Qual Browser - 高分解能 精密質量編 - トレーニングマニュアル PN: Revision C June 2014

Qual Browser

-高分解能・精密質量編-

トレーニングマニュアル

 

目次 

 

1．はじめに ... 2  ソフトウェアの起動 ... 2  ファイルの開き方 ... 3  2．解析の前に～設定の変更 ... 4  Mass tolerance(質量の誤差範囲)と decimals(小数点以下の桁数)の設定 ... 4  Elemental composition Limits の設定 ... 5  3．クロマトグラムの表示方法 ... 7  マスクロマトグラムの表示とスキャンフィルター ... 7  4．様々なマススペクトルの表示方法 ... 11  スキャンポイントを平均化したスペクトルの表示 ... 11  バックグラウンドを差し引いたスペクトルの表示 ... 11  5．Adduct Ion・多量体の探索 ... 13  6．組成式の推察 ... 16  組成式の構成元素と個数の推定 ... 16  組成式の計算 ... 20  組成式の計算結果をウィンドウに表示する ... 21  アイソトープシミュレーション ... 23  7．MSn スペクトルの解析 ... 25  Ms2、Msn クロマトグラムの表示 ... 25  Msn スペクトルの表示と比較 ... 26  プロダクトイオンの組成式の計算 ... 28  付加情報のラベル表示  (表示オプションの変更) ... 29  ニュートラルロス ... 30  8．2 種類のフラグメンテーション～CID と HCD の違い... 31  Appendix ... 31  2 種類のフラグメンテーション～CID と HCD の違い ... 32  質量安定性の確認 ... 32   

 

 

         

１． はじめに 

 

Xcalibur Qual Browser は Thermo Scientific 社製の質量分析計で測定したデータを定性解析するためのソフトウェ アです。このテキストでは、特に低分子を高分解能・精密質量下で測定したデータに特化した使い方について解 説します。基本的な設定変更の仕方から、マスクロマトグラムやスペクトルの表示、MS/MS データ、組成解析、 構造解析等の一連の操作を、わかりやすくチュートリアル形式で学習することができます。  デモデータは以下のフォルダにインストールされています。    C: ¥Xcalibur ¥data ¥HRAM ¥24_MIX    このデータは添加剤(酸化防止剤、光劣化防止剤等)24 成分の混合物を分析したものです。高分解能精密質量 の LCMS にて、Data Dependent で、MS1、MS2、MS3 のスペクトルを取得しています。このマニュアルでは 24 成分 のうち、チウラムという化合物について定性解析を行います。            ソフトウェアの起動    ① デスクトップにある Xcalibur のアイコンをダブルクリックする。  ② Roadmap 画面から Qual Browser のアイコンをクリックする。                                    クリック ダブルクリック 化合物：チウラム  組成式：C6H12N2S4  分子量：239.98833  ① ② N S S N S S メニューバー Xcalibur Roadmap 画面 

ファイルの開き方    ① メニューバーの File を押す。  ② Open…を押してサンプルデータ(C: ¥Xcalibur ¥data ¥HRAM ¥24_MIX)を選択。  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

③ 画面にクロマトグラムとスペクトルが表示。 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

① ② Info Bar 

２． 解析の前に～設定の変更 

～高分解能・精密質量下における解析のための設定      Mass tolerance(質量の誤差範囲)と decimals(小数点以下の桁数)の設定    精密質量下で正確なマスクロマトグラムを抽出のために Mass tolerance の設定を行います。また元素組成解析 で得られる候補組成の許容範囲を決定するために Decimals の設定を行います。この項目で変更した設定はメニ ューバーの File>Layout>Save as…で保存(拡張子：.lyt)できます。    ① メニューバーの Display をクリックして Mass Options を選択。  ② Global Mass options ウィンドウ内にある Use user defined にチェック。  Mass tolerance：に  5 を入力して Units を ppm に設定(マスクロマトグラム抽出時の許容誤差範囲)。 

Tips! Mass tolerance の目安は 3～5（Exactive Pluｓ、Q Exactive、LTQ Orbitrap Elite は 3ppm、LTQ Orbitrap XL は 5ppm） 

③ Set mass precision の Decimals  に 4 を入力(元素組成を計算するときの小数点以下桁数の設定)。  ④ OK を押す。                       

  Tips! Mass tolerance と decimals は Xcalibur Roadmap の画面からも同様に設定できます。                        Road map 画面のメニューバーから Tools>Configuration を押す。  ① ② ③ ④ ① ② ③ ④ ⑤ Default mass tolerance の  Use user defined にチェック。  Mass tolerance に 5 を入力。  Units の ppm にチェック。  Default mass precision の  Decimals:に 4 を入力。  Global Mass Options ウィンドウ内にある  Use user defined にチェック。  Mass tolerance に 5 を入力。  Units の ppm にチェック。   Set mass precision>  Decimals:に 4 を入力。  Configuration ウィンドウから  Mass Options タブを選択。  OK を押す。 

