HILIC 分析法開発のための実践的なアプローチ ~ 極性化合物保持に向けて ~ 日本ウォーターズ株式会社ソリューションセンターケミストリーテクノロジー 2012 年 2 月 2012 Nihon Waters K.K. 1 アウトライン HILICの概要保持のメカニズムと特徴実際の分析時の検

(1)

アウトライン



HILICの概要



保持のメカニズムと特徴



実際の分析時の検討事項



HILIC 分析法開発ストラテジー



結論

(2)

アウトライン



HILICの概要

–

HILICとは

–

HILICの利点

–

どんな時にHILICを使用するか



保持のメカニズムと特徴



実際の分析時の検討事項



HILIC分析法開発ストラテジー



結論

HILIC

HILICとは

とは

?



HILIC - H

ydroph

il

ic

I

nteraction

C

hromatography

（親水性相互作用クロマトグラフィー）

順相と区別するために1990年に新たに作られた造語*

–

順相と区別するために1990年に新たに作られた造語*



HILIC順相クロマトグラフィーの一種だが、ヘキサン等の水と混和しない溶媒は

使用しない

–

“逆逆相” または “水系順相” クロマトグラフィー



固定相は高極性

シリカ

ハイブリッドシアノアミノジオールアミド

–

シリカ, ハイブリッド, シアノ, アミノ, ジオール, アミド



高比率の有機溶媒(> 80%)と低比率の水を含む移動相

–

水（または極性溶媒）が溶出力の強い溶媒となる

*Alpert, A. J. J.Chromatogr. 499 (1990) 177-196.

(3)

ESI-MS の感度向上

—

除タンパク（

PPT）上清を希釈なしにそのまま注入可能

微量サプル分析が容易に

—

微量サンプルの分析が容易に



サンプル前処理の

スループット

向上

—

エバポレート／再溶解のステップを省いて、有機溶媒混合比が高い前

処理（PPT、LLE、SPE）溶液をそのまま注入可能

どんな時に

HILIC

HILICを使用するか

を使用するか

どんな時に

HILICを

nt

どんな時に

を

使用するか

:



親水性またはイオン性化合物

の保持を向上させたい時



極性またはイオン性化合物の

MS感度を向上させたい時



有機溶媒抽出液の分析にお

けるサンプル前処理のスルー

プットを向上させたい時

polar non‐polar Compound Index p poor

(4)

アウトライン



HILICの概要



保持のメカニズムと特徴

–

保持メカニズム

–

保持＆選択性マトリックス

o

有機溶媒

o

固定相

o

移動相pH



実際の分析時の検討事項



実際の分析時の検討事項



HILIC分析法開発ストラテジー



結論

HILIC

HILICの複合型保持メカニズム

の複合型保持メカニズム

D.V. McCalley, U. D. Neue, J. Chromatogr. A 1192 (2008) 225-229 E.S. Grumbach, D.M. Diehl, U.D. Neue, J. Sep. Sci. 31 (2008), 1511-1518

A. Méndez, E. Bosch, M. Rosés, U. D. Neue, J. Chromatogr. A 986 (2003), 33-44

(5)

HILIC

保持＆選択性

移動相pH

_有機溶媒

アセトニトリル混合比の保持への影響

A

16

Silica Particle

A

16

Silica Particle

O N OH Nicotinic Acid pKa 2 2 4 8 2 4 6 8 10 12 14 R e te nt io n F a ct o r

Nicotinic acid

Nortriptyline

Cytosine

Methacrylic acid

2 4 6 8 10 12 14 R e te nt io n F a ct o r

Nicotinic acid

Nortriptyline

Cytosine

Methacrylic acid

アセトニトリル混合比90%以上で保持が急激に増大する

O C H2 OH CH3 Methacrylic Acid pKa 4.58 NH2 Cytosine pKa = 12.2

(6)

Weakest

Primary

[Weak]

Solvents

Acetone

溶媒の選択性と溶出力の強さ

弱溶媒

Solvents

Acetonitrile

Isopropanol

Ethanol

_Elution

[Strong]

強溶媒

Strongest

極性化合物の保持を

強めるために極性の

低い溶媒を使用する

Methanol

Water

Solvents

極性溶媒の保持および選択性への影響

1 2 3

4 90:10 ACN:

H

2

O

1

2 ₃

4

1

2

3

4 90:5:5 ACN:H

2

O:MeOH

90:5:5 ACN:H

2

O:

EtOH

溶媒の極性を下げ

ると保持が強くなる

4

1

3

4 90:5:5 ACN:H

2

O:

IPA

Minutes 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

2

(7)

HILIC

保持＆選択性

移動相pH

有機溶媒

HILIC

HILIC分離のための固定相

分離のための固定相

Hybrid HILIC カラム

(HILIC: pH 1 – 9 / Amide: pH2-11 )

ACQUITY UPLC BEH Amide

XBridge Amide

ACQUITY UPLC BEH HILIC

XBridge HILIC

Atlantis HILIC Silica

Silica HILIC カラム

(8)

固定相の保持への影響

ACQUITY UPLC BEH HILIC 2.1 x 50 mm, 1.7 µm

シラノール活性の低い非修飾型ハイブリッド

4 5 1 ₂ 3 3 1 2 4 ₅ 1 ₂ 34

ACQUITY UPLC BEH Amide 2.1 x 50 mm, 1.7 µm

修飾型ハイブリッド

Atlantis HILIC Silica 2.1 x 50 mm, 3 µm

シラノール活性の高い非修飾型シリカ

(1) acenaphthene (2) thymine (3) 5‐fluoroorotic acid (4) adenine (5) cytosine; UV 254 nm

固定相の選択性への影響

O C H2 OH CH3 Methacrylic Acid pKa 4.58 N N H O NH2 Cytosine pKa = 12.2 NHCH3 Nortriptyline pKa = 10 O N OH Nicotinic Acid pKa = 2.2, 4.8 10 15 20 25 R et en ti o n Fa ct or ACQUITY UPLC BEH HILIC nicotinic acid methacrylic acid nortriptyline cytosine 10 15 20 25 R et en ti o n Fa ct or ACQUITY UPLC BEH Amide nicotinic acid methacrylic acid nortriptyline cytosine ©2012 Nihon Waters K.K. 16 0 5 60 70 80 90 95 R % Acetonitrile 0 5 60 70 80 90 95 R % Acetonitrile

固定相の官能基が選択性に影響

(9)

HILIC

保持＆選択性

有機溶媒

移動相

pH

移動相

pH

pHの保持および選択性への影響

の保持および選択性への影響

1 2

pH 3

ACQUITY UPLC BEH Amide, 2.1 x 50 mm , 1.7 µm

O N OH Nicotinic Acid pKa 2 2 4 8 1 3 4

pH 9

化合物 1. Methacrylic acid 2. Nortriptyline 3. Nicotinic acid 4. cytosine 2 4 N N H O NHCH3 Nortriptyline pKa = 10 pKa = 2.2, 4.8 ©2012 Nihon Waters K.K. 18 Minutes 0.00 1.00 2.00 3.00 1 3 O C H2 OH CH3 Methacrylic Acid pKa 4.58 NH2 Cytosine pKa = 12.2

(10)

移動相

pH

pHの保持および選択性への影響

の保持および選択性への影響

r2_= 0.7257 r2_= 0.9995 3.0

BEH Amide

2.1 x 50 mm, 1.7 µm

一般的に、化合物が解離した

状態の方が保持が強い

r2_= 0.8975 0.0 1.0 2.0

ln k

(pH 9)

Acids

50 ,

µ

ln k (pH 3)

Acids Bases Organophosphonates Other

Fountain, et al., J. Sep. Sci. accepted.

移動相

pH

pHの

の

MS

MSシグナル強度への影響

シグナル強度への影響

Di h h d i Nortriptyline Thiamine Procainamide Morphine EMPA IMPA PMPA CMPA IBMPA Benzylamine Cytosine 5‐fluorocytosine Adenine acyclovir Diphenhydramine

ES+

1.00E+05 1.00E+06 1.00E+07 1.00E+08 1.00E+09 1.00E+10

Uracil Nicotinic acid Thymine 5‐fluorouracil salicylic acid 4‐aminosalicylic acid 2‐naphthalenesulfonic acid EMPA Ion counts pH 9 pH 3

ES‐

(11)

