amplification 日本バイオ･ラッド ラボラトリーズ株式会社 ライフサイエンス事業本部 リアルタイム リアルタイムPCR PCR 再入門再入門 Z5255 0512A
amplification リアルタイム リアルタイムPCRPCR再入門再入門 概要概要 • リアルタイムPCR原理 • 蛍光検出ケミストリー • 遺伝子発現リアルタイムPCR実験フロー • PCR時間を短縮できるプロトコール紹介
amplification PCR PCRでの定量性の限界での定量性の限界 PCRでは理論上２倍づつ増幅 さまざまな要因によりPCR後 半では理論通りには増幅が 行われない PCR後電気泳動での定量性 には限界がある
amplification リアルタイム リアルタイムPCRPCRの原理の原理 リアルタイムPCRでは、 ある一定の増幅DNA量 (Threshold) まで達した時 点のサイクルの差を求め る 達したサイクルが早けれ ば、それだけ初期鋳型量 が多い
amplification 蛍光増幅曲線 蛍光増幅曲線 蛍光増幅曲線グラフ例 （108,106,104,102 コピー、IL-1β) Threshold Cycle = Ct
amplification 検量線 検量線 初期鋳型量 Threshold Cycle 検量線
amplification 蛍光検出ケミストリー 蛍光検出ケミストリー SYBR Green I ・安価かつ簡便 蛍光プローブ ・特異的な検出 ・マルチプレックス可能 デメリット ・非特異的な産物も検出 デメリット ・蛍光プローブが高価 ・蛍光プローブ設計が必要
amplification SYBR Green I SYBR Green I Denature Annealing Extension
amplification 蛍光プローブ 蛍光プローブ//TaqManTaqMan Denature Annealing Extension
amplification
蛍光プローブ
蛍光プローブ//Molecular BeaconMolecular Beacon
Annealing
amplification 遺伝子発現解析における 遺伝子発現解析における リアルタイム リアルタイムPCRPCR実験実験フローフロー プライマー/ プローブ設計 プライマー/ プローブ設計 サンプル調製 サンプル調製 プロトコール 条件検討 プロトコール 条件検討 発現解析 発現解析
amplification プライマー プライマー//プローブ設計プローブ設計 プライマー/ プローブ設計 プライマー/ プローブ設計 サンプル調製 サンプル調製 プロトコール 条件検討 プロトコール 条件検討 発現解析 発現解析 ・ Primer3 プライマー/プローブ設計サイト ・ RTPrimerDB qPCRプライマー/プローブデータ ベースサイト ・ Beacon Designer 設計ソフトウェア
amplification サンプル調製 サンプル調製 プライマー/ プローブ設計 プライマー/ プローブ設計 サンプル調製 サンプル調製 プロトコール 条件検討 プロトコール 条件検討 発現解析 発現解析 ・ 迅速なRNA精製 ・ 純度の確認 A260/A280=1.9-2.1 ・ RNA非分解の確認 18S/28S rRNAチェック
amplification プロトコール プロトコール条件検討条件検討 プライマー/ プローブ設計 プライマー/ プローブ設計 サンプル調製 サンプル調製 プロトコール 条件検討 プロトコール 条件検討 発現解析 発現解析 ・ まずプライマーでの 増幅の確認 ・ 温度グラジェント機 能と融解曲線の組 み合わせ
amplification
温度グラジェント機能
温度グラジェント機能
amplification
融解曲線機能
融解曲線機能
SYBR Green Iでは副産物の有無を確認
amplification 検量線による増幅効率 検量線による増幅効率 希釈系列から検量線を作成し、相関係数（直 線性）と増幅効率を確認 PCR増幅効率 = [10 (-1/slope) ] - 1
amplification 発現解析 発現解析 プライマー/ プローブ設計 プライマー/ プローブ設計 サンプル調製 サンプル調製 プロトコール 条件検討 プロトコール 条件検討 発現解析 発現解析 ・ 発現解析定量方法 - 検量線法 - 比較Ct法 いずれもハウスキーピング遺伝子 をリファレンスとして目的の遺伝子 の発現量比を求める
amplification 遺伝子発現 遺伝子発現 定量方法定量方法 検量線法 ・増幅効率が100%でなくても 定量可能 比較Ct法 ・検量線を毎回設定しなくも 定量可能 デメリット ・ 毎回検量線を設定する必 要あり デメリット ・ 増幅効率が100%近くでな ければならない
