ﾄﾗﾝｽｸﾘﾌﾟﾄｰﾑ･ﾄﾓｸﾞﾗﾌｨｰを用いた
遺伝子発現に基づく全脳地図作成
理化学研究所 光量子工学研究領域 客員研究員 於保祐子
-1. トランスクリプトーム・トモグラフィー
（ＴＴ法）
対象を3次元空間に俯瞰する形で捉え、 そこに発現する全ての遺伝子の発現分布を 測定する技術１．新技術の概要
‐2．ビデオ紹介：理研チャンネル
「遺伝子を脳構造にマップする」
‐3. ＴＴ法の概要
(図１参照） • 独自の生体情報画像化システムと、網羅解析技術 を組み合わせ、 • 3次元の異なる方向で切り出した連続切片群(分画) を生体試料とし、 • 分画ごとに高分子の発現量を測定し、 • 多数検体を使った多方向からの測定結果（１次元 データ）を、トモグラフィーを用いて、画像情報と共 に、仮想空間に３次元再構成する手法。解剖学イメージ 遺伝子発現 対象 分画 網羅的測定 推定結果 ３次元空間 高速計算による位置推定 １）3検体を、 直行3方向のいずれかに 分画する。 ２）分画ごとの 遺伝子発現密度を マイクロアレーなどの 網羅的な方法で、測定。 ３）位置合わせ ４）遺伝子発現地図を、 分画の遺伝子密度から、 再構成 図１．ＴＴ法の概要 PLOS ONE Figure 1 改変 (2012 Y Okamura‐Oho et. al)
‐4．ＴＴ法の精度評価
（１）テスト球を使った評価
（２）既存データベース情報との比較 a) マイクロアレー法
（１）テスト球を使った評価
方法： テスト用球（赤）3,000個 を、脳内にランダムに 配置し、これをＴＴ法で 再構成。 結果： 94.7%が 元の球を含む領域に 再構成された。 0 5 10 15 20 25 5 15 25 35 45 55 65 75 85 95 Num ber of spheres (%) 5 10 15 20 5 % </= TP </= 95%: 95 % < TP: % of true positive (TP) TP < 5 %:Test sphere area ( ; 1 mm): Reconstructed area:
94.7% in total 74.3 % in total 20.4 % 5.3 % 3D-view 80% cut-off filter H C S S 2D-view mode median PLOS ONE Figure 2 (2012 Y Okamura‐Oho et. al) 図２．テスト球を使った精度評価
（２）既存データベース情報との比較
a)マイクロアレー法
（図３参照） 方法： • BrainStars （マウス脳45 領域での全遺伝子発現測定結 果）との比較 結果： • 中高発現遺伝子での相関はよい。 • 低発現遺伝子については、マウス系統の違いやマイクロ アレープラットフォームの違いによる影響がみられる。BrainStars 45領域 BrainStars (500 m 径球でのアレー・データ) log2 log 2 r= 0.73 p< 10-12
ViBrism 3D-mapped data (BrainStars 500 m 径 領域において ViBrismでの 平均発現強度を 再計算したもの) PLOS ONE Figure 3 (2012 Y Okamura‐Oho et. al) 図３．既存法で得られたマイクロアレーデータとの比較
（２）既存データベース情報との比較
b) in situ ハイブリダイゼーション法
（図４参照）
方法：
• アレン・ブレイン図譜 （Allen Brain Atlas：ABA: マウス全脳での全遺伝子発現測定結果）との比較
結果：
• 領域特異的な発現を示す遺伝子が、類似の発現パターン を示した。
1. CTX ISO * Tshz2 1190003J15Rik RS Ctx ci * Myl4 Ctx m ABA 2. CTXpl Tcfl5 Figf Col24a1 Tmem40 OB post Vent Sb OB ant Tu Spink8 Dsp CA DG * * 3. CNU 4. TH Gprin3 Slitrk6 Adarb2 Gpr151 CPu lat MD LG Hb ViBrism ABA ViBrism ABA ViBrism ABA ViBrism 0 1 intensity intensity 0 ViBrism0.8 1 ABA 図４．ＡＢＡとの比較 PLOS ONE Figure 4(2012 Y Okamura‐Oho et. al)
