乳酸菌のペントース・イソメラーゼに関する研究 V. L. fermentumによるD-キシロース・イソメラーゼの生成-香川大学学術情報リポジトリ

第13巻第2号（1962） 乳酸菌のペントース・イソメテーゼに関する研究 Ⅴ エ．．炸川柳ぬ研に．よるD−キンロー．ス・イソメラ−ゼの生成ヰ

山 中

啓 185 Ⅰ ま え が き 細菌のペントー・ス小イソメラ−ゼはすべて適応的に生成される．すなわちD・キンロース・イソメラーゼの場合， L少∽蝕制（1），P5♂〟dんッdγ・0♪カよJα（2−4），E・COJ査（り，Pα・Sfβ〝㌢β′Jα♪g・Sfよ∴s（6）および5αJ沼0乃βJ′αf．γ♪毎ざα（7）において はすべてD−キンロー・ス生育薗にのみ生成される．．叉乙，鮮血両肌（8−1り，Aβ′0みαCJβ㌢αβγβgβ循β−S（11）および且．cβJi（6） のL・■アラビノ−ス・イソメラ−ゼはすぺてL−アラピノース生育歯にのみ見出されている．しかし乳酸菌のペントー ス・イソメラーゼの生成ほこれら細菌の場合と全く異なることを既に指摘した（12）．すなわちホモ型轍酵乳酸菌（ホ モ乳酸菌と略称）のL∴アラピノース・イソメラーゼはいアラピノースにのみ特異的に適応的に生成されるのに反し で，ヘテロ型醸酵乳酸菌（へ・テロ乳酸菌と略称）のD・キンロー・．ス・イソメラーゼはD・キンロースに適応的に生成さ れるのみならず，他の糖の培地からも酵素は生成される．さらにへテロ乳酸菌のL−アラピノースイソメラーゼお よぴホモ乳酸蘭のエ∬．γわ・ざ緑SのD−キンロ−スイソメラ−ゼの生成ほ構成的であったこの事実，すなわち構成 的なぺソトー∴ス・イソメテーゼの生成碓著眉のへ・テロ乳酸菌が唯一・つの例であ／つて，ヘテロ乳酸蘭のぺソトーヌ代謝 能の特性の一・つであり，かつてKARSTR6M（13）がエ♪β励〃C♂ficαぶのぺントー．スの醸酵性が構成的であるとのべた ことと完全にw・致する なおホモ乳酸菌のL・アラピノ−スイソメラーゼの生成は他の細菌のそれと全く同様と考えられたが，ヘテロ乳 酸菌のD・キジロ−スイソメラーゼの生成に関しては未だ疑問の点が多い．すなわちヘテロ乳酸菌の解糖機構と関 連してこの問題の解析を後雑にしているものと考えられる．そこで本間題について，ニ，三の基礎的条件について検 討を加えた ペントース イソメラ−ゼほすべて細胞内酵素であるので，培養条件における酵素の生成は蘭の生育と関聯する 従って薗の生育に必要な医l子が酵素の生成に必要な【太l子と相関して問題がかなり複雑となる故に本報告において−は 主として本酵素の誘導的生成の基本条件について検討をおこなった小 Ⅱ 実 験 方 法 1・使用薗株 ぺソトースイソメラーゼの生成昆の多いエ占サ仇両sおよび上・gαγ0〝査iについて検討を加えた 彼，主としてエ・一／b7∽β邦彦α∽を用いたその他エJ．γ‘〃♪β㌢露ゎぉよびヱ∴∬．γわ・ざ捉Sについて比較した．エ．方．γわ5〟ぶ 以外はすべてヘテロ乳酸菌である 2・・培 養 菌体を取得するための基本培地としてはりん酸を含まない既報の合成培地を主として用いた（1214） この培地より得た蘭を−A・Cellとして表示した．比較としてりん酸を含む合成培地（14）をも用い，この菌体をP−Cellと して表示した．炭報源は1％の槻を用い，培養は．570C，20時間とした 5‖ 酵素の誘導条件1％グルコ−スを炭素源として1Lの培地を同時に2乃至5個培養し，菌体を遠心分離にて 集め，殺菌蒸潜水にて十分に洗源して遠沈する操作を5匝Ⅰくり返しておこなった．洗液中の残糖をその都度測定し， 残糖のなくなるまでおこなったが，通′隠洗源を5匝】要した 以上の操作で得られた水洗菌体を一党昆の殺菌裁潜水にSuSpendし，菌体弘皮を測定して薗体昆を−・走にした （12mg／ml） イソメラ−ゼの誘導的生成の条件は次のごとく設定した 菌体suspension 5．．Oml ぺ プ ト ン 0．5％ 井本報皆の大部分は昭和55年‖本農芸化学会大会（19る0年4月，東京大学）において発表した