Elemental composition Limits の設定  Info Bar の タブをクリックして Limits の設定を行います。      Charge：価数を設定。Positive ion は+1/Negative ion は‐1、ニュートラルロスは 0 を入力。    Nitrogen‐Rule：窒素ルール。（6 ページ「窒素ルールについて」を参照）  ESI では検出イオンの価数が奇数(1 価、3 価…)ならば、Even electron ions、偶数(2 価、4 価…)な らば、Odd electron ions を選択。MS/MS スペクトルのフラグメントイオン、ニュートラルロスを解析 する時は Do not use を選択。    Mass tolerance：組成計算時の質量の許容誤差範囲。精密質量では 5ppm を入力。    RDB equiv：Ring and Double‐Bond equivalents(不飽和度)の許容値を入力する。不飽和度は化合物に含まれる 二重結合、三重結合、環結合の合計がどの程度あるのかを示し、次式で計算される。    不飽和度=(2C+2‐H‐X+N)/2 [C:炭素の個数 H:水素の個数 X:ハロゲンの個数 N:窒素の個数]  通常はデフォルトの‐1.0‐100.0 の設定で良い。  Tips! 例外① 直鎖飽和炭化水素にアンモニウムアダクトが付加する場合は‐1.5 に設定。  例外② 芳香環が多く含む巨大分子(C が 200～)の場合、不飽和度が極めて高いので最大値を 100 以上に設定。    Elements in use：組成計算に使用する元素の種類と最小値(Min)、最大値(Max)を設定。  空欄を押すと周期表の window が立ち上がる。  表に存在しない元素を選択。         

                                                窒素ルールについて                        イオンの整数質量から窒素の数を絞り込める！    追加する元素を選択。 Mass  tolerance に許容誤差範囲(3～5ppm)を 設定、他のパラメータは解析対象による。  Save as…で入力した設定を保存  Load…で呼び出し。  Apply で元素組成をスペクトルに表示。  Elements in use には予想される  元素の最小値、最大値を入力。  空欄を押して表に無い元素を追加。 ① ② ③ ⑥ ⑤ ④ Min. number（最小値）と Max. number(最大値)を入力して  Add to List を押す。  参考

最初にセルのピンを  Active にする。  Range(s)に m/z 240.9956 を入力。  Plot を増やすために  チェックを入れる。  Plot type:は Mass Range を選択。  右クリック Ranges…を選択。  Scan filter:は  FTMS + p ESI Full MS [200.00‐ 1500.00] 

３． クロマトグラムの表示方法 

  マスクロマトグラムの表示  任意の m/z のイオンについてマスクロマトグラムを表示します。    [方法 1] 直接入力  ① クロマトグラムのセルのピン を Active にしてクロマトグラム上で右クリック。  ② Ranges…を選択すると、Chromatogram Ranges ウィンドウが立ち上がる。                         

③ 操作する Plot を追加する場合は Ranges タブの Type にチェックを入れる(Plot を 1 段増やす)。 

④ Plot type は Mass Range を選択。  ⑤ Range(s)に任意の m/z を入力(チウラムのモノアイソトピックイオン：m/z 240.9956 を入力)。  ⑥ Scan filter:はポジティブモードあるいはネガティブモードのフルスキャンのフィルタを選択する(FTMS + p ESI  Full ms [200.00‐1500.00]を選択)。※フィルタの詳細は 9 ページ「  Scan Filter について」を参照。  ⑦ OK を押す。                          ① ② ③ ⑥ ⑤ ④ ⑦

右クリック クロマトグラム  セルのピンを  Active にする。  Plot > Insert を選択。  Plot 一段追加。 マスクロマトグラム（m/z 240.9944‐240.9968） Tips! Plot は最大 8 段までふやすことができる。  Tips! Range(s)にはカンマ「，」で区切って複数の m/z を指定可能。ハイフン「‐」で数値を繋ぐと範囲指定ができる。    ⑧ 設定したマストレランスの範囲(+/‐5ppm)でマスクロマトグラムが表示される。                                [方法 2] スペクトルから任意のイオンピークを指定してマスクロマトグラムを抽出    ① クロマトグラムのセルのピン を Active にする。  ② クロマトグラム上で右クリックして Plot > Insert を選択すると、Plot が一段増える。                                ① ②

スペクトルセル  のピンを  Active にする。  クロマトグラム上の  任意のスキャンポイント  をクリック。  任意のピークを水平に  ドラッグして拡大表示。 再びクロマトグラム  セルのピンを  Active にする。  最下段のプロット を選択。 拡大したピークのトップを クリックするとマスクロマト グラムが抽出される。 マスクロマトグラム （m/z 637.4886‐637.4950）  ③ スペクトルのセルのピン を Active にする  ④ クロマトグラム上の任意のスキャンポイントを選択する(♯188 RT 4.97 のスペクトルを表示)。  ⑤ マスクロマトグラムを抽出するイオンのピークを水平にドラッグして拡大する  (m/z 637．4925 のピーク  を拡大表示)。       

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

⑥ 再びクロマトグラムのセルのピン を Active にする。  ⑦ 更に最下段のプロットを押して Active(ハイライト)にする。  ⑧ 拡大したピークのトップをクリックすると、マスクロマトグラムが抽出される。 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

④ ③ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧

  Scan Filter について    Scan Filter は一つのデータファイルで、異なるマスの条件を使用した場合(フルスキャン、MS/MS、2 種類以上の SRM など)、そのマスの条件でクロマトグラムを分離できます。Scan Filter は使用装置、測定メソッドによって表示 が異なります。                  ＜Full Scan だけを表示させる＞                              ＜MS2（MSMS）のスキャンだけを表示させる＞      任意の ms2 のフィルタを表示しプリカーサー以下を Delete キーで消去します   

