Microsoft PowerPoint - 薬学会2009新技術2シラノール基.ppt

㈱ クロマニック テクノロジーズ

長 江 徳 和

シラノール基

シラノール基

は塩基性化合物のテー

は塩基性化合物のテー

リングの原因

リングの原因

–

–

いや違う！

いや違う！

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【

【

緒言

緒言

】

】

„ 逆相型固定相中の残存シラノール基は，吸着や ピークテーリング等の原因であるとされている „ 残存シラノール基に基づく主な相互作用は，吸着， イオン交換，水素結合である „ これらの二次効果相互作用を積極的に利用するこ とで，極性化合物に対して特異的な保持を示す新 規な逆相固定相の創出が可能であると思われる „ 二次効果相互作用の制御方法として熱処理を行っ たC18固定相を用いた塩基性化合物と金属配位性 化合物の分離を行った

シラノールの形態とピリジンのピーク

シラノールの形態とピリジンのピーク

O Si O O H O Si Si O Si O O H Si O H O Si O H H C18カラムを用いた場合の ピリジンのピーク形状 60% CH₃OH/H₂O Column A Column B Column C Isolated Silanol Vicinal Silanol Geminal Silanol

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疑問

疑問

„ シラノール基は塩基性化合物のテーリングの原因 か？ „ シリカゲルを用いた，逆相と同じ移動相で分離す るヒリックモードでは，塩基性化合物はテーリン グしない！ „ 従って，シリカゲル表面に存在するシラノール基 は塩基性化合物のテーリングの原因ではない „ しかし，残存シラノール基を含むC18固定相では 塩基性化合物はテーリングする „ なぜか？

シリカゲルによる

シリカゲルによる

ヒリックモードの

ヒリックモードの

塩基性化合物の分離

塩基性化合物の分離

Waters技術資料より 塩基性化合物は有機溶媒と緩衝液の移動相でテーリングすることなく溶出する

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シリカゲルのヒリックモードにおける保持機構

シリカゲルのヒリックモードにおける保持機構

※日本ウォーターズ㈱資料を基に作成 Silica gel (HILIC) Gradient 2.0mL/min ODS silica (RP) Gradient 1.4mL/min 1 2 2 O Si O OH O Si OH O Si Si OH O Si O O Si O O Si O Si O Si O Si O Si O OH O OH O Si O H O -Si O -Si O O _O -OH O -OH O O O Si O Si O O O Si O H OH Si O O Si O O O Si O O Si O Si O O O O Si O O Si O O OH O O O O Si O O O Si O H O O O Si O O O Si O O O O O Si O O O O Si Si O O Analyte Analyte Analyte Mobile Phase Mobile Phase Electrostatic Interaction Hydrophilic Partitioning H₂O H2O H2O H₂O H₂O H2O H2O H₂O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H2O H₂O 1 Morphine 3-β-D-Glucuronide Morphine

逆相での塩基性化合物のテーリングの原因は？

逆相での塩基性化合物のテーリングの原因は？

疎水場の近くに存在するシラノール基は，疎水場の影響により 水和が妨害され，不完全な水和状態である シラノール基が安定に水和している状態では塩基性化合物はテーリングしない シリカゲルを用いるヒリックモードでは塩基性化合物良好 もし不完全な水和状態のシラノール基が存在すれば イオン交換的吸着により塩基性化合物はテーリングする

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C18

C18

固定相の残存シラノール基の状態

固定相の残存シラノール基の状態

高吸着性 シラノール O Si H O Si H O Si O O Si Si H O H H

塩基性化合物をテーリングさせなくする方法

塩基性化合物をテーリングさせなくする方法

水和の不十分な，または水和していないシラノール基をなくす シラノール基のシロキサン化 疎水場近くのシラノール基のみシ ロキサン化，疎水場から離れた水 和しているシラノール基はそのまま 塩基性化合物はテーリングせず， イオン交換相互作用で，保持増加 TMS化などのエンドキャッピング エンドキャップにより，さらに疎水場が 増え，全てのシラノール基をエンド キャップすることになる 塩基性化合物はテーリングしないが， 疎水性が増し，保持は減少する 一般的なエンドキャップ型C18 新規なノンエンドキャップ型C18

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C18

C18

固定相の残存シラノール基の状態

固定相の残存シラノール基の状態

高吸着性 シラノール O Si H O Si H O Si O O Si Si H O H H シロキサン 結合に変換 O Si H O Si O O Si Si Si O H H