186 香川大学農学部学術報舎 りん酸緩衝液（pH7．4） 2小5×10−2凡才 キミ／ロース（又は他の糖） 1×10−2〟 水にて全容を2Dmlとす すなわち，蘭体以外の各添加物を500ml容の振返フラスコに入れて殺菌した後，菌体を注加レた…誘導はすべて振 盗条件下でおこない，50−520Cにて−5時間振激した 4・生成酵素の定盤 振泡後，振恕液を低温で遠沈（7，000rp．．m，5分）して，反応液と菌体とを分離し，菌 体をさらに1回水洗した．上遼液についてpH，消費キンロノース（残糖）およびキンルロースの生成量を測定した 菌体はそのまゝSuSpenSionとしてイソメラーゼの反応をおこなっても，クトぺソトースの生成ほどく僅かであり， boIateを添加しても効果がないので，すべて無細胞抽出液を調製しておこなった1回の実験に通常4コのフラスコ を用いたが，それぞれの水洗菌体にアルミナを加え／て磨枠し，水紅て抽出して遠沈（10，000×g，5［分）した透明な上 遼を酵素液として用いた． イソメヲ−ゼの反応細成は次のごとくである 抽出液（蛋白500FLg），MgC1210lLモル，トリス緩衝披（pH7．4）25fLモル，D−キVロー・ス20pモル，NaF20FLモル， 水にて全容を50mlとす 570Cで10分間反応させ，10％トリクロル酢酸で反応をとめ，遠沈して除蛋白して後，生成キンルロー・スを測定し たL生成キンロー．ス∵イソメラーゼの単位は上記条件で10分間の反応で1J▲モルのキンルロー・スを生成する酵素鼠を 1単位として辞出した比活性ほ単位を蛋白mg数で除して表示した なお，還元糖，ケトース，ぺソトー・一ヌおよび蛋白は既報（1214）の方法により測定した Ⅱ 実 験 結 果 1。培養条件におけるイソメラーゼ生成に及ぼす要因 微生物における酵素の生成には．多くの因子が要求され，細胞内で酵素が生成された後，細胞外へ主として放出され る細胞外酵素，例えばアミラーゼ，プロデアーゼその他について数多くの検討がなされているぺソトース・イソメ ラーゼほ細胞内酵素であるので，まず増益条件におけるイソメラーゼの生成の変動について検討した．−・般に細菌の 生育は，N源，C源，無機庵郊，ビタミン及び教義亘成分等に支配され，さらに酵素の生成は培養時間と相関する．こ の中無機塩類については次報で報告する（1さ） 闇 炭素源 第Ⅱ報（12）においては，イソメラーゼを検討することな目的としたため，使月ヨ酵素星を多くし，ま た反応時間も良くしておこなったその結果，へ・テロ菌ではぺソトース以外の撒からもイソメラL−・ゼの生成が認めら れたので，その墨的変動を明らかにするため，5株について炭素擬としてグルコースおよびキンロースの場合につい て，歯の生育，イソメヲ−ゼの比活性と全酵素墨とについて検討した（第1表） その結果，D−キンロースイソメラーゼはいずれもD−キンロ−スを炭素源とした時にその生成は最大であるが， グルコ−・ス生育菌体中にも少量生成される“エgα．γ0〝≠よ，エ＝飢叩最・SおよぴエJγCO♪β7・蕗dほグルコースには余り 生育しないが，両ぺンt・−ス・イソメラーゼを生成し，その生成昆の比はグルコ−ス培地の蘭で1：25−2一．5であ り，第Ⅷ報（12）の結果とよく−‖致したさらにD・キンロース・イソメラーゼの生成昆の最も多いエい占γの再Sを用い て，培地の炭素源のキンロース景な変化ざせて，イソメヲ−ゼ生成嵐の変動をしらべた その結巣，D一キンロース・イソメテーゼは培地中のキンロ冊スの嵐に比例して薗の生育と共に増大するので本酵 素の生成は一応適応的と考えられるしかしレアラビノー・スイソメラーゼはグルコース単独培地のみならず，キ ンロース単独培地紅も必ず検出された （2）N 源 基本培地のN源としての1％ぺプトンを％および全部をカザミノ酸におきかえて菌の生育とイソメ ラ−ゼの生成との！封遁について検討した．使用菌株はD−キンロ−ス・イソメヲ−ゼのみを生成するエノ旨7僧♂搾J〟椚 （1214）である‖ この場合，試験管培地としては，培地中のペプトンをカザミノ酸におきかえたものに接種した‖ 培地 の他の成分はすべて同一・である その結果，酵母エキス，カザミノ職，塩類からなる培地では薗の旺盛な生育は得られず，D・キンロ−ス1イソメラ ーゼもはとんど生成されないぺプトンを添加すれば薗の生育が増すので，ペプトン中に本菌の生育に必須な因子が 含まれて−いるものと推定される ざらに培地のペプトンを05％より1％に増すと，生育は変化しないが，イソメラ

