はじめに
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目印の効用
従来､フローサイトメトリー（FCM）の使用目的は､細胞集団の中のあるポピュレーションの割合（陽性率）を調べることが中心でし た｡しかし､今日､造血幹細胞､残存白血球､CD4 陽性 T 細胞数などポピュレーションの割合と同時に､その細胞実数（絶対数）の 測定を必要とするアプリケーションが要求されてきています｡原理
細胞絶対数測定には､以下のような方法があります｡ 測定方式 特徴 あらかじめ調べたサンプル中の総細胞数と 目的とする細胞集団の陽性率から換算｡ あらかじめ､総細胞数がわかっていれば､特別な装置を必要としないので簡便だ が､試験管間のゲート内の目的細胞の純度･回収率のばらつき等に影響を受け る｡溶血不良の影響を受ける。 一定時間測定し､計測細胞と流速から換算｡ 単位時間当たりのサンプルの流速の誤差が､絶対数データの誤差になる｡ あ らゆるサンプルとフローサイトメーターで測定可能｡ 定量分取機構による測定｡ （シリンジやサンプリングバルブなどの機 構） あらゆるサンプルで可能｡装置の精度が重要。細胞濃度が低い場合､十分な数 を測定できないことがある｡サンプル定量分取機構のあるフローサイトメーター でのみ測定可能｡ 内部標準を用いて､目的細胞と標準物質の 各々の計測イベントから絶対数を直接比例 計算｡ サンプル量に関係なくあらゆるサンプルとフローサイトメーターで測定可能｡目 的細胞の「陽性率」は､絶対数の計算に影響しないので､溶血不良などの場合 も正確な 絶対数測定が可能｡十分に均一に分散させることがポイント。 Flow-Count は､内部標準法に細胞絶対数を測定する試薬です｡ Flow-Count は､FL1～FL4（緑～深紅色）のすべての蛍光物 質がついた約 10μm のラテックスビーズ懸濁液です｡ ビーズの濃度（個／μL）が Lot 毎に明記されています。Flow-Count を サンプル浮遊液に混和するだけで､ビーズの数と目的細胞数の比率から細胞の絶対数を求めることができます｡Flow-Count
TM
を用いた
細胞絶対数の測定
5
>>http://www.bc-cytometry.com
Application Note ５
特徴
1. FITC から PC5 に至る幅広い蛍光スペクトルに対応しており､4 カラー分析にも使用できます｡ 2. 蛍光強度が十分強いので､陽性細胞領域から Flow-Count を容易に区別しゲートアウトできます｡ 3. Flow-Count は､保存に伴う変性や凝集を防ぎ､なおかつ測定に影響を与えないように工夫された溶媒に懸濁されており､サンプ ル溶液中に確実に分散されます｡ 4. 懸濁液なので試料中の細胞濃度にあわせて添加量を加減することができます｡ 5. ビーズ懸濁液を測定直前に添加するので､貪食や凝集によりビーズ数が変化する恐れがありません｡ 6. ビーズの濃度（アッセイ値）は､血球計数の基準分析機であるコールターZBI を用い､各製品ごとに正確かつ精密に検定されてい ます｡ 7. ロットごとのアッセイ値が､添付説明書に 1μL 中の粒子数として記載されています｡8. EPICS XL SystemⅡでは､ソフトウエアの CAL リージョン機能により絶対数の自動計算ができます｡
FCM 測定
検体と等量混合
-3- Application Note 5
使用方法
1. サンプル 100μL を試験管に分注します｡ 2. 目的細胞を区別するために染色が必要な場合は､抗体等で染色します｡ 3. 溶血が必要な場合は､溶血操作をします｡ 溶血操作が必要ない場合は､PBS で約 1mL に希釈します。 4. 室温に戻した Flow-Count を、泡が立たないよう 10 秒間､よく撹拌します｡ Flow-Count を 100μL サンプルに添加します＊1｡ 5. 測定直前に 5 秒間よく撹拌し､FCM で測定します＊2｡ ＊1: サンプルとFlow-Countを分注するピペットは同じものを用いてください｡ （ピッペットのキャリブレーション誤差を相殺できます｡） ＊2: Flow-Countビーズは沈殿しやすいので、ボルテックスミキサー等を用いて、使用前と測定前に必ずよく攪拌してください。 EPICS XL SystemⅡで測定する場合は､CALリージョンにアッセイ値を入力し､目的細胞の絶対数を自動計算させる ことができます｡ CALリージョンの設定方法は､EPICS XL SystemⅡマニュアルをご参照ください｡ EPICS XL SystemⅡ以外のフローサイトメーターでは､以下の計算式に従って目的細胞の絶対数を測定してください｡ 目的細胞の絶対数 ＝ Flow-Count アッセイ値 × 等量添加でない場合は､サンプル添加量とFlow-Count添加量の比（希釈率）を計算式にかけてください｡ 目的細胞の絶対数 ＝Flow-Count アッセイ値 × × の測定イベント数 ト数 目的細胞の測定イベン Count -Flow サンプル添加量 添加量 Count -Flow （個／μL） （個／μL） の測定イベント数 ト数 目的細胞の測定イベン Count -FlowApplication Note 5 -4-
測定例
① －白血球数の測定－
抗体でサンプル処理をする前に､あらかじめ検体中の白血球数を確認したいとき便利な方法です。この例では全血未洗浄法で すが、全血洗浄法でも可能です。Ⅰ.サンプル
ヒト末梢血Ⅱ.試薬（ベックマン・コールター社製品）
Flow-Count 製品番号 7547053 イムノプレップ試薬 製品番号 7546946（100 テスト､Q-Prep 用） または製品番号 7546999（300 テスト､TQ-Prep 用） 蒸留水（ベックマン・コールター社以外の FCM をご使用の場合）Ⅲ.サンプル調製
1. 全血を 12×75mm 試験管に 100μL 分注します（この時､管壁に血液がつかないように注意します）｡ 2. Q-Prep（または TQ-Prep）で溶血します｡ 3. EPICS XL SystemⅡで測定する場合は､4.に進んでください｡ ベックマン・コールター社以外の FCM をご使用の場合､ Q-Prep で溶血後､蒸留水を 500μL を添加します（TQ-Prep の場合は､試薬モードに切り換えてください）｡ 4. 室温に戻した Flow-Count を泡が立たないよう 10 秒間､よく撹拌し、サンプルに 100μL 添加します（洗浄法の場合は、洗 浄後に添加する）｡ 5. 測定直前に 5 秒間よく撹拌し､FCM で測定します。Ⅳ.機器調整
1. 通常の方法で､FCM をセットアップします｡ 2. 絶対数測定用プロトコルを呼び出します｡プロトコルがない場合は､下図のデータ例のように設定します｡ 3. 必要なら､感度条件を微調整します｡ 4. EPICS XL SystemⅡでは､CAL リージョンが 1000 イベント以上になると､ ｢カウント｣値には､自動計算された絶対数（個／ μL）が表示されます｡ ほかの FCM では､少なくとも 1000 イベント以上になるまで測定します｡ 5. サンプル測定を終了し絶対数を確認または計算します｡Ⅴ.データ例
（EPICS XL SystemⅡ） ① A（リンパ球数）カウント =2152 個／μL
② G（白血球数）カウント =6452 個／μL
-5- Application Note 5
測定例
② －
CD4
陽性
T
細胞の絶対数測定－
HIV 陽性検体等の全血中の CD4 陽性 T 細胞の絶対数をイムノフェノタイピングと同時に測定できます。この例では、CD4-FITC／CD8-PE 抗体を使用していますが、CD3／CD4 を用いると、より正確に CD4 陽性 T 細胞を測定できます。Ⅰ.サンプル
ヒト末梢血（全血）Ⅱ.試薬（ベックマン・コールター社製品）
CD4-FITC／CD8-PE 抗体 製品番号 IM1385（サイトスタット 6604614） または CD3-FITC／CD4-PE 抗体 製品番号 IM1287（サイトスタット 6604929） Flow-Count 製品番号 7547053 イムノプレップ試薬 製品番号 7546946（100 テスト､Q-Prep 用） または製品番号 7546999（300 テスト､TQ-Prep 用） 蒸留水（ベックマン・コールター社以外の FCM をご使用の場合）Ⅲ.サンプル調製
1. IOTest モノクローナル抗体（CD4-FITC／CD8-PE）を試験管（12×75mm）に 20μL 分注します｡サイトスタットモノクロー ナル抗体の場合は、10μL 分注します。 2. 全血を試験管に 100μL 分注し、よく攪拌します（この時､管壁に血液がつかないように注意します）｡ 3. 室温、遮光下で､15 分間反応させます｡ 4. Q-Prep（または TQ-Prep）で溶血・固定します｡ 5. EPICS XL SystemⅡで測定する場合は､6.に進んでください｡ ベックマン・コールター社以外の FCM をご使用の場合､Q-Prep で溶血後､蒸留水を 500μL を添加します（TQ-をご使用の場合､Q-Prep の場合は､試薬モードに切り換えてください）｡ 6. 室温に戻した Flow-Count を泡が立たないよう 10 秒間､よく撹拌し、サンプルに添 100μL 加します｡ 7. 測定直前に 5 秒間よく撹拌し､FCM で測定します｡Ⅳ.機器調整
