博 士 （ 歯 学 ） 森 川 真 衣
学 位 論 文 題 名
Evaluation of protein adsorption to carbon nanotubes for biological use
（ バ イ オ 応 用 に 向 け た カ ー ボ ン ナ ノ チ ュ ー ブ の タ ン パ ク 質 吸 着 特 性 の 解 析 ）
学位論文内容の要旨
【緒言】
カーボンナノチュ ーブ(CNTs) とは炭素六員環から構成されるグラフェンシー卜が同軸管 状の構造をとる代表 的なナノマテリアルであり，機械的・化学的・物理的に優れ，生体親 和性を有することか ら生体材料への応用が期待されている．生体適合性や細胞の分化・増 殖には材料表面への タンバク質の吸着が重要な働きをしていることは広く知られている．
骨 芽細 胞様 細胞 をCNTs 上に播種した場合， 細胞の付着伸展性と ALP 活性 の増加を示すこ とから，夕ンバク質 と CNTs に親和性が存在することが示唆される．本研究では，液体ク口 マトグラフイー法を 用いタンバク質のCNTs への吸着特性を調べ，更にCNTs の形態や純度，
処 理 方 法 の 違 い が 及 ぼ す 影 響 に つ い て 評 価 す る こ と を 目 的 と し た ，
【材料と方法】
1 ． CNTs 試料と各種前処理
試料にはいず れも多層CNT で，小径・低純度 CNTs( 以下N2 ：￠20nm ，曲状，85 ％，Nano Lab.lnc) ，中径・低純度CNTs( 以下C4 ：￠40nm, 曲状，70 ％，CNT Co. ，Ltd) ，および大径・
高純度CNTs( 以下 H7P ：￠70nm, 線状，>99.5 ％，保土谷化学工業）の 3 種類を用いた．各 CNTs に対し熱処理(500 ℃，90 分），或は酸処理（12N HCI ，60 ℃，2 時間，C4 に対しては室 温下で6 時間）を行った後，走査型電子顕微鏡(SEM ：S4000 ，Hitachi) にて形態と不純物の 変化を観察し た，C4 は各処理段階における重量変化測定とェネルギー分散型元素分析 (EDS) を，酸処理H7P はゼー夕電位測定(Delsa nano HC ，Beckman Coulter) を併せて行い，
処理がCNTs に与える変化を評価した．
2 ．夕ンパク質の吸着挙動
未処理，或は処理後のCNTs を担体とし，体積1.6+ x5.Ocrri3 となるようカラム内に充填 した．その後液体ク口マトグラフイー測定を行い，酸性夕ンパク質のアルブミン(pl 値：
−450 ‑
4.9)， 塩 基 性 夕 ン パ ク 質 の り ゾ チ ー ム(pl値 ；10.8)， お よ び 血 清 のCNTsへ の 吸 着 挙 動 を 調 べ た ． 分 出 液 は 紫 外 吸 収 モ ニ タ ー(AC‑5100，Atto Co.， ） を 用 い 波長254nm下 で 検 出 した ． 測 定 はPBSか らNaOH濃 度 を25mMま で 徐 々 に 上 昇 さ せ るlinear gradient法 と ， イ オ ン 強 度 の 低 い 緩 衝 液 か ら 強 い も の へ と 切 替 え るstep wise法 を 用 い て 行 っ た ． 3． 血 清 中 の タ ン バ ク 質 の 同 定
未 処 理 ， 各 処 理 後 のH7Pに 血 清 を 流 し た 際 の ピ ー ク 時 分 出 液 を 透 析 ・ 凍 結 乾 燥 し ， 得 ら れ た 試 料 をSDSポ リ ア ク リ ル ア ミ ド ゲ ル 電 気 泳 動 法 に て 分 離 し た ． さ ら に ， 酸 処 理 H7Pで 添 加 後 速 や か に 分 出 し た 試 料 に 対 し ， 夕 ン パ ク 質 配 列 分 析 ， マ ト リ ッ ク ス 支 援 レ ー ザ ー 脱 離 イ オ ン 化 飛 行 時 間 型 質 量 分 析(MALDI TOF‑MS)を 行 っ た ， 得 ら れ た 分 子 量 よ り UniProtKB夕 ン パ ク 質 配 列 デ ー タ ベ ー ス で タ ン バ ク 質 を 検 索 し た ，