第13巻解2号（1962） 187 ーゼの生成は更に増大したので，ペプトン中に酵素の生成に有効な未知因子も存在するものと考えられる。 なお，りん酸は菌の生育および酵素の生成共に必要としないく14〉 （3）培養時間 ペントーストイソメラ−ゼの生成は培養時間により大きく支配され，エ＝わ・親心のD−キジロース イソメラ−ゼは1占時間の培養で生成邑は巌大となり，以後急激に減少し，40時間の培養で完全に消失したすなわ 第1表 ぺソトー・ス・イソメラ−・ゼの生成に及ばす炭素源の影響 D・キンロース イソメヲ−・ゼ L−アラピノース イメソラーゼ 抽出液 蛋 白 （mg） ⅩⅠ：AI≠1

し∴こ‥−・．）

炭 素 源 （1％） 生 育 皮 （0D巾580） 菌 株 比活性 比活性 1：2．28 1：027 グルコ−ス D−キンロー．ヌ Lg（Z．γ0〃よ去 グルコース D・キンロ−ス 01・92】 21・8

“7】208．0

1：0．．52 1：0‖05 エ．．み7・針山5

5・0い17

52い2】○＝92 1：2小49 1：041 グルコ−ス D−キi／ロース エJ．γCO♪βγSよ（よ グルコ−・ス D・キジロース エ．一方γJos〟S 0∩2L培地，20時間増益 率1ⅩⅠ，D・キンロ−ス，イソメラ−ゼ；AI，L・アラピノース・イソメヲ−ゼ ヰ204L培地， ㌔44時間培養，0．．1％グルコ、−ス添加 第2 表 ペントースルイソメラ−ゼの生成に及ぼすキジロ−スの影響（L∂′創扉S） 0．2L，20時間培養 第 5 表 D・キンロ−ス・イソメヲ−ゼの生成に久ぼすべプトンの影響 エ。わ7・∽β乃′〝桝，0・4 L，炭素源1％D・キンローース，40時間培養

188 香川大学曲学部学術報舎

第4 表 D・キンローー・ス・イソメラーゼの生成に及ぼす増御寺間の影響

01．4L培地

ち蘭のgrowth phaseに．おいて，イソメラーゼはかなり禾安定である小 L．fbrmenium O D−キシロースイソメ ラーゼはやや安定であり，40−45時間で故大に達するが，やほり減少した 2… ベント・−スイソメラーーゼの誘導について菌株の選択 ヘテロ乳酸菌のぺソトー・ス・イソメラーゼの適応的な生成を検討するために菌株の選定を次のごとくしてこおこなっ た すなわちエ1．みγβ〃ま5，エ．g‘7押祓ぉよびエ．．ノわ〃プβ揮わ‘沼を用いた．．前2者は両イソメラーゼ生成菌株であり， 第 5 表 ペントース・イソメラーゼの振出による変動（振泡，500c，5時間） Aエ。g（7，γ0〃蒼古稽 ヰ1％グルコース20時間生育蘭 B．エ．加増扉．sヰ ヰ1％グルコ−・ス20時間生育蘭