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

アナライザー（ITMS/FTMS）  極性（＋:POS/－:NEG）  データ形式（c:セントロイド/  p:プロファイル）  MSMS のスキャン範囲 解裂方法（CID/HCD/PQD/ETD）  およびエネルギー  プリカーサーイオン スキャンのタイプ（Full/SIM/ SRM など）  d：データディペンデントスキャン RT:0.00 - 12.05 0 2 4 6 8 10 12 Time (min) 0 20 40 60 80 100 R e lat iv e A bundanc e 6.76 4.97 _6.34 3.59 7.02 4.61 8.56 9.54 5.85 2.98 2.20 0.94 9.97 11.83 NL: 3.04E8 TIC F: FTMS + p ESI Full ms [200.00-1500.00] MS 24_MIX RT:0.01 - 12.05 2 4 6 8 10 12 Time (min) 0 20 40 60 80 100 R e lat iv e A bundanc e 6.74 4.95 3.61 _6.99 6.35 8.57 6.27 _7.74 4.57 5.86 _9.03 9.55 3.00 1.41 9.73 NL: 2.94E8 TIC F: FTMS + c ESI d Full ms2 MS 24_MIX 参考

ヘッダーに平均化の  情報が表示される  スペクトル  のセルのピンを  Active にする  クロマトグラム 上で目的の範囲を ドラッグ＆リリース ③ ① ② ♯： スキャン範囲 RT： リテンションタイム   AV： 平均したスキャン数 NL：  一番高いピーク強度 

４． 様々なマススペクトルの表示方法 

 

ここで紹介するスペクトルの表示方法は目的のピークを探しやすくする、あるいはノイズ等を除去してきれいに 表示するための目的で使用します。5 章以降で紹介する組成式の解析等を行う場合には、なるべく加工されてい ない 1 スキャンポイントのスペクトルが適しています。    スキャンポイントを平均化（積算）したスペクトルの表示    ① スペクトルのセルのピン を Active にする。  ② クロマトグラム上で平均化したい Retention time の範囲をマウスで水平にドラッグ＆リリース(m/z 240.9955 のマスクロマトグラムのピークをドラッグ＆リリース)。  ③ 平均化したスペクトルが表示され、ヘッダーに情報が表示。                                Tips!   Xcalibur 2.0.7  以前のバージョンでは精密質量データの積算不可      バックグラウンドを差し引いたスペクトルの表示    対象のスペクトルからクロマトグラム上の指定したスキャンポイントを積算してバックグラウンドとして差し引くこと により、移動相やノイズ由来のピーク等を低減して目的化合物由来のピークのみを明瞭に示すことができます。    ① スペクトルのセルのピン を Active にする。 ② スペクトル上で右クリックして、Subtract Spectra を選択、1 か所のみ差し引きたい場合は 1range を、  2 か所 差し引きたい場合は 2ranges を選択。 

ヘッダーにバックグラウンドの情報が表示される（RT  0.09‐1.12,  1.79‐3.31 の間にある 33 スキャンを差し引いたという意味）。  スペクトルのセルのピ ンを Active にする。  Subtract Spectra  >1 Range  あるいは 2 Ranges  を選択する。          クロマトグラム上でバックグラウンドとして 引く範囲を指定 ③ ④ 差し引く前のスペクトル 差分のスペクトル ① ② 右クリック －2 －1                           ③ カーソルが変化したら、クロマトグラム上でバックグラウンドとして引きたい範囲をドラッグ＆リリースで選択 します。1Range では 1 か所、2Ranges では 2 か所を選択。                      ④ 差分のスペクトルが表示され、ヘッダーにバックグラウンドの情報が表示。再びスペクトル上で右クリックして Subtract Spectra>clear を選択すると解除される。                     

Label relative to selected mass  を選択。  スペクトル  のセルのピンを  Active にする。  ① ③ ② 右クリック Na アダクト ④ ⑤ m/zのおよそ 240～270 の範囲をプレス＆ドラッグで拡大。

５． Adduct Ion・多量体の探索 

 

任意のモノアイソトピックイオンのピークとの質量差に着目すると Adduct ion や多量体を観察することができま す。  ① スペクトルのセルのピン を Active にする。  ② チウラム(分子量：239.98778)のモノアイソトピックイオンの m/z 上で右クリック(スキャンポイント♯49 RT1.38 のスペクトルを表示して m/z 240.9956（理論値）のイオンを探す→240.9952（実測値）)。  ③ Label relative to selected Mass を選択する。同一セル内にある全てのプロットの m/z がモノアイソトピックイオ ンとの差分表示になる。  ④ m/z のおよそ 240～270 の範囲を水平方向にプレス＆ドラッグして拡大。                              ⑤ Adduct ion や多量体特有の質量差を示すイオンを探す(ナトリウムアダクト[M+Na]+は[M+H]+_と+21.9816  （理論値）の差分を示す。→21.9820（実測値）のイオン）                       