【 結 果 】
1． SEM‑EDS観 察
純 度 の 低 いCNTsのN2，C4で はSEMに て ， ア モ ル フ ァ ス カ ー ポ ン と 思 わ れ る 不 定 形 物 質 がCNT集 合 体 の 繊 維 間 に 観 察 さ れ た が ， 熱 ・ 酸 処 理 を 組 み 合 わ せ て 行 う こ と に よ り 減 少 し た ． ま たEDS元 素 分 析 を 行 う と ， 未 処 理C4で は 触 媒 の 鉄 を 多 く 含 有 し て い た が ， 熱 ・ 酸 処 理 後 は 鉄 が 減 少 し ， 炭 素 の 含 有 率 の 上 昇 が 明 ら か に な っ た ， 純 度 の 高 い H7Pで は ， 繊 維 集 合 体 の 間 隙 に 塊 状 の 不 定 形 物 質 を 認 め た が ， 処 理 に よ り 減 少 し た ． 2． CNTsの 分 散 性
大 径 ・ 高 純 度 の 未 処 理H7Pは 蒸 留 水 に 分 散 性 を 示 さ な か っ た が ， 酸 処 理 後 ， 熱 ・ 酸 処 理 後 と も 分 散 性 は 向 上 し た ． ゼ 一 夕 電 位 測 定 か ら そ れ ぞ れ の 表 面 電 荷 は‑35.27mV，‑48mV で あ っ た ， そ れ に 対 し 小 径 ・ 低 純 度 のN2で は ， 処 理 に 関 わ ら ず 蒸 留 水 に 対 し 分 散 性 を 示 し た ．
3． 液 体 ク 口 マ ト グ ラ フ イ ー 測 定
（1） C4（ 中 径 ・ 曲 状 ・ 低 純 度CNTs)
熱 処 理 ま た は 酸 処 理 の み を 行 っ たC4で は ， 緩 衝 液 の イ オ ン 強 度 を 塩 酸 ま で 強 め て も 分 出 せ ず ， ア ル ブ ミ ン ， リ ゾ チ ー ム と も に 強 い 吸 着 を 示 し た ， 熱 ・ 酸 処 理 を 加 え る と ， ア ル ブ ミ ン は 緩 衝 液 をNaOHに ， リ ゾ チ ー ム で は2M尿 素 ．NaOHに 替 え た 後 分 出 し ， 吸 着 が 弱 く な っ た ．
(2) H7P（ 大 径 ・ 直 線 状 ・ 高 純 度CNTs)
未 処 理 ま た は 酸 処 理 後 のH7Pに は 全 て の タ ン パ ク 質 が ， 添 加 後 速 や か に 分 出 し ， 弱 い 吸 着 を 示 し た ， そ れ に 対 し ， 熱 ・ 酸 処 理 後 で は ，PBS，NaOH下 で も 大 き な ピ ー ク は 認 め ず ， 吸 着 は 強 く な っ た ．
(3) N2（ 小 径 ・ 曲 状 ・ 低 純 度CNTs)
い ず れ の 条 件 に お い て も ，PBS下 で ピ ー ク は 認 め ず ，NaOHで 分 出 し ， 強 い 吸 着 を 示 し た ．
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2． 電気 泳動