189 鰐13巻第2号（1962） C小 エ．仲川鯨扉捌が ヰ1％グルコ−・ス20時間生育薗 D√ エ∂γβ〃i．s樽 場1％グルコース＋0‖1％D−キンロ−ス20時間生育薗 後者ほL−キンロ−スイソメラーゼのみを生成する薗糠である エ‖gαγ0〝よ吉ではグルコ−ス生育蘭に両イソメラーゼが認められるが，この活性はD−キンロース或いはL−アラビ ノ−スを添加して振滋しても大きな変動ほ認められなかった1・・アラピノース・イソメラー‥ゼの生成の少ないエ・・ ∂γβり壷sでは，アラピノースと振勤した時にレアラビノ−スイソメテーゼが増加したが，D・キンロース1イソメラ ーゼはいずれの糖の添加によっても変軌ほはとんど認められなか／つた．上記2株のグルコーヌ生育菌はグルコースお よぴL・アラピノースを引I寺間の坂滋で90−97％消出す−るのに反して，D・キンロースほエgα．ハ川崩でほ全く消蟄さ れず，エ．わ・の頭・Sでほ8％しか消蟄されないこの事実は上記2株のヘテロ乳酸菌のL−アラビノ−・スの醗酵能は構 成的であるに反して，D−キンロースの醸酵能は全く適応的であることを示している小 そこでD・キンロ−スの代謝能 を増すために1％グルコースと0‖1％D−キンロ−スを炭素源として20時間培養した∴乙∂′βぴ∠rsの菌体について一同様 の誘導賽験をおこなったここに得られた薗体はD・キンロ−スを9る−99％消蟄することができたが，1−アラビノ−ス の消費は50−51％にまで低下した。またぺソトー・スを添加して振滋しても両イソメラーゼ嵐はわずかしか増加せず， L−アラピノースを添加して振滋しても既に多嵐に存在するD−キンロースいイソメラ−ゼよりレアラビノースいイソ メラーゼが生成される可能性は否定的であり，両ぺソトースイソメラ−ゼの相互転換による生成は本条件では困雉 であろうと推定された 以上の結果から，エ．ル”“湘加常はグルコ−スでかなりよく生育し，かつグルコ−ス生育菌体はD・キソロ−スを 消費することができ，D・キンロ」−ス・イソメラーーゼの生成嵐が少なく，かつ1−アラピノースイソメラ−ゼを全く 生成しない等の理由から，以下の兜験は上／〝仙川知彬を用いて検討を加えた るい D−キシロース イソメラーゼの誘導に及ぼす■要因 多くの酵素の誘導的生成についてほ，エネルギ−源としてりん酸を，酵素蛋白の素材としてアミノ酸を，誘導剤と 共に要求されることが明らかにされているこれら諸園子の段通条件について検討し，誘導の基礎的条件を設定した． （1）N 源 ぺプトンとカザミノ駿について比較したところ，ぺプトンの添加が有効であり，0‖5％のペプトン を添加して以下の実験をおこなったこれほ前述したごとく，ぺプトン中の未知物質によるものと思われた． （2）り ん酸 酵素の生成解りん酸の添加の影響はかなり嶽著であった（第2図）このりん酸は酵素生成において

