精 子 の 生 存 率 の 測 定 ウナ ギ精 子 の 生 存 率 を推
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(2) ず 市 販 され て い る数 種 の ヒト・ 家 畜 用精 子活 性解 析 装 置 の ウナ ギ 精 子 に お け る有 効 性 を検 討 した。 しか し,これ らの 装 置 で そ の まま測 定 す ることは 困 難 と判 断 され た た め,種 々 の 改 良 を 加 え,運 動 解 析 手 法 を確 立 した。. 結 果 と考 察 精 子 の生存 率 の測定. Fig.2.Theef下ectofconcentrationofpotasium(K)and bicarbonate(H)ionsinthecultivatedsolutiononthe. ウナ ギ 精 子 の 生 存 率 に 影. spermmotility(openbars)andnonstainingalive spermatozoaoneosin‑nigrosinmethod(solidbars).. 響 を及 ぼ さず,死 亡 細 胞 の み を染 色 す るた め の. Valuesrepresentmeans±S.E.Meanswithdif免rent. エオ シンニ グロシ ン液,ヘ キスト液 の 染 色 時 間 を. lettersaresignificantlydifTerence(1)〈0.05).. 明 らか に した(Fig.1)。 培 養 す る溶 液 の カ リウムイオ ン濃 度,重 炭 酸 イ オ ン濃 度 を変 えると,高 張 液 で 希 釈 後 の 精 子 の 運 動 率 は 大 きく変 動 した が,細 胞 染 色 法 により推 定 され る生 存 率 は変 動 しない ことを確 認 した(Fig.2)。 細 胞 の 死 亡 率 と染 色 率 が 相 関 す ることを明 らか に す るた め,ホ ル マ リン処 理,熱 処 理,凍 結 処 理 等 を行 っ て精 子 を死 滅 させ た後,3種. の染 色 方法で. 染 色 率 を比 較 した ところ,死 滅 化 処 理 の 方 法 に よ り染 色 率 が 大 きく異 なることが 明 らか とな った(Fig. 3)。試 行 した染 色 方 法 の 中で は,ヘ キスト染 色 が 最 も安 定 した 染 色 率 を示 した。生 存 精 子 とホル マ リン処 理 精 子 を混 合 して 運 動 率 と染 色 率(=死. 亡. 率)を 比 較 した ところ,ヘ キスト染 色 法 が 最 も運 動 率 と高 い 相 関 を示 し(Fig.4),1ヵ 月 以 上 の 冷 蔵 保 存 に伴 う運 動 率 と染 色 率 の 変 化 でも運 動 率 と近 似 した値 を示 した(Fig.5). 画 像 解 析 装 置 を用 い た精 子 の 運 動 能 力 測 定 画 像 解 析 ソフトにより運 動 性 を正 確 に測 定 す る. Fig.4.Thcmotihtyandnon‑stainingratcorspermatozoa. た め に は,そ れ ぞ れ の 精 子 細 胞 が 顕 微 鏡 視 野 の. artificiallycoordinatedbymixingdeadspermatozoa treatedwithfbrmalinsolution.Circlesindicatesmotilitv.. 背 景 と高 いコントラストを持 つ 必 要 があ る。また,. trianglcsindicatesnon‑stainingrateontheeosin‑nigrosin method,squaresindicatesnon‑stainingrateonthehoechst. 測 定 す る視 野 中 で 精 子 が 充 分 な 運 動 性 を示 す た. lnethod,rho1丁lboidsindicatesnon‑stainingrateollthe hve/deadmethod.Valuesrepresentmeans±S.E.. め に は 一定 以 上 の 運 動 可 能 な 容 積 が 必 要 で あ り,. 24.
(3) に精 子 が接 着 す ることに より,人 工 的 な 運 動 停 止 100. が 高 頻 度 で 起 こった 。これ を防 除 す るに は,運 動 80. 開 始 用 溶 液 に0.5%程 度 の アル ブ ミンを添 加 す る. 脇 ε60 δ. ことが 効 果 的 で あ ることが 明 らか とな った。. 碁40. α. 本 研 究 で は,精 子 の 質 的 評 価 方 法 として精 子. 20. の 生 存 率 を測 定 す るた め の 染 色 方 法 や,精 子 の 0 0510152025303540. 運 動 性 をより詳 細 に解 析 す るた めの 画 像 処 理 に. Daysafterinitiationofcoolingstorage(day). よる精 子 の 運 動 解 析 方 法 の 基 礎 を築 くことが でき た。しか し,これ らの 方 法 に より質 的 に評 価 され た. Fig.5.Theerfbctofcoolstorageincultivatedsolutionon spermmotilityandnon‑stammgrateuslngeosln‑nlgrosln. 精 子 を用 い て,1一分 な受 精 実 験 を行 なうことが で. andhoechstmethods.Solidcirclesindicatcssperm motility,trianglesindicatesnon‑stainingrateontheeosin‑. きな か った。・ 今後 は,こ れ らの精 子 の質 的 評 価 方. nigrosinmethod,opencirclesindicatesnon‑stainingrate onthehoechstmethod.Valuesrepresentmeans±S.E.. 法 が 人 工 授 精 方 法 の 評 価 に有 効 か どうか,よ り詳. か つ 運 動 速 度 をIE確 に測 定 す るた め に は 精 子 は. 細 な 比 較 を行 なう必 要 が ある。. 2次 元(平 面)上 に 運 動 させ る必 要 があ る。ウナ ギ 精 子 に お い て これ らの 条 件 を 充 たす 方 法 を種 々 参 考 文 献. 検 討 した 結 果,ス ライドグラスとカバ ー グラスの 間. 1)OhtaH.andIzawaT㌦(1996)Diluentfbrcool. 隔 が80μmの チ ャンバ ー 内 に運 動 精 子 を入 れ,対. storageoftheJapaneseeel(ン1ηgz1∫. 物 レンズ にネ ガテ ィブ コン トラス トレンズ を用 い た. spermatozoa..匂. 位 相 差 顕 微 鏡 像 が 適 してい ることが 明 らか となっ た 。また,測 定 の 際 にスライドグラスとカバ ー グ ラス. 25一. 〃αo〃〃〃泥142,107‑ll8.. 〃αノ64)oη1co).
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