•化合物が解離している場合

[酸性化合物は高pH移動相

保持＆選択性

[酸性化合物は高pH移動相、

塩基性化合物は低pH移動

相]に保持が強まる

移動相

pH

有機溶媒

アウトライン



HILICの概要



保持のメカニズムと特徴



実際の分析時の検討事項

–

一般的なバッファおよび添加剤

–

移動相調製

–

カラム平衡化

–

サンプル溶解溶媒



HILIC分析法開発ストラテジー



結論

(12)

分析を始める前に

::

一般的な

HILIC

HILIC移動相

移動相



一般的なバッファ/添加剤*

–

ギ酸アンモニウム、酢酸アンモニウム

ギ酸水酸化アンモニウム酢酸

–

ギ酸、水酸化アンモニウム、酢酸

–

有機溶媒混合比の高い移動相では析出する可能性があるためリン酸塩バッファ

の使用は避けた方が良い

(リン酸は問題無し)



推奨バッファ濃度: 10 mM

推奨添加剤濃度

0 2%



推奨添加剤濃度: 0.2%

*移動相の有機溶媒混合比が高いため実際の移動相pHは１pHユニット中性に近くなる可能性がある Canals, I.; Oumada, F. Z.; Roses, M.; Bosch, E. J. Chromatogr. A. 911 (2001) 191‐202. Espinosa, S.; Bosch, E.; Roses, M. Anal. Chem. 72 (2000) 5193‐5200.

バッファ濃度の影響

:

pH 9.0

1.00 3 ₄ 1,2 AU 0 mM ammonium acetate

All contain 90:10 MeCN:H2O

O N OH Nicotinic Acid pKa = 2.2, 4.8 0.00 0.00 1.00 0.00 1.00 1.00 1 ₂ 4 3 1 3 4 2 AU AU 2.5 mM ammonium acetate 5.0 mM ammonium acetate N N H O NH CH3 Nortriptyline pKa = 10 p , ©2012 Nihon Waters K.K. 24 0.00 0.00 1.00 Minutes 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 1 3 4 2 3 1 4 2 AU AU 10 mM ammonium acetate 20 mM ammonium acetate O C H2 OH CH3 Methacrylic Acid pKa 4.58 NH2 Cytosine pKa = 12.2 1. Methacrylic acid 2. Nicotinic acid 3. Nortriptyline 4. Cytosine

(13)

1 3 _{0.2% formic acid pH 3} 1. Methacrylic acid

2 Ni ti i id

pH 3

0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00 1.20 1.40 1.60 1.80 2.00 2.20 2.40 2.60 2.80 3.00 3 2 4 1 2 ₄ 20 mM ammonium formate pH 3 2. Nicotinic acid 3. Nortriptyline 4. Cytosine

p

バッファを使用しない場合、塩基性化合物はピーク形状が悪く保持しにくい酸性化合物の選択性は変わる

All contain 90:10 MeCN:H2O



ニードル洗浄溶媒

–

強洗浄溶媒：

9:1 アセトニトリル：水

–

弱洗浄溶媒／パージ溶媒：初期組成移動相（塩、添加剤、バッファは添加しない）

分析を始める前に：

カラム平衡化および洗浄溶媒

弱洗浄溶媒／パジ溶媒：初期組成移動相（塩、添加剤、バッファは添加しない）



購入後カラムの初回使用時

–

10mMバッファまたは0.2%添加剤を含むアセトニトリル／水 50:50（BEH Amideの

場合はアセトニトリル/水 60:40または初期組成移動相）を50カラムボリューム（カラム

容積の50倍）流す



カラム平衡化

–

最初の組成の移動相を20カラムボリューム（カラム容積の20倍）流して平衡化する

最初の組成の移動相を20カラムボリュム（カラム容積の20倍）流して平衡化する



グラジエント分析時

–

8-10カラムボリューム（カラム容積の8-10倍）で再平衡化

平衡化が充分でない場合、保持時間の変動が起こることがある

(14)



サンプル溶解溶媒は試料溶解性とピーク形状に大きく影響する（逆

相の場合と同様）

分析を始める前に

::