amplification 検量線を用いた定量 検量線を用いた定量 試料Aに対して試料Bでは遺伝子発現量比が4倍 60/15 = 4 15 pg 60 pg 試料B 10/10 = 1 10 pg 10 pg 試料A ハウスキーピング遺伝子でノー マライズしたターゲット遺伝子 の相対量 ハウスキーピング遺 伝子の初期鋳型量 目的の遺伝子の 初期鋳型量
amplification 検量線法でのプレートセット 検量線法でのプレートセット • プレートセットアップ例 SYBR Green検出系 スタンダード 102-108コピー 4段階希釈系列 TGプライマーセット 試料A TGプライマーセット 試料B TGプライマーセット HKプライマーセット=ハウスキーピング遺伝子に対するプライマーセット TGプライマーセット=目的遺伝子に対するプライマーセット ブランク TGプライマーセット スタンダード 102-108コピー 4段階希釈系列 HKプライマーセット 試料A HKプライマーセット 試料B HKプライマーセット ブランク HKプライマーセット
amplification
比較
比較CtCt法法//ΔΔΔΔCtCt法法 実例実例
DCtsampleA = CtTG_sampleA - CtHK_sampleA = 24 – 12 = 12 DCtsampleB = CtTG_sampleB - CtHK_sampleB = 15 – 12 = 3
D(DCt) = DCtsampleB - DCtsampleA = 3 – 12 = - 9 発現量比 = 2-D(DCt) = 2-(-9) = 512
amplification ΔΔ ΔΔCtCt法でのプレートセット法でのプレートセット • プレートセットアップ例 SYBR Green検出系 試料A TGプライマーセット 試料B TGプライマーセット ブランク TGプライマーセット 試料A HKプライマーセット 試料B HKプライマーセット ブランク HKプライマーセット HKプライマーセット=ハウスキーピング遺伝子に対するプライマーセット TGプライマーセット=目的遺伝子に対するプライマーセット
amplification 比較 比較CtCt法のノーマライゼーション法のノーマライゼーション • DDCt – 100%の増幅効率が前提 – 1つのリファレンス遺伝子のみ設定可 • Pfaffl 改法 – 増幅効率を考慮した算出法 – 1つのリファレンス遺伝子のみ設定可 • Vandesompele 改法 – 増幅効率を考慮した算出法 – 複数のリファレンス遺伝子の設定可 Simple Complex
amplification
DD
DDCtCt法法
発現量比 = 2-D(DCt)
D(DCt) = DCt sample - DCt control
DCt control = Ct GOI_control – Ct REF_control DCt sample = Ct GOI_sample – C tREF_sample
目的の遺伝子(Gene of Interest）=GOI リファレンス遺伝子（Reference Gene）=REF
コントロール試料=control 対象試料=sample
amplification
Pfaffl
Pfaffl改法改法
EGOI
(CtGOI (control) - CtGOI (sample))
EREF
(CtREF (control) - CtREF (sample)) = 発現量比 E = 1 + (h/100) h ： 増幅効率（%） もし100%なら、E=2となり、 ΔΔCt法と同じ結果になる 目的の遺伝子(Gene of Interest）=GOI リファレンス遺伝子（Reference Gene）=REF コントロール試料=control 対象試料=sample
A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.
amplification Vandesompele Vandesompele法法 対象試料の相対量 リファレンス遺伝子の相対量の相乗平均 E(GOI)
(Rel Quant Ref1 * Rel Quant Ref2 * . . . * Rel Quant Ref n)1/n
目的の遺伝子(Gene of Interest）=GOI リファレンス遺伝子（Reference Gene）=REF コントロール試料=control 対象試料=sample (CtGOI(control)-CtGOI(sample)) ＝
Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes.