【

【

実験

実験

】

】

„ 基材シリカゲル „ 細孔径：12 nm，比表面積：340 m2/g，粒子径：5 µm „ オクタデシルトリクロロシランの導入 „ 炭素含量：14% „ 比較対象として，TMS化固定相も調製 „ 熱処理 (真空乾燥機中で熱処理，シロキサン化) „ 処理温度：200 °C，処理時間：48時間 „ 有機溶媒/緩衝液で水和出来る部位の再シラノール化 „ 比較対照として，未熱処理固定相も調製 „ 評価 „ カラム：内径4.6 mm，長さ150 mm „ 移動相：メタノールまたはアセトニトリル/水または緩衝液

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ピリジン

ピリジン

の

の

ピーク

ピーク

形状

形状

比較

比較

移動相: CH₃OH/H₂O(30:70) 流 速: 1.0 mL/min 温 度: 40 ºC 試 料: 1=ウラシル ② ②==ピリジンピリジン 3=フェノール a) b) c) １ １ １ 3 ② ② 3 3 0 5 10 15 20

Retention time / min

② ② ② ② 熱処理C18 Sunrise C18-SAC 未熱処理C18 TMS化C18 Sunrise C18 OH N N H N H O O

キサンチン類の分離

キサンチン類の分離

カラムサイズ：4.6 x 150 mm 移動相：メタノール/20mMリン酸二水素カリウム pH4.5 (30:70) 流 速：1.0 mL/min 温 度：40 ºC 1= テオブロミン 2= テオフィリン 3= カフェイン 4= フェノール N N N H N H O C H₃ O CH₃ N N N N H O C H₃ O CH₃ CH₃ OH N N H N N H O O CH₃ CH₃ 熱処理C18 Sunrise C18-SAC 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Time (min) 1 1 2 2 3 3 4 4 TMS化C18 Sunrise C18

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三環系抗うつ剤の分離

三環系抗うつ剤の分離

TMS化 C18 Sunrise C18 アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液 pH6.0 (80:20) 熱処理C18 Sunrise C18-SAC アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液 pH6.0 (80:20) 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 保持時間(min) N H N H O O O OH NH CH3 CH3 NH CH3 N CH3 CH3 1=ウラシル 2=プロプラノロール 3=ノルトリプチリン 4=アミトリプチリン 5=トルエン CH3

移動相

移動相

pH

pH

による保持時間の制御

による保持時間の制御

イオン交換相互作用の保持機構が働く成分は移動相pHにより保持を大きく変化させることが可能 アセトニトリル/ 20mMリン酸緩衝液pH3.0 (50:50) アセトニトリル/ 20mMリン酸緩衝液pH4.5 (50:50) 1 1 2 2 3 3 4 5 5 カラム：TMS化C18, Sunrise C18 4.6 x 150 mm 熱処理C18, Sunrise C18-SAC 4.6 x 150 mm 流速：1.0 mL/min 温度：40 ºC 試料：1=ウラシル，2=プロプラノロール， 3=ノルトリプチリン， 4=アミトリプチリン，5=トルエン アセトニトリル/20mMリン酸緩衝液pH6.0 (80:20) 1 2 3 4 5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4

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酢酸アンモニウムを用いた塩基性化合物の

酢酸アンモニウムを用いた塩基性化合物の

分離：

分離：

pH

pH

の影響

の影響

0 5 10 15 20 25 30 35 40 保持時間(min) カラム：熱処理C18，Sunrise C18-SAC 4.6 x 150 mm 移動相： アセトニトリル/100mM 酢酸アンモニウム (70:30) 流速：1.0 mL/min 温度：40 ºC 試料：1=ウラシル，2=トルエン, 3=プロプラノロール， 4=ノルトリプチリン，5=アミトリプチリン pH 6.8 pH 4.1 pH 5.0 pH 5.9 pH 3.5 pH 2.7 N=13,000 N=12,500 N=11,500 N=11,500 N=11,500 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 4 4 5 5 5 5 5 5 アンチカオトロピックイオンであるアンモニウム イオンが安定な水和層を形成

酢酸アンモニウムを用いた塩基性化合物の

酢酸アンモニウムを用いた塩基性化合物の

分離：塩濃度の影響

分離：塩濃度の影響

カラム：熱処理C18, Sunrise C18-SAC 4.6 x 150 mm 移動相： アセトニトリル/ 酢酸アンモニウム pH 4.1 (70:30) 流速：1.0 mL/min 温度：40 ºC 試料：1=ウラシル，2=トルエン, 3=プロプラノロール， 4=ノルトリプチリン，5=アミトリプチリン 25 mM 100 mM 50 mM 200 mM 1 5 5 5 5 4 4 4 4 3 3 3 3 2 2 2 2 1 1 1 N=13,500 N=12,000 N=12,500 N=13,000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 10 mM ₅ 4 3 2 1 N=12,000 25 mM 100 mM 50 mM 200 mM 1 5 5 5 5 4 4 4 4 3 3 3 3 2 2 2 2 1 1 1 N=13,500 N=12,000 N=12,500 N=13,000 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 10 mM ₅ 4 3 2 1 N=12,000