サンプル溶解溶媒の影響



サンプル溶解溶媒は少なくともアセトニトリル混合比75%またはでき

るだけ初期組成の移動相に近い溶媒



ただし、極性化合物は有機溶媒中では溶解性が低いことが多い



汎用のHILIC溶解溶媒

–

75:25 アセトニトリル：メタノールはほとんどの極性化合物で使用可能

–

試料溶解性とピーク形状の両方のバランスに優れている

–

分析対象化合物によって調整（溶解性を向上するために0.2%ギ酸添加）

–

25%メタノールは溶解溶媒として極性が高すぎる場合もある

AU 0 20 0.30 0.40 0.50 0.60

100% H

2

O

S

1

2

3 ₄

ACQUITY UPLC®_BEH HILIC 2.1 x 100 mm, 1.7 µm Analytes 1. Methacrylic acid

サンプル溶解溶媒の影響

極性溶媒として水を使用

0.00 0.10 0.20 Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 A U 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60

50 ACN: 50 H

2

O

4 S

1

2

3 ₄

サンプル溶解溶媒中の

アセトニトリル混合比が高く

なるとピーク形状が改善する

1. Methacrylic acid 2. Cytosine 3. Nortriptyline 4. Nicotinic acid ©2012 Nihon Waters K.K. 28 Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 A U 0.00 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 0.60 Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00

75 ACN: 25 H

2

O

S

1 2

3

4 他の極性溶媒を使用した

場合はどうでしょうか？

(15)

AU 0.00 0.10 0.20 0.30

1

3

4 ピーク形状と試料溶解性が

改善

75 ACN: 25 MeOH

S

1

2

3

4 サンプル溶解溶媒中のアセ

トニトリル混合比が高くなる

とピーク形状が改善する

アウトライン



HILICの概要



保持のメカニズムと特徴



実際の分析時の検討事項



HILIC 分析法開発ストラテジー

–

分析法開発スクリーニングアプローチ

–

アプローチの実践

: 実例

–

最適化ステップ



結論

(16)

Waters HILIC

Waters HILIC スクリーニングストラテジー

スクリーニングストラテジー

pH 3

ACQUITY UPLC BEH

HILIC

2 1 50

1 7

pH 9

2.1 x 50 mm, 1.7

µ

m

最適化

ACQUITY UPLC BEH

Amide

2.1 x 50 mm, 1.7

µ

m

Atlantis HILIC Silica

2 1 x 50 mm 3

µ

m

2.1 x 50 mm, 3

µ

m

どこから始めるか？



最初のスカウティンググラジエントではアセトニトリル濃度を95-50% （5分）に設定



少なくとも5％の極性溶媒（水またはエタノールなど）

装置:ACQUITY UPLC system with ACQUITY PDA and ACQUITY SQD カラム:ACQUITY UPLC BEH Amide, 2.1 x 50 mm, 1.7 µm

ACQUITY UPLC BEH HILIC 2 1 x 50 mm 1 7 µm

自動スクリーニング条件

ACQUITY UPLC BEH HILIC, 2.1 x 50 mm, 1.7 µm Atlantis HILIC Silica, 2.1 x 50 mm, 3 µm

移動相A1:50/50 ACN/H2O with 10 mM HCOONH4and 0.125% HCOOH, pH 3.0* 移動相B1:95/5 ACN/H2O with 10 mM HCOONH4and 0.125% HCOOH, pH 3.0* 移動相A2:50/50 ACN/H2O with 10 mM CH3COONH4and 0.04% NH4OH, pH 9.0* 移動相B2:95/5 ACN/H₂O with 10 mM CH₃COONH₄and 0.04% NH₄OH, pH 9.0* グラジエント99.9% B to 0.1% B in 5 min, reset (total run time = 6 min)

流速: 0.5 mL/min 注入量:5 µL ©2012 Nihon Waters K.K. 32 注入量:5 µL サンプル溶解溶媒:75/25 ACN/MeOH (溶解性のために0.2% HCOOH添加が必要な場合がある) カラム温度.: 30°C 強洗浄溶媒:95/5 ACN/H2O サンプリングレート:20 points/sec 時定数: 0.1 *200mM水溶液のストックバッファのpH

(17)

—

グラジエントがいいか、それともアイソクラティックか?