コ ン ト 口 ー ル で あ る 希 釈 血 清 で は ， ア ル ブ ミ ン の 分 子 量 の66kDa付 近 に 明 瞭 な ノ ヾ ン ド が 認 め ら れ た の に 対 し ， 未 処 理H7Pか ら の 分 出 液 で は50kDa付 近 に 明 瞭 な バ ン ド を 認 め た ． ま た 酸 処 理 後 のCNTsで ，PBS下 で 速 や か に 分 出 し た タ ン バ ク 質 で は50kDa よ り も 高 分 子 量 の ，NaOH分 出 下 で は50kDaよ り 低 分 子 量 の 位 置 に 複 数 の パ ン ド が 現 れ た ． 熱 ・ 酸 処 理 後 で は ，PBS下 で 分 出 し た タ ン バ ク 質 で50kDa付 近 に 明 瞭 な バ ン ド を 認 め た が，NaOH分 出下 では 明 らか なパ ン ドは 確認 さ れな かっ た ．
4． 夕ン バク 質 配列 分析 ，MALDI TOF‑MS
酸 処 理 後H7Pに 対 しPBSで 速 や か に 分 出 し た タ ン パ ク 質 群 は ， 夕 ン バ ク 質 配 列 分 析 よ りN末 端 からD（ア スバ ラ ギン 酸） ，T（ ト レオ ニン ） ，H（ ヒス チジ ン ），K（リシン ），S（ セ リ ン ） で あ る と 判 明 し ， 主 た る タ ン バ ク 質 は ア ル ブ ミ ン で あ る こ と が 示 さ れ た ， ま た TOF‑MSよ り 検 出 し た 分 子 量 か ら ア ル ブ ミ ン の 他 にa2‑ macroglobulin（167．6kDa） ， ぱansfe″in（77．8kDa），plasIninogen（91．2kDa）の各種 グ口プリンの存在 の可能性が示唆さ れ た ．
【考 察】
（1 ） CNTs の種類の影響
大径・直線状・高純度のH7P が弱い吸着を示したのに対し，小径・屈曲性に富む低 純 度のC4 ，N2 では強い吸着を示した．
(2) CNTs の処理条件の依存性と吸着メカニズム
低 純 度の C4 で は， 処理 によ り吸 着が 弱く なる 傾向 を認め ，同時にSEM ，EDS より 不 純物の減少を認めた．これらの結果より，低純度CNTs の吸着にはアモルファスカー ボ ンの影響が大きいと考えられた，また，大径・直線状・ 高純度のH7P は処理により 吸 着が増大する傾向にあった．ゼ一夕電位測定から，H7P には酸処理後，表面に負電 荷 を帯電していること示されたが，各夕ンパク質はいずれ も4.9 ，10.8 と対照的なpl 値 を有するにも関わらず，類似する吸着挙動を示した．従 ってH7P の吸着は，酸処理 に よるカルボキシル基や水酸基の修飾，或は分子間カや水素結合などの弱い結合が関 与 していることが示唆された．
(2) 夕ンバク質種類の影響
N2 ， C4 ， H7P のい ずれ にCNTs においても，同処理条件下で はタンパク質の吸着挙 ． 動は類似した傾向を示し，夕ンパク質の種類への強い依存性は認められなかった．
また電気泳動において、コント口一ルとなる希釈血清で は66kDa 付近にアルブミン の 明瞭なパンドを認めたのに対して，クロマトグラフイーの分出液では，アルブミン の出 現 位置 が50kDa に現 れた ．この結果より，CNTs による血 清中のタンバク質分解 酵 素の活性化，或はCNTs 自体の触媒作用により，アルプミンが分解され，分子量が小 さ くなる可能性が示唆された．
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【結論】
CNTs へのタンパク質の吸着にはCNTs の径や形 態，そして純度と処理方法が影響す ることが明らかになった．夕ンパク質吸着特性の解明は，CNTs のパイオ応用の際の細 胞増殖・分化のコントロールや生体材料応用への最も基礎的な知見であると考えられ る．
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学位論文審査の要旨 主査 特任教授 亘理文夫 副 査 教 授 網 塚 憲 生 副 査 教 授 田 村 正 人