Reset relative mass labeling  を選択。  ⑥ 右クリック ⑦ ⑥ 表示を元に戻したい時には 0 でラベル化されたイオンの m/z 上で右クリック。  ⑦ Reset relative Mass labeling を選択する。                                よく検出されるアダクトイオン                                            参考

チウラムのモノアイソトピックイオン (m/z 240.9956)のマスクロマトグラム チウラムのナトリウムアダクトイオン (m/z 262.9770)のマスクロマトグラム 共溶出       Tips! 最終的にアダクトイオンであることを判定するには、マスクロマトグラムを抽出して、モノアイソトピックイオンと 共溶出するかどうか確認する。                                                                    

Elemental composition search on mass 240.9952 m/z= 235.9952-245.9952 m/z Theo. Mass Delta (ppm) RDB equiv. Composition m/z Theo. Mass Delta (ppm) RDB equiv. Composition 240.9952 240.9956 -1.61 1.5 C6H13N2S4

Elemental composition search on mass 240.9952

m/z= 235.9952-245.9952 m/z Theo. Mass Delta (ppm) RDB equiv. Composition m/z Theo. Mass Delta (ppm) RDB equiv. Composition 240.9952 240.9952 0.05 8.5 C5H O6N6 240.9951 0.30 1.5 C4H13O2N2S2Si2 240.9953 -0.45 0.5 C2H17N2S Si5 240.9951 0.50 0.5 C H17O N2Si6 240.9954 -0.66 1.5 C5H13O N2S3Si 240.9949 1.25 1.5 C3H13O3N2S Si3 240.9956 -1.61 1.5 C6H13N2S4 240.9956 -1.65 7.5 C4H5O3N6Si2 240.9947 1.99 2.5 C5H9O5N2S2 240.9947 2.20 1.5 C2H13O4N2Si4 240.9958 -2.60 7.5 C5H5O2N6S Si 240.9945 2.95 2.5 C4H9O6N2S Si 240.9960 -3.35 6.5 C3H9N6Si4 240.9961 -3.56 7.5 C6H5O N6S2 240.9943 3.90 2.5 C3H9O7N2Si2

６． 組成式の推察 

 

組成式の構成元素と個数の推定    m/z の値を用いた組成式の計算は Info Bar の タブ(Elemental composition)の機能を用います。しかしながら 構成元素の種類や個数の条件を限定しないで闇雲に計算を行うと、許容質量誤差範囲内で様々な組成式の候 補が出てきてしまい、うまく組成式候補を絞り込むことができません。高分解能・精密質量下では、モノアイソトピ ックイオンと同位体イオン間の質量差、同位体イオンピークの相対強度や形状に着目すると含有している元素 の種類や個数を推定できます。その結果、多くの組成式候補の中から少なく絞り込むことができます。この章で は同位体イオンピークの見方について C 原子と S 原子の例を示します。他の代表的な同位体元素については 18 ページ「元素と精密質量＆同位体の天然存在比」を参照して下さい。    ◎チウラムのモノアイソトピックイオン(m/z 240.9952)の組成式計算を行うと．．．                                                    C:0‐10  O:0‐15  H:0‐30  S:0‐4  N:0‐15  Si: 0‐6  C:0‐10  O:0‐15  H:0‐30  S:4‐4  N:0‐15    5 ppm 以内に  15 種類の組成式 組成式候補が多すぎてどれが正解かわからない！！ 組成式を絞り込める

24-MIX #36-64RT:1.03-1.79AV:10NL:4.49E5

F:FTMS + p ESI Full ms [200.00-1500.00] 241.0 241.5 242.0 242.5 243.0 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e lativ e A bundan c e 0.0000 1.9957 1.0034

24-MIX #36-64RT:1.03-1.79AV:10NL:7.72E4

F:FTMS + p ESI Full ms [200.00-1500.00] 242.99 243.00 243.01 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e la ti ve A b u n d a n ce 1.9957 2.0049 同位体イオンに着目 34 S 由来  S が 4 個

24-MIX #36-64 RT:1.03-1.79 AV:10 NL:4.49E5 F:FTMS + p ESI Full ms [200.00-1500.00] 241.0 241.5 242.0 242.5 243.0 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e lat iv e A bundanc e 0.0000 1.9957 1.0034 ＜C 原子の同位体>  C の原子数は13C を含む第一同位体イオンの(モノアイソトピックイオンに対する)相対強度と比例します。                                    第一同位体イオンの相対強度/1.082(13_{C の天然存在比)＝C の原子数}    ここでスペクトルの横軸 m/z 240～243 の範囲を拡大し、チウラムのモノアイソトピックイオン m/z 240.9952 の質 量を 0 として差分表示してみましょう（差分表示の仕方は 5 章を参照）。第一同位体イオンの相対強度が約 6％な ので、C は 5 ないし 6 個あると予想されます(実際は 6 個)。                                6%  240.9952 を質量‘0’に設定  第一同位体イオン 第二同位体イオン C 原子はおよそ 5 個  モノアイソトピックイオン[M+H]+ 

24-MIX #36-64 RT:1.03-1.79 AV:10 NL:4.49E5 F:FTMS + p ESI Full ms [200.00-1500.00] 241.0 241.5 242.0 242.5 243.0 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e lat iv e A bundanc e 0.0000 1.9957 1.0034