Step 1: データを評価してpHを選択



Step 2: データを評価してカラムを選択



Step 3: 分離の最適化/微調整

OH O P C H3 O C H3 O O P C H3 O O P O H H3C CH3 CH3

アプローチの実践

::

例

例：

：有機ホスホン酸

有機ホスホン酸

Cyclohexyl methylphosphonic acid (CMPA) OH CH3 isobutyl hydrogen methylphosphonate (IBMPA) C H3 H3C 3 Pinacolyl methylphosphonic acid (PMPA) O O P CH C H3 O O P C H3 ©2012 Nihon Waters K.K. 34 OH CH3 C H3

Isopropyl methylphosphonic acid (IMPA)

OH CH3

(18)

低

pH

pHでの固定相選択性

での固定相選択性

::

有機ホスホン酸

pH 3

Atl

ti HILIC Sili

1: SIR of 5 Channels ES‐ TIC 3.32e6 1 2,3 4 5 BEH Amide

Atlantis HILIC Silica

で最も保持が強い

BEH Amide と

Atlantis HILIC Silica

では同様の選択性が

得られる

2,3 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 1: SIR of 5 Channels ES‐ TIC 3.32e6 5 1 4,5 BEH HILIC ©2012 Nihon Waters K.K. 35 Compounds 1. PMPA 2. CMPA 3. IBMPA 4. IMPA 5. EMPA 500 ng/mL each 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 1: SIR of 5 Channels ES‐ TIC 3.32e6 1 2,3 4 5 Atlantis HILIC Silica Minutes

BEH Amide

移動相

pH

pH選択性

選択性

::

有機ホスホン酸

1: SIR of 5 Channels ES‐ TIC 3.32e6 2 3

pH 3

Compounds

pH 9でより高い

感度が得られる

pHによらず

選択性は同様

0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 1: SIR of 5 Channels ES‐ TIC 1 2,3 4 5 1 2,3

pH 9

(19)

更なる最適化が必要

1: SIR of 5 Channels ES‐ TIC 3.32e6 1 2,3 BEH Amide 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 ©2012 Nihon Waters K.K. 37 Compounds 1. PMPA 2. CMPA 3. IBMPA 4. IMPA 5. EMPA 500 ng/mL each 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 4 5 Minutes

分析法最適化ステップ

• グラジエント勾配の調整

1

• カラム温度の調整

2

• カラム長と流速の調整

3

• グラジエントの代わりにアイソクラティックモードの使用

• 95:5 ACN:H2O with 10mM バッファまたは0 2%添加剤

各ステップごとに結果を評価。分析の成功基準に達したところでステップ終了。ピーク

形状／分離に問題がある場合は注入溶媒（サンプル溶解溶媒）を検討する。

• 95:5 ACN:H2O with 10mM バッファまたは0.2%添加剤

4

• 移動相中の水の一部を極性の低い溶媒（メタノール、エタノール、IPA

など）に置換

5

(20)

1 2,3 4 99.9% to 0.1% B in 5 min SIR of 5 Channels ES‐ TIC

3.32e6

BEH Amide, pH 9

最適化

最適化ステップ

ステップ

1:

グラジエント勾配の調整

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 4 ₅ 2,3 4 1 SIR of 5 Channels ES‐ TIC 4.18e6 99.9% to 50% B in 5 min Compounds

グラジエント勾配が

緩やかになると

分離が向上

©2012 Nihon Waters K.K. 39 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 SIR of 5 Channels ES‐ TIC 5.12e6 1 2 3 4 5 99.9% to 90% B in 5 min p 1. PMPA 2. CMPA 3. IBMPA 4. IMPA 5. EMPA 500 ng/mL each

30 °C

SIR of 5 Channels ES‐ TIC 5.12e6 1 2 3

BEH Amide, pH 9

緩やかな勾配の

グラジエント

最適化

最適化ステップ

ステップ

2:

カラム温度

SIR of 5 Channels ES‐ TIC 5.08e6 2 1 3 4 5 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 4 5

50 °C

Compounds

グラジエント

温度が上昇すると

分離が向上

©2012 Nihon Waters K.K. 40 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 Minutes 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 2 1 3 4 5 SIR of 5 Channels ES‐ TIC 5.01e6

65 °C

Compounds 1. PMPA 2. CMPA 3. IBMPA 4. IMPA 5. EMPA 500 ng/mL each

(21)

2 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 4.50 5.00 5.50 6.00 f h l

2 1 x 100 mm

分析時間が短い分析法の基準にあう結果を選択

0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 1 3 4 5 SIR of 5 Channels ES‐ TIC

2.1 x 100 mm

Compounds 1. PMPA 2. CMPA 3. IBMPA 4. IMPA 5. EMPA 500 ng/mL each

最終分析法

::

有機ホスホン酸

(22)

迅速

HILIC