1. 通常の方法で､FCM をセットアップします｡ 2. 絶対数測定用プロトコルを呼び出します｡プロトコルがない場合は､下図のデータ例のように設定します｡ 3. 必要なら､感度条件を微調整します｡ 4. EPICS XL SystemⅡでは､CAL リージョンが 1000 イベント以上になると､｢カウント｣値には､自動計算された絶対数 （個／ μL）が表示されます｡他の FCM では､少なくとも 1000 イベント以上になるまで測定します｡ 5. サンプル測定を終了し絶対数を確認または計算します｡Ⅴ.データ例
① H4（CD4 陽性細胞数）カウント =767 個／μL
Application Note 5 -6-
測定例
③ －造血幹細胞測定－
注意： 洗浄により、細胞絶対数に誤差が生じる場合があります。 CD45 と CD34 の 組 み 合 わ せ で ､ 造 血 幹 細 胞 を 検 出 し ま す ｡ こ の 例 で は ､ No-Wash 法 で 分 析 を 行 っ て い ま す が ､ CD33,CD38,CD117 等を組み合わせた 3 カラー分析では､PBS で 1 回洗浄､PBS1mL に再浮遊後､Flow-Count を添加します｡Ⅰ.サンプル
アフェレーシス採取サンプルⅡ.試薬
コントロール（IgG1-PC5） 製品番号 IM2663 CD34-PC5 製品番号 IM2648 CD45-FITC 製品番号 IM0647 Flow-Count 製品番号 7547053 マウス IgG （SIGMA） 商品番号 I5381 IOTest3 溶血試薬 製品番号 IM3514Ⅲ.サンプル調製
1. 白血球数を血算機（LH500 等）または Flow-Count で測定し､細胞数を 5×106～1×107／mL になるよう PBS 等で調整し ます｡ 2. 細胞数を調整したアフェレーシス採取サンプルを 12×75mm 試験管 2 本 （ ｢テスト｣および ｢コントロール｣）*に 100μL 分注します（この時､管壁にサンプルがつかないように注意します）｡ 3. マウス IgG（300μg／mL）30μL を各試験管に添加します｡ 4. モノクローナル抗体（CD34-PC5 と CD45-FITC）｢テスト｣の試験管に 20μL ずつ分注します*｡ ｢コントロール｣の試験管 には､CD45-FITC と IgG1-PC5 を 20μL を分注します｡ 5. 室温､遮光にて 15 分反応させます｡ 6. IOTest3 溶血試薬（塩化アンモニウム溶血剤）で溶血します｡ 7. 室温に戻した Flow-Count を泡が立たないよう 10 秒間､よく撹拌し、サンプルに 100μL 添加します｡ 8. 測定直前に 5 秒間よく撹拌し､FCM で測定します｡＊
： ｢テスト｣の試験管を2本（コントロールを含めると3本）作製し､重複測定することにより､測定値の信頼性が高まります｡Ⅳ.機器調整
1. 通常の方法で､FCM をセットアップします｡ 2. 絶対数測定用プロトコルを呼び出します｡プロトコールがない場合は､下図のデータ例のように設定します｡ 3. 必要なら､感度条件を微調整します｡ 4. ｢テスト｣､｢コントロール｣の順に測定します｡ 5. EPICS XL SystemⅡでは､CAL リージョンが 1000 イベント以上になると､｢カウント｣値には､自動計算された絶対数 （個／ μL）が表示されます｡ 他の FCM では､少なくとも 1000 イベント以上になるまで測定します｡ 6. サンプル測定を終了し絶対数を確認または計算します｡-7- Application Note 5
Ⅴ.データ例
Ⅵ.参考文献
Robert Sutherland et al. : The ISHAGE Guidelines for CD34+ Cell Determination by Flow Cytometry :
JOURNAL OF HEMATOTHERAPY 5 : 213-226（1996） ① CD34 :Positive CD45 :Dim SS :Low CAL リージョン （Flow-Count） ① D（造血幹細胞数）カウント =
595 個／μL
Application Note ５