24-MIX #36-64 RT:1.03-1.79 AV:10 NL:7.72E4 F:FTMS + p ESI Full ms [200.00-1500.00] 242.99 243.00 243.01 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e la tiv e A bun danc e 1.9957 2.0049 C23H37N7O5S +H: C23 H38 N7 O5 S1 p(gss, s/p:40) Chrg... 526.26 526.28 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e lat iv e A bun dan c e 1.9959 2.0061 C23H37N7O5S +H: C23 H38 N7 O5 S1 p(gss, s/p:40) Chrg... 524.5 525.0 525.5 526.0 526.5 m/z 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 R e lativ e A b u ndan c e 0.0000 1.0034 1.9959 ＜S 原子の同位体>  第二同位体イオンがスプリットしている、あるいはショルダーが存在している場合があります。モノアイソトピック イオンからの質量差が 1.995(34S 由来)と 2.006(13C 由来)に分かれている場合は S の存在が考えられます。S の 含有量が多くなるにつれて 1.995 側のピークが大きくなります。S の原子数は 34S を含む第二同位体イオンの(モ ノアイソトピックイオンに対する)相対強度と比例します。    ◎例)  テトラペプチド MRFA(C23H37O5N7S)の同位体パターン                        第二同位体イオンの相対強度/4.519(34_{S の天然存在比)＝S の原子数}    ここで 240.9955 を 0 として差分表示した第二同位体イオン(1.9957)を拡大表示してみましょう。  下図のようによく見ると第二同位体イオンでは 34S 由来のピーク(1.9957)に 13C 由来のピーク(2.0049)がマージし て、わずかにショルダーを形成しているのがわかります。相対強度が 18%で S が 4 個あると予想されます。                              Tips! 測定分解能が低い時や、C の数が多い時にはスプリットやショルダーが目立たなくなる。19 ページ「高分解能下での同位体 イオンピークの形状」を参照  第一同位体イオン 第二同位体イオン モノアイソトピックイオン[M+H]+  S 原子は 4 個  18%  34 S 由来  (34 S‐32 S)  13 C 由来    (13C‐12C)×2  240.9952 を質量‘0’に設定  モノアイソトピックイオン[M+H]+  第二同位体イオン 4.5%  S 原子は 1 個  524.2650 を質量‘0’に設定 

  元素の精密質量＆同位体の天然存在比  M  M+1  M+2  元素  存在比(%)  質量  元素 存在比(%) ⊿md  元素 存在比(%) ⊿md  14 N  100  14.0031  15N  0.369  0.9970       16 O  100  15.9949  17 O  0.038  1.0042 18 O  0.205  2.0042  32 S  100  31.9721  33 S  0.801  0.9994 34 S  4.519  1.9958  28

Si  100  27.9769  29Si  5.078  0.9996 30Si  3.347  1.9968  35 Cl  100  34.9689        37Cl 31.961  1.9970  79 Br  100  78.9183        81 Br 92.278  1.9980  ※⊿md :  モノアイソトピック質量との質量差          高分解能下での同位体イオンピークの形状                                高分解能でなければ、同位体元素の特徴的なピークの分離を測定することはできない！            参考 参考

Generate formula    from mass  を選択。  Apply を押すと、組成式がピーク上に表示される。  12C の Min(最小値)に 0、Max(最大値)に 10 を入力  (※様々な m/z を解析する為、若干 C の幅を広めに取る。)  空欄を押して S 追加。  Min（最小値）と Max（最大値）に 4 を入力。  ① ② 240.9952 に  カーソルを重ねて  右クリック  ③ 組成式の計算    精密質量下では任意の m/z について組成式を正確に推察することができます。ここではチウラムのモノアイソト ピックイオン(m/z 240.9952)の組成式計算を行います。    ① タブの Limits のパラメータを次の条件に設定(5 ページ「Elemental composition Limits の設定」を参照)。          ② Elements in use 内のリスト上の空欄を押す。  周期表の window が立ち上がるので周期表から任意の元素を選択して、Add to list をおすと、表に追加され る。(S を追加して、下図のように C と S それぞれの Min と Max に数値を入力。)                ③ スペクトルのチウラムのモノアイソトッピクイオン(m/z 240.9952)にカーソルを合わせて右クリック。  ④ Generate formula from mass を選択すると タブに計算結果が表示(C6H13N2S4：プロトンアダクト)。  ⑤ Elemental in use の Apply を押すと組成式がスペクトルに表示。                                ④ ⑤

ウィンドウ上で右クリックして  Display Options を選択  ① ② ③ Decimals:に 4 を入力。  List を押す。  Tips! アダクトの種類、チャージの状態に応じて、窒素ルールやチャージ、Elements in use に追加する元素のパラメータを調整。  Tips! 同一測定内では、全ての溶出化合物の組成式の計算結果で Delta ppm が近似する傾向にある。        組成式の計算結果をウィンドウに表示する    ウィンドウに組成式の計算条件と結果を表示するとプリントアウトや、パワーポイント等にコピー＆ペーストする のに便利です。    ① タブの List ボタンを押す。計算結果のウィンドウが表示される。  ② ウィンドウ上で右クリックして、Display Options…を選択。                         