学 位 論 文 題 名
Evaluation of protein adsorption to carbon nanotubes for biological use
（バイオ応用に向けたカーボンナノチューブのタンパク質吸着特性の解析）
論文要旨
【目 的】カ ーボン ナノチ ュー ブ(CNTs)と は炭素 六員環 から 構成さ れるグ ラフェ ンシー トが 同軸管 状の構 造 をとる 代表的 なナ ノマテ リアル であり ，機械 的・ 化学的 ・物理 的に優れ，生体親和性を有することから生体 材 料 へ の 応 用 が 期 待 さ れ て い る ， 骨 芽 細 胞 様 細 胞 をCNTs上 に 播 種 し た 場 合 ， 細 胞 の 付着 伸 展 性 と ALP活 性 の 増加 を 示 す こ とから ，タン パク質 とCNTsに 親和 性が存 在する ことが 示唆さ れる ，本研 究では ， 液体 ク ロ マ ト グ ラフ ィ ー 法 を 用い ， 各 種 タ ンパ ク 質 のCNTsへ の 吸 着特 性 を 調 べ ，更 にCNTsの形 態や純 度，処 理方法 の違 いが及 ぼす影 響につ いて評 価し た．
【方 法】三 種類の 異なる 径(20，40，70nm)，形態 （曲状 ，線状 ），純 度(70，85，9090)を有す る多層CNTs に対 し 熱 処 理 ， 或は 酸 処 理 を 行っ た ． そ の 後SEM，EDS分 析を行 い，処 理によ るアモ ルフ んスカ ーポン や 金属触 媒の減 少を 確認し た，ク ロマト グラフ ィー 測定で はウシ 胎児血清(FBS)，ウシ血清アルブミン(Alb)， ニワ ト リ 卵 白 由 来リ ゾ チ ー ム(Lys)の各CNTsへ の 吸 着 を 調べ ， さ ら に電 気泳 動と飛 行時間 型質量 分析に てタン パク質 の同 定を行 った，
【結 果・考 察】小 径CNTsは 大径よ り強 い吸着 を示し たが， 共に処 理に より吸 着が強 くなる 傾向 にあっ た．
そ れ に 対 し 低 純 度CNTsで は ， 処 理 に よ り 吸 着が 弱 く な る 傾向 を 示 し た ．低 純 度CNTsの 吸 着 に はア モ ルフ ァ ス カ ー ポ ンが ， ま た 大 径・ 高 純 度 のCNTsに は熱・ 酸処理 によ るCNTs表 面への 水酸基 ・カル ボキシ ル基 等 の 付 与 が 寄与 し て い る と考 え ら れ た ，FBSの ピ ーク 時 分 出 液 の電 気 泳 動 か ら， 分 子 量66kDaであ る主 要 成 分 の ア ルブ ミ ン のバン ドの54kDaへ の遷移 が認め られた ．ア ルブミ ンやグ ロブリ ン群 を含む 高分 子量 の タ ン パ ク 質に 比 べ ，54kDa以下 のタン パク質 はより 強い吸 着を 示した ，以上 より， 今回 の条件 下で はタ ン パ ク 質 の 酸性 ， 塩 基 性 への 依 存 性 は 弱く ， タ ン パ ク質 の 吸 着 はCNTsの 純 度や 径 ， 処 理方法 に影 響され ること が示 された ．
審査の内容
1．酸 性タン パク質 を選 択した 理由．
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対照 的 な 等電 点(pl値） を有す る酸性 タンパ ク質 のアル ブミン ，塩基 性タ ンパク 質のり ゾチー ムを使 用する ことで ，吸着 に電 気的な 結合が 関与し ている か調 べるた め．
2．ク ロマト グラフ イー測 定の バッフ ァーに 尿素を 使用 した理 由．