Vandesompele, J.Katleen De Preter, Filip Pattyn, Bruce Poppe, Nadine Van Roy, Anne De Paepe and Frank Speleman. Genome Biology 2002, 3:research0034.1-0034.11
amplification 発現解析 発現解析 プライマー/ プローブ設計 プライマー/ プローブ設計 サンプル調製 サンプル調製 プロトコール 条件検討 プロトコール 条件検討 発現解析 発現解析 ・ 発現解析の定量方 法 - 検量線法 - 比較Ct法 まずは検量線法で実験を行ってい き、実験に慣れてきて、サンプル数 が多くなってきたら比較Ct法を行う ことをおすすめします
amplification PCR PCR時間を短縮できる時間を短縮できる プロトコール プロトコール • 既存のサーマルサイクラーやリアルタイム PCRシステムで、PCR時間を大幅に短縮す るためのプロトコール（Fast PCRプロトコー ル）が実行可能です
amplification PCR PCRのプロトコールでは何がスピードののプロトコールでは何がスピードの 決め手となっているのか？ 決め手となっているのか？ 実際のPCR実行時間は以下のものに影響されます: • ステップおよびサイクル数 • それぞれのステップにおける時間の長さ • それぞれのステップの温度に到達するまでの時間 の長さ (ランピング時間)
amplification PCR実行時間を減らすには以下のことを実施します: • ステップおよびサイクル数を最小限にする • それぞれのステップでの時間を短くする • ステップ間の温度差を減らし、ランピング時間を最 小限にする いかに いかにPCRPCR実行時間を短くするか実行時間を短くするか?? 変性 アニーリング 伸長反応 変性 アニーリング/伸長反応 標準的なPCRプロトコール Fast PCRプロトコール
amplification より より速い速いPCRPCRのためにはのためには どのようにプロトコールを改変するのか どのようにプロトコールを改変するのか?? 250 bp以下のターゲットでのFast PCRプロトコールを実行するための改 変方法は: • Tm値が64–69℃のプライマーを作製
(Tm値はSanta Lucia nearest-neighbor法にて計算します)
• 最初のテンプレート変性/酵素活性化ステップを98℃、30秒に変更 • それぞれのサイクルでの変性ステップを92℃、1秒に変更 • アニーリングと伸長反応ステップを、70℃、20秒の１つのステップに 結合 * 注: プライマーのTm値が上記範囲内にはいらない場合、2-3bp長くする か、あらためて設計する必要があります。
amplification プロトコール変更例 プロトコール変更例 短縮時間 = 54 分 95℃ 10分 72℃ 10分 95℃ 15秒 60℃ 30秒 72℃ 30秒 35 x 温度を高く、時間を短く 温度を低く、時間を短く 98℃ 30秒 92℃ 1秒 x 35 70℃ 20秒 アニーリングと伸長反応ステップを 70℃の一つのステップにし、時間を 短く ステップ削除（250 bp以下の短い PCR産物では通常最終伸長反応 は必要ありません） 改変“Fast”プロトコール 通常のプロトコール 終了までの 実時間: 1 時間 28分 34 分
amplification Fast PCR Fast PCRと標準と標準PCRPCRプロトコールのプロトコールの PCR PCR産物泳動結果産物泳動結果 ターゲットは 約150∼250 bpで、Tm値は63–67℃と違いがあるもので検証し、Fastプ ロトコール(F)と標準プロトコール(S)両方で実行しました。iCyclerサーマルサイクラー を用いて、iTaq DNAポリメラーゼにてPCRを実施し、アガロース電気泳動による結果 を示します。 標準プロトコール: 95℃/3分→（95℃/15秒→62℃/30秒→72℃/30秒） x 35サイクル→72℃/10分 Fastプロトコール: 98℃/30秒→（92℃/1秒→70℃/20秒） x 35サイクル
amplification リアルタイム リアルタイムPCRPCRでのでの 正確な定量結果 正確な定量結果 MiniOpticonリアルタイムPCR解析システム用いて、リアルタイムPCRの実施結 果。相関係数=0.995、増幅効率=99.3% PCR実行時間 = 33 分 プロトコール: 98℃/ 30秒→（92℃/1秒→70℃/5秒→plate read) x 30 サイクル
amplification Fast PCR Fast PCRプロトコールプロトコール まとめまとめ • プロトコールを改変するだけでPCR実行時間は 1.5∼2.0時間から30∼40分間に減少させること が可能です。 • 特殊な機器を導入しなくても、既存のサーマルサ イクラーやリアルタイムPCRシステムでPCR時間 を短縮することが可能です。 • より詳細な情報 -Fast PCRチュートリアル PDF版-は弊社Webサイトhttp://discover.bio-rad.co.jpよ りダウンロードが可能です。