③ Display Options が立ち上がるので、Style タブの Precision Decimals に 4 を入力。                           

Display Options>Composition タブを選択して  Sim Params と  Delta ppm をチェック。 

④

⑤ OK を押す。 

④ 続いて Composition タブを選択して、Sim params  と Delta Units の ppm にチェックする(※Sim params をチェ ックすると Elemental composition Limits のパラメータが追加される)。  ⑤ 最後に OK を押す。                    ⑥ 組成式の計算条件と結果が精密質量下で表示される。                                                   

Chemical formula  にチェックして  C6H12N2S4 を入力。  Most abundant に 1 を入力（ポジティブモード）。  Half width は 0（チャージを+1 で固定）。  Adduct にチェックして、Identity に H を入力。  Concentration は One を選択（H を一個のみ付加）。  Profile にチェックして  Gaussian 選択。  Resolving pwr に 30,000 を入力。  New を選択すると新しいウィンドウに結果が表 ① アイソトープシミュレーション    任意の組成式についてアイソトープパターンのシミュミレーション結果を表示して、実測のピークと比較すること ができます。チウラム(C6H12N2S4 +H)のシミュレーション結果を表示してみましょう。    [方法 1] 直接入力  ① Info bar にある タブを選択         

② Isotope simulation タブの Chemical formula にチェックして組成式を入力(C6H12N2S4 を入力)。 

③ Adduct：付加物の設定。M+H のイオンは Adduct にチェックして Identity に H を入力する。Na や K などの他 のアダクトイオンも入力可能。付加物が 1 個のみの場合、Concentration は One を選択。 

④ Charge distribution：イオンの価数の設定。ポジティブモードの場合はデフォルト  (Most abundant 1、Half  with 0)で、ネガティブモードの場合は Most abundant に‐1 を入力(Most abundant に 1 を入力)。  ⑤ Output style：表示形式の選択。Profile でピークの形状表示(Profile>Gaussian を選択)。 

⑥ Resolution：分解能の設定(Resolving pwr に 30,000 を入力)。 

Tips!   実測のスペクトルと比較する場合は測定時の設定分解能と同じ条件にするとよい。 

⑦ New，Insert，Replace のいずれかを選択。New は新しいウィンドウに表、Insert は選択したセルに Plot の挿 入、Replace は選択した Plot の置換(今回は New を選択)。 

    ② ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦

組成式の欄を押す。 Simulate を押す。  アイソトープシミュレーシ 実測のスペクトル ⑧ シミュレーション結果が新しいウィンドウで表示される。                       

Tips!   Xcalibur Road Map 画面から小数点以下桁数（Decimals）の設定を行っていない場合、シミュレーション結果を新しいウィン ドウで表示すると、小数点以下桁数の表示がデフォルトに戻る時があるので、その場合は再度変更する(4 ページ参照)。    [方法 2] 組成式の計算結果からの表示  ① タブに表示されている組成式の欄を押す  ② Simulate をクリック                    ③ Simulation の結果が新しいプロットとしてセル内にインサートされる。                      ① ②

チェックして Plot 増やす  ms2 のフィルタを選択。  ① ② ④ ⑤ ③ Plot type は TIC を選択  Ranges を選択。  セルのピンを  Active にする。 

７． MSn スペクトルの解析 

 

MS/MS スペクトルの組成を解析し、フルスキャンのスペクトルと比較することは化合物の構造を解析する上で非 常に重要です。また、MS/MS は m/z の大きな分子の組成解析にも有効です。一般的に m/z が大きくなるにつれ て分解能も減少し、ピークの形状などから同位体元素を判別するのが困難になります。フルスキャンだけでは組 成が絞りきれないほど大きな分子は MS/MS を駆使して小さな分子に解体することで、容易に組成解析すること ができます。    MS2, MSn クロマトグラムの表示    ① クロマトグラムのセルのピン を Active にしてクロマトグラム上で右クリック。  ② Ranges…を選択すると、Chromatogram Ranges のウィンドウが立ち上がる。                         

③ Chromatogram Ranges ウィンドウの Type の空欄にチェックして Plot を追加。 

④ Scan filter  から目的の MS2 のフィルタを選択(プレカーサーが 241.00 の ms2 フィルタを選択)。  ⑤ Plot type は TIC  を選択。                       

ms3 のフィルタを選択  ⑥ OK を押す。  ⑦ ⑥ 同様に MS3 のフィルタを追加。(プレカーサーが MS1(241.00)→MS2(195.94)→MS3 のフィルタ)  ⑦ OK を押す。                                ⑧ クロマトグラムのセルに Plot が追加されて MS2 と MS3 のクロマトグラムが表示される。  Tips! 複数のスキャンポイントが無いと MSn のクロマトグラムが表示されない。その場合には  Display Options>Style タブ>Plotting>stick をチェックする。                                          MS2 MS3 MS1