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緩衝液濃度と保持指数との関係

緩衝液濃度と保持指数との関係

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 log [buffer concentration]

lo g k 0 2,000 4,000 6,000 8,000 10,000 12,000 14,000 N [a m itr ip ty lin e ]

Toluene Propranolol Nortriptyline Amitriptyline N (ami)

logk z log[ ] log[ ] log log z A z z A V V z K B A B A r m A A B = − + + + 1 A A：：溶離剤イオン，溶離剤イオン，BB：測定：測定イオン，イオン，k：k：BBの保持指数，の保持指数，K：K：選択係数選択係数 Z Z_AA, , ZZ_BB：各：各イオンの電荷イオンの電荷，，VV_rr, , VV_mm：カラム内の樹脂体積と移動相体積：カラム内の樹脂体積と移動相体積

緩衝液の塩の保持時間への影響

緩衝液の塩の保持時間への影響

リン 酸 ナ ト リ ウ ム クエン 酸 ナ ト リ ウ ム 酢酸ナ ト リ ウ ム ギ酸 ナ ト リ ウ ム リン 酸 ア ン モ ニ ウ ム クエン 酸 アン モニ ウ ム 酢酸ア ン モ ニ ウ ム ギ 酸 アン モニ ウ ム トリ ス 0 5 10 15 20 25 プロカインアミド 保持時間 (分） カラム：熱処理C18, Sunrise C18-SAC 4.6 x 150 mm 移動相： メタノール/20mM 緩衝液 pH 6.8 (50:50) 流速：1.0 mL/min 温度：40 ºC 試料：1=プロカインアミド 2=N-アセチルプロカインアミド

20 リン 酸 ナ ト リ ウ ム クエン 酸 ナ ト リ ウ ム 酢酸ナ ト リ ウ ム ギ酸 ナ ト リ ウ ム リン 酸 ア ン モ ニ ウ ム クエン 酸 アン モニ ウ ム 酢酸ア ン モ ニウ ム ギ酸 ア ン モ ニ ウ ム トリ ス 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 プロカインアミド N-アセチルプロカインアミド

緩衝液の塩のピーク対称性への影響

緩衝液の塩のピーク対称性への影響

対称性 （テーリングファクター） カラム：熱処理C18, Sunrise C18-SAC 4.6 x 150 mm 移動相： メタノール/20mM 緩衝液 pH 6.8 (50:50) 流速：1.0 mL/min 温度：40 ºC 試料：1=プロカインアミド 2=N-アセチルプロカインアミド

金属配位性化合物の分離

金属配位性化合物の分離

カラム：他社高純度ODS 5μm, 4.6x150 mm 熱処理C18, Sunrise C18-SAC 4.6x150 mm 移動相：A)アセトニトリル/20mM リン酸 (10:90) B)アセトニトリル/50mM ギ酸 (10:90) C)アセトニトリル/50mM 酢酸 (10:90) 流速：1.0 mL/min 温度：40 ºC 試料：1=8-キノリノール，2=カフェイン 0 2 4 6 8 10 12 14 16 保持時間(min) 0 2 4 6 8 _{保持時間(min)}10 12 14 16 18 20 22 1 ₂ 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 A: 20mM リン酸 C: 50mM 酢酸 B: 50mM ギ酸 他社高純度ODS 熱処理C18 Sunrise C18-SAC

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核酸塩基類の分離例

核酸塩基類の分離例

カラム：熱処理C18, Sunrise C18-SAC, 5 µm 4.6 x 150 mm 移動相： 20 mM KH₂PO₄ pH4.5 流 速： 1.0 mL/min 温 度： 25 ºC 試 料： 1=シトシン 2=ウラシル 3=シチジン 4=チミン ＊=不純物 1 2 4 3

Retention time / min

0 5 10 15 ＊ N N H O NH2 N H N H O O N N O NH₂ O H OH OH H C H3 H O H N H N H O O CH₃

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まとめ

まとめ

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„ C18固定相中にシラノール基を高度に残存させるこ とにより，極性化合物，特に塩基性化合物の保持 を増加させることが可能であった „ 熱処理により調節されたシラノール基は塩基性化 合物をテーリングさせなかった „ さらに，シラノール基によるイオン効果相互作用 が認められ，塩基性化合物の保持を移動相のpHや 塩濃度により調整可能であった „ 金属配位性化合物の分離に有効であり，詳細は未 解明であるが，シラノール基の水和状態や特性の 変化が金属不純物の影響の抑制に寄与していると 推定された