尿素 は ア ミ ノ 酸の 水 素 結 合 を切 断 ， タ ン パク 質 の 立 体 構造を 崩し変 性す る． NaOH下で 分出 されな いタン パク質 を分出 する ため使 用した ，
3．前 処理の 意義と 熱処理 を500℃に 設定し た理由 ．
生 成 時 のCNTsは ア モ ル フ ァ ス カ ー ボ ン やFe，Alな ど の 金 属 触 媒 を 含 む ．CNTsを 分 解 せず ア モ ルフ ん ス カ ー ボン の み を 除 去す る の に 適 切な500℃ で熱 処理 を行い ，ま た金属 触媒を 除去す る為，
酸処理 を行っ た．
4．CNTsの 分散 性向上 には何 が影響 して いるか ．
前 処 理 を 行 う と ゼ ー タ 電 位 測 定 か ら，CNTsは負 に 帯 電 す るこ と が 示 さ れ， 表 面 にOH基 や ―COOH 基が誘 導され ること によ り，蒸 留水に 対する 分散性 が向 上した と考え られる ，ま た曲状 ・小径の未処 理CNTsが分 散 性 を 示 した の は ， 線 状・ 大 径CNTsに 比 べ 結 晶性 が 低 く ， より 多 く含 有され る構造 欠 陥部位 に極性 分子の 水が 結合し た為と 推測さ れる．
5．細 胞培養 時，培 地内の タン パク質 の活性 への影 響．
骨 芽 細 胞 様 細 胞 をCNTs上 で 培 養 し た 場 合 ， 細 胞 増 殖 ， 仮 足 伸 展 お よ びALP活 性 の 増 加 が 認 め られて おり， タンパ ク質 吸着の 影響と 考えら れる． 一方 ，過度 のタン パク質 吸着 は細胞 増殖に関与す る 部 位 の 活 性 を 阻 害 し ， 細 胞 増 殖 や 分 化 が 低 下 す る 可 能 性 も 考 え ら れ る ． 6．単 一のタ ンパク 質がニ つの 分かれ たピー クを示 した 理由．
可能 性 の ー っ とし て ，Albの 純 度 は ≧98%，Lysは ≧90%で あ り ， 異な る 分 子 量成 分に分 出し たこと が考え られる ．
7．酸 性条件 下での タンパ ク質 の吸着 につい て，
中径 ， 低 純度CNTsに対 する イオン 強度の 強いHC1をバ ッフ ァーと したク ロマト グラフ イー 測定で は，
PBSやNaOH下 と同 様 の 吸 着 挙動 を 示 し た ．従 っ て ， 酸 性条 件 下 に お い ても 今 回 と 同 様の 吸 着 挙 動 を示す と予想 される ．
従 来 ，CNTsの バ イオ 応 用 に は タン パ ク 質の吸 着が重 要であ ること がー 般的に 示され てきた ，今 回，具 体 的 な タ ン パ ク 質 やCNTsの 種 類 や 処 理条 件 の 依 存 性に つ い て 調 べ，CNTsへの タ ン パ ク 質の 吸 着 特 性 の評 価 を 行 っ た． 本 研 究 は ，CNTsと タン パ ク 質 の 相互 作 用 の 解 明に 寄 与 す る と とも に，CNTsの細 胞培 養応 用 や 組 織 再生 応 用 ， 細 菌 吸着 ・ 殺 菌 の バイ オ 応 用 や 癌治 療 の た め の重 要 な 基 礎的 な知 見とな る，
上 記 他 の 質問 に 対 し ， 学位 申 請 者 は 明解 に 答 え ， ま た関 連 分 野 の 十分 な 知 識 と 解決 能カを 有する こ と が 認 め ら れ た ， よ っ て 博 士 （ 歯 学 ） の 学 位 授 与 に ふ さ わ し い も の と 判 定 し た ，
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