Plot を選択  （ハイライトになる）  MS2 MS3 MS1 MS1 MS2 MS3 スペクトル  のセルのピンを  Active に  ピークトップ のスキャンポイント をクリック。 ⑦ ⑧ ⑥ MSn スペクトルの表示と比較(Plot の増やし方)    同一セル内に複数のスペクトルをまとめて表示して比較する場合は、次のようにレイアウトを  変更します(ここでは Plot を増やして、MS1、MS2、MS3 のスペクトルを比較)。変更したレイアウトはメニューバー の File>Layout>Save as…で保存(拡張子: .lyt)できます。      ① スペクトルのセルのピン を Active にした状態でツールバーの をクリックして、クロマトグラムの  セルだけを残す。  ② ツールバーの をクリックしてセルを 2 分割。  ③ 右側のセルのピン を Active にした状態で、ツールバーの をクリックしてスペクトル表示に  変更する。  ④ スペクトル上で右クリックして Plot>Insert を選択。これを繰り返して右セル内の Plot を 3 段に。  ⑤ 下図のレイアウトになる。  ⑥ スペクトルのセルのピン を Active にした状態にする。  ⑦ 上段のスペクトルの Plot を選択(グレーにハイライト)。  ⑧ MS1 のクロマトグラムのピークトップをクリック(同様に MS2 と MS3 のクロマトグラムからそれぞれのスペクト ルを Plot の中段、下段に表示)。ピークトップのスペクトルが表示される。                                   

スペクトルのセルの ピンを Active に。  Min を 0、Max をプレカーサー（C6H13N2S4）  の個数に合わせる。  各 Plot を選択して  Apply ボタンを押す  と組成式が表示される。  MS2 MS3 MS1 Nitrogen –Rule  を Do not use に変更。  m/z  の 50～250 の範囲を  プレス＆ドラッグして拡大。  プロダクトイオンの組成式の計算    プロダクトイオンの組成式を計算するときはパラメータの設定を以下のように変更します。  ① スペクトルのセルのピン を Active にする。 ② m/z のおよそ 50～250 の範囲を水平方向にプレス＆ドラッグして拡大表示。 ③ Nitrogen‐rule を Do not use に変更。

④ Elemental composition の Elements in use 内の元素の種類と Max の数値を  プレカーサーイオンの組成式と同じ値にする。Min は 0 に設定。  ⑤ スペクトルの MS2、MS3 の各 Plot を選択して Apply 押すとそれぞれピークに組成式が表示。  プロダクトイオン(m/z 195.9372、m/z119.9932)に組成式がアサインされる。                                                        ① ③ ⑤   ② ④

付加情報のラベル表示  (表示オプションの変更)   

不飽和度(RDBE)や質量誤差(Delta)等を組成式と共にピーク上に表示することができます。   

① メニューバーの Display、あるいはスペクトル上で右クリックして Display Options を選択。 

Composition  タブを開いて Elemental comp.の他に表示したい項目にチェック(RDB equiv.と Delta にチェック

し、Delta units を ppm に設定)。  ② OK を押す。                     

Tips!   Labels タブにある Label Threshold(％)に任意の値を入れると、強度の低いノイズピークなどにラベルが  表示されなくなる。    ③ スペクトル上に付加情報が表示される。                                 

RDB equiv.と Delta にチェック、Delta units は ppm を

Elemental comp.： 組成式を表示  Formulae： 実測値に近い順から入力した数字の  個数の組成式を表示  Theo. mass：  質量の理論値を表示  RDB equiv.： 不飽和度  Delta：  実測値と理論値の質量差を表示  Delta units： 質量差の単位を設定  （精密質量下では ppm 推奨）  ② ①

60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 m/z 0 20 40 60 80 100 0 20 40 60 80 100 R e la ti ve A b un da nce 0 20 40 60 80 100 240.9952 C6H13N2S4 217.1069 231.1590 200.1723 195.9373 C4H6N S4 119.9934 C3H6N S2 240.9951 C6H13N2S4 88.0214 C3H6N S 151.9655 C3H6N S3 205.0958 70.1619 186.0146 119.9932 C3H6N S2 195.9372 C4H6N S4 151.9652 C3H6N S3 67.0165 95.5452 113.9020 200.5774 NL: 2.43E6 24_MIX#49 RT: 1.38 AV: 1 F: FTMS + p ESI Full ms [200.00-1500.00] NL: 4.84E6 24_MIX#50 RT: 1.41 AV: 1 F: FTMS + c ESI d Full ms2 [email protected] [55.00-255.00] NL: 1.68E6 24_MIX#51 RT: 1.43 AV: 1 F: FTMS + c ESI d Full ms3 [email protected] [email protected] [50.00-210.00] MS2  MS3  MS1  ⊿m= 45.0579  (240.9952) (195.9373) 右クリックして  Label relative to  selected mass を選択。 Charge は 0、  Nitrogen‐rule  は Do not use を選択。  C2H7N ⊿m= 45.0579   CS2  ⊿m= 75.9441  MS2  MS3  MS1  質量が小さすぎて、5ppm 以内の誤差に納まらない場合は Mass toleｒance を緩め（1mmu 等）に調整する。     CS2  ⊿m= 75.9441 C3H6NS2 m/z = 119.9332      C2H7N ⊿m= 45.0579 

= C

6

H

13

N

2

S

4  + + ニュートラルロス    プレカーサーイオンとプロダクトイオンの質量差(ニュートラルロス)をスペクトル上に表示し、その元素組成を計 算します。この操作は MS と MS/MS のスペクトルが同一セル中にあることが前提になります。    ① プレカーサーイオン(m/z 240.9952)にカーソルを重ねて右クリックし、Label relative to selected mass を選択  する。 