香川大学鹿学部学術報舎 190 エネルギー・源として有効と思われるが，P・CellとA・Ce】1の間に差はなく，かえってA・Ce11の方が生成酵素鼠が多か ったので，主培地中のりん酸の有無は酵素の誘導俄に影響を与えなかった．以下の実験はすぺてA−Cellを使用した このりん酸の最適濃度は2．．5−5×10岬2〟であり，これ以上の高温皮ではかえって−酵素の生成を阻害した（第5区Ⅰ） また各pHのりん酸緩衝液2．5×10￣2〟を用いて酵素の生成の最適pHを検討した結果，pH7−8の間であった（第4 図）ハ 0 20 1 ベントース︵叩︶ 0 2 10 ペンーース︵叩︶ 0 8 2 4 6 生成キンロース・イソメラーゼ︵U︶ 生成キシローライソメラーゼ︵U︶ 1 25 50 りん赦（×10￣gM） 罪2図 りん酸の膨響 1u A・Cell，N源 0、5％ぺプトン 2，P−Cell，N源1％カザミノ酸 嬰 撃て 〓い ガト刀 の 源 N 図 第 酸 ン ノ ト ヽヽ＼ ブザ ぺカ 源源 N N e e C C A P l ︵・︼ 0 0 2 ベントース︵mg︶ 生成キシロース・イソメラーゼ︵U︶ 5 10 15 20 25 りん酸（×10丁2M） 第5図 高狼皮りん酸による阻害 A−Cell，N・源 05％ペプトンpH7小4 6 7 8 pH 第4図 pH の壱汐響

191 第】3巻第2骨（1962） （3）炭素源 酵素の生成において多くの場合，酵素の誘導剤は基質であるが，誘導剤の機能（Function）と基 質の機能とほ別である（16）本酵素の場合，基層のD−キンロースが誘導剤として有効であり，D・キジロース，D一キ ンルロース以外に．有効な炭素源ほなかった（滞る表）．その最適潰皮ほ郡5区匿示した如く，10【2〟において一般大で あり，102，2×10∼2〟でほ同一・であ．⊃た．本実働の場合，D−キンロースは誘導剤と共にエネルギー源として利用 されているので，高批度が要求されるものとノl乱われる小 次いでエネルギ一滴ミとして各稗糖類をキンロー∵ヌと同濃度（10￣9〝）添加して振現した結果は第7表のどとくであ 肇 占 表 糖 ≡敏 の 影 響 糖 類 （10￣瑚4） −

一一

ト コ ノ ク ルラン グ フ マ ス ス ス ス ス ヌ D・キ ン ロ D・キ ン ル ロ L − キ ンノ ロ 一一一 L−ア ラ ビ ノ− ス D−ア ラ ヒ ノ−ス リ ポ − ス グ ル コ ン 酸 2 −ケト・グルコン酸 マ ル ト − ス ン コ．ク ロ ー ヌ 6 8 2 4 10 生成キシb−ス・イソメラーゼ︵U︶ 第 5 図 キ ン ロ」−スの影響 N源 0．5％ペプトン，りん酸（pH7い4）2．5×1ロ￣W

