 的に分化・増殖させることで、分化段階が均一なヒ卜の正常赤芽球系細胞を大量に入手する ことが可能となったことが示された。また、ヒト正染性赤芽球の脱核の際、サイトカインや フィブロネクチンなどの存在が不要であること、高純度の赤芽球系細胞であるにもかかわら ず脱核を認めマクロファ―ジなどの非赤芽球系細胞の存在は不要であることが明らかとなっ た。―方、細胞分裂におぃてはアクチンフアラメント、微小管はともに必須であるが、脱核 におぃてはアクチンフアラメントの重合が主要な役割を果たしており、微小管形成は脱核に 必須ではなぃと考えられた。

   試問に際し、吉木教授から回収細胞中のGlyA 陰性細胞の種類、微小管阻害因子添加時に 増加が次第にプラト―になる理由、脱核時のアクチンフアラメン卜の分布、既報の脱核機序 との相違点について質問があった。ついで浅香教授から脱核に関するシグナルの発現時期、

種による脱核機序の相違、脱核の意義について質問があった。さらに小池教授から種による 脱核の有 無の理由、 11‑3 ・ SCF ・ EPO を選択した理由について質問があった。最後に第3 内科の武蔵講師から細胞分裂と脱核におけるアクチンフィラメン卜の動態の相違について質 問があった。いずれの質問に対しても申請者は実験結果や文献を引用し概ね適切な回答をし た。

   この論文は、正常ヒ卜赤芽球を高純度で大量に入手可能となるシステムを確立したこと、

およびこれまで定説のなかったヒト赤芽球の脱核について検討を加えたことで高く評価され、

今 後 の 脱 核 機 序 の さ ら な る 解 析 と 脱 核 の 意 義 の 解 明 が 期 待 さ れ る 。

   審査員―同は、これらの成果を高く評価し、大学院課程における研鑽や取得単位なども併

せ申 請 者 が博 士 (医 学 )の 学 位を 受 けるの に充分な資 格を有する ものと判定 した。

参照

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学位授与番号 学位授与年月日 氏名 学位論文題目. 医博甲第1367号

学位授与番号 学位授与年月日 氏名

雑誌名 博士論文要旨Abstractおよび要約Outline 学位授与番号 13301甲第4306号.