② Limits の Charge を 0、Nitrogen‐rule は Do not use を指定する（※ニュートラルロスを Elemental composition で組成解析するときには M+H ではなく M であるため）。  ③ 適宜、Mass tolerance を調節する。  ④ Apply を押すと、プロダクトイオン(m/z 195.9373)とのニュートラルロス(‐45.0579)が表示される。                              ◎MS、MS2、MSn スペクトルの組成解析の結果から構造に関する部分的な知見が得られます。                              ① ② [M+H]+  ③ ④

200 400 600 800 1000 1200 m/z 0 50 100 0 50 100 R e la ti ve A bun da nce 0 50 100 1194.8156 C73H112O12N -1.9688 ppm 628.4070 C33H58O10N 2.4190 ppm 850.2493 C67H32N -4.2316 ppm 999.2892 350.3899 563.2280 C32H35O9 0.8583 ppm 729.2912 C41H45O12 0.9082 ppm 899.6017 C56H83O9 -1.5895 ppm 415.1759 C23H27O7 1.8184 ppm 219.1737 C15H23O -2.7021 ppm 938.6609 C70H84N 1.1949 ppm 396.1426 C19H24O9 2.8397 ppm 276.1250 754.4542 C58H58 1.2198 ppm 528.2350 C29H36O9 -0.6393 ppm 1158.2197 NL: 3.65E7 24-MIX#362 RT: 8.56 AV: 1 F: FTMS + p ESI Full ms [200.00-1500.00] NL: 1.90E7 24-MIX#348-381 RT: 8.49-8.53 AV: 2 F: FTMS + c ESI d Full ms2 [email protected] [315.00-1205.00] NL: 1.57E5 120910_ddms3_08#311-345 RT: 8.49-8.54 AV: 2 F: FTMS + c ESI d Full ms2 [email protected] [50.00-1205.00]

Appendix 

 

◆2 種類のフラグメンテーション法～CID と HCD の違い◆ 

 

Thermofisher  Scientific 社製の高分解能・精密質量型質量分析装置で選択できるフラグメンテーションの方法は リニアイオントラップ内で行う CID(Collision‐induced  Dissociation)とコリジョンセルによる HCD(Higher  Energy  Collision‐induced Dissociation)の 2 種に大別できます。それぞれにメリットとデメリットが存在します。      CID（イオントラップ）  HCD  有効な  Scan range  ・プレカーサーのイオンの 4 分の 1 の大き さ の フ ラ グ メ ン ト イ オ ン が 見 え な い (Quarter rule)。  ・強制的に Scan  range の下限を設定するこ とができる。(上限の 10%以下のものは見え にくなる。)  MS/MS  ・多段階の MS/MS(MSn)が可能。  ・MS2 のみ可能。  スペクトルの特徴  ・コリジョンエネルギーを変えてもスペクト ルパターンは変化しない。  ・コリジョンエネルギーによりスペクトルパタ ーンが変化するので最適化が必要。  イオンの開裂  ・1 次開裂  MS と MSn を組み合わせることにより官能 基の構造を容易に取得できる。  ・N 次開裂  1 枚のスペクトルから多くの情報が得られ る。    CID と HCD は、それぞれ特徴的な MS/MS のスペクトルパターンを持ち、Qual Browser で解析すると元素組成や 構造に関して、それぞれ異なる情報を得ることができます。    <HCD と CID のスペクトルの比較>                                MS1[Full scan]  MS/MS[CID]  MS/MS[HCD]  [M+NH4]+  MS/MS 

  <それぞれの機種の可能な開裂方法>      In source CID   HCD  による AIF CID（イオントラップ） による MS/MS  HCD  による MS/MS  Exactive Plus  (Exactive)  ○ △ (option)  × × Q Exactive  ○ ○ × ○ ハイブリッド型  (LTQ Orbitraｐ等)  ○ × ○ ○ ※AIF: All Ion Fragmentation の略                           

◆質量安定性の確認◆ 

 

精密質量という条件が、想定される誤差範囲内(+/‐5ppm)で保たれているかどうか(質量安定性)を確認するには 以下の点に注意します。    バックグラウンドとして観測されるイオン    ポジティブモードで測定した際、溶出全域で一般的に観察されるイオンを次ページの表に(p33～)に示します。こ れらの質量誤差が許容値以内に収まっているかどうかを確認します。溶出全域である程度の強度で観測されて いれば、測定の際にロックマスとして指定することができます。       

                                                                           

                                                                           

                                                                           

                                                                           

右クリックして選択 セルのピンを  Active に  View>  Scan Header  スキャンヘッダーの確認(スペースチャージ)    測定時にサンプルの濃度や AGC(Auto Gain Control)の設定等が原因で、トラップ内に取り込んだイオン量が多す ぎると、マスずれの原因となります。スキャンヘッダーを表示してイオン強度が高くなっていないか、実際の Injection time(ms)が短くなっていないか、また、Space charge Comp.(ppm)が許容誤差範囲内に納まっているか どうかを確認します。    ① セルのピンをアクティブに  ② セル上で右クリックして view>Scan Header を選択。                              Tips! ハイブリッド機は Space charge Comp.の項目は表示されない。             

 

 

 

 

 

 

 

 

① ②

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