192 香川大学農学部学術報告 第 7 衰 糖 顆 添 加 に よ る 影 響

生成D・キンロース・イソメラーゼ

第13巻滞2号（1962） 193 ったい すなわち，シ，ユ、クロース，ラクトーヌの添加で酵素の生成鼠はかなり増加したこれに反してグルコン放でほ 逆に生成が阻害された グルコ【スについて，0，5×10￣3，10−2，2×10￣2凡才をそれぞれD・キレロ−ス5×10￣3，10−2，2×10￣2〟紅 添加して誘導をおこなった結果を第8表に示す 特紅キレロ−スの濃度の低い時，グルコ−・スの添加にJりイソメラーゼの生成ほ促進された．しかしグルコ−スの 高濃度ではpHが著しく酸性になりキジロースの消費が少 なくなり，酵索の生成が阻害された （4）菌体のage 酵素の合成能（生成能）は菌体のage によりかなり変動するが，山般にStationary phase療前 の細胞が最大といわれている木蘭のイソメヲ−ゼの生成 能紅おいても44時間培養菌体（キンロ一ス1イソメラーゼ の生成匿ほ叔大の培養時間，第4表）ではかえ．って酵素の 生成餞は低く，20時間培養菌体のカが大であった（第9 表卜 第9表 イソメラ−ゼの誘導における菌体昭e の影響 生成D−キンロ−ス・イソメラーゼ 培 養 時間 （bI） 仝 酵 素 j孟 （U） 比 活 性 （5）振螢時間 本蘭のD−キンロース・イソメラーゼの生 成ほ明らかに振数時間と共に消費キンロー㌧スの増加に従っ て増加した（第d図）しかし2口時間後においてほ，−・皮 生成された酵素も著しく減少したので，培養実験の欝4表 の結果と共にCe111evelにおいてもかなり不安定な酵素と考えられる 第占図 振塩崎間の影響 Ⅳ 要 約 細菌のペントースイソメラーゼはいずれも培養実験の姉弟から適応的と推定されているのみでその適応的生成に ついては未だ全く検討されてこいない エ．仲川摘油川のD・・キンロースイソメラーゼについて：その適応の基本条件を検討した結果を要約すると次のご とくである （1）N源として0．5％のペプトンが必要である （2）エネルギ一源として2・・5−5×て0￣∠〟のりん酸が必要であり，その生成の最適pHほ7−8である （3）誘喝ぐ剤としては基質のD−キンロースおよびD・・キンルロースのみ有効であり，少墨のエネルギー源としての糖 類の添加把よりやや促進される 引 用 文 献 （1）MITSUHASHl，S。，LAMPEN，J．0：JBiol‖ （41HocHSTER．R．M．：Biochim。Biophys，Acta， Cカβ∽−リ204，1011（1955） 1る，292（1955） （2）HocHSTER，R．M，WATSON，R W．：］．Am．（5）LrITAUER，U．．Z，VoLCANI，B．．軋，BERG・ Chem．Soc。，75，5284（1955） MANN，E．D．，：［bid。，18，525（1955） 3） ∵Aれかβ飯南沼」鈍頑一γ・Sり48，（6）SLEIN，MいW＼：／．A桝．C如沼5♂ぐい，77，1（∼占5 【 120（1954）， （1955）・

194 （7）KLINE，E．S，BARON，L…S“：AY・ch… Biochem β去〃♪ゐγS．．，るd，128（1957） （8）LAMPEN，J．LO。：AbstI．Proc．Am．Chem． Soc・，44c（1954）；私信（9−15，19る0） （9）BuRMA，D．B．，TAI（AGI，Y，SMYRN10TIS，P Z・：ダ如k川励の令fケ別1，1る，1る1（1957） （10）HEATH，臥C．，HoRECKER，B”L．，SMYRNIOrTS， P．Z巾，TAKAGI，Y。：．JBiol”Chem。，251，1051 （1958） （11）SIMPSON，F．．J．，WooD，W．A．：］．Am．Chem 5βC．，78，5452（195る） （12）YAMANAKA，K小：Bull．AgrnChem，SocJaPan， 香川大学農学部学術報告 24，510（19占0） 化3）KARSTR（うM∴H：助gd．．β乃Zγ∽ノわタ。SCカ．，7，550 （1958） （14）YAMANAKA，K”：BullりAgr．．ChemSoc小JaPan， 24，505（19る0）．

（15l＋

，HIGASIfrARA，Tu：Agr．．Biol」Chem． （投稿中）；日本農芸化学会関西支部節179回講演会， 中部支部節29回例回合同講演会（5月27日，19dl，岐 阜市）にて発露 116）MoNOD，，丁，CoHN，M…：．乳如．．わヱガ搾g卵刀OJ．．， 13，d7（1952）

Studies on the pentoミeiミOmeraSeS Oflactic acid bacteria

V Formation of D−ⅩyloseisomerIaSe by Lactobacillus ferme；？tum Kei YAMANAKA

Summary Fundamental studies on theindl】Ced formation of D”Ⅹyloseisomerase fromllaciobacillus fermentum weIe carried out

In shaking the glucose・grOWn Cells，additions of peptone，phosphate，and D・Ⅹylose were necessary foI

production ofisomerase，and optimalconditions of theiringredients were as follows；With O．5％peptone，

2」5−5×1P山2Mphosphate（pH7−r8）andト2×10▲￣2MD・Ⅹylose，maXimalproduction of enzyme was obta−

ined．