6. CB Nek2 ABA * ViBrism * Bmp5 Cb lobe Cb vermis * * ABA * * 5. HY Fzd5 Prlr Thbd Ucn3 Foxb1 ViBrism M ME MPA SO Pa * * Nr0b1 Hcrt Fezf1 Ghrh Arc DM VMH Spa dor 7. MB and HB * * Foxa1 Ucn Pax7 Tcfap2d SC VTA IC PAG * * * * * * Chrna6 Slc6a2 Cdh23 Pn Hoxb3 Mve Tg SN ABA ViBrism ABA ViBrism 図４．(続き)
２．従来技術とその問題点
対象を3次元空間に俯瞰する形で捉え、 そこに発現する全ての遺伝子の発現分布を測定する 従来技術（表１参照） ‐1. 3次元（体積）での測定方法（立方体法） • 全体を俯瞰するための試料数が多くなる。 • 手動で試料採取する場合、位置情報の正確性を担保でき ない。 ‐2. ２次元（平面）測定結果を積み重ねる方法 （ＡＢＡ図譜作成法） • ｘ－ｙ詳細画像だが、Ｚ軸位置合わせが困難。 • 測定値の標準化が困難。 • コスト高・マウス個体多数。• 網羅的な36,000遺伝子発現地図を、従来法に比 べ検体数を1000分の１、測定時間を10分の１、費 用を100分の１程度で3次元化できる。 • 従来法では不可能な遺伝子間の相互比較が可 能である。 • 凍結切片から抽出して定量測定できる物質であ れば、なんでも３次元分布（解剖学的位置と量）を 示す事ができる応用範囲の広いシステムである。 • 研究者が各自の実験系で、網羅的発現地図を作 成・解析できる。
３．新規技術の特徴・従来技術との比較
TT法 アレン・ブレイン 図譜作成法 立方体法 対象 全遺伝子 全遺伝子 全遺伝子 測定方法 マイクロアレー rSEQ 組織染色 （ISH) マイクロアレー rSEQ 分解能 ５００ミクロン ２５０ミクロン ５００ミクロン x/y/z 均等 x/y 詳細 均等 標準化 〇 △ 〇 3次元化 推定 再構成 正確 マウス個体 ６ １，６００ １０ 試料数 １００ １００万 １万 測定時間 ３か月 ３年 未実施 測定費用 ５００万円 １０億円 ５億円 時間・費用 地図性能 測定 表１．新規技術の特徴・従来技術との比較
４．想定される用途
• 疾患モデル動物の脳全体を丸ごと隈なく迅速に 解析 （図５参照） • 薬剤投与効果を網羅的に解析 • MRI等で確認された脳の構造変化の背景にある 分子レベルでの変化を解析 (図６参照）遺伝子発現密度と疾患特異的病巣とに相関がある
図５．ハンチントン病責任遺伝子の脳内分布
PLOS ONE Figure 5
37 9 24 1 23 Htt (+)/Bdnf (‐) ViBrism Htt exp. density Anatomical Labels Waxholm MRI T1/T2* 図６：遺伝子発現領域をＭＲＩ上で示す
anatomical region name WHS Label # overlapped volume known disease volnerability Internal capsule 16 100.00% + Lateral dorsal nucleus of thalamus 18 100.00% + Medial geniculate 19 100.00% -Anterior pretectal nucleus 20 100.00% + Fimbria of Hippocampus 25 100.00% + Lateral geniculate 27 100.00% + Deep mesencephalic nuclei 17 99.99% +/-Thalamus (remainder) 3 99.86% + Striatum (caudate putamen) 23 99.25% ++ Lateral septal nuclei 8 97.15% -Periaqueductal gray 7 89.08% -Fornix 28 87.09% + Anterior commissure 10 87.07% -Hippocampus 24 77.04% + Corpus callosum 26 75.51% + Superior colliculus 4 72.16% -Nucleus accumbens 33 62.45% + Inferior colliculus 5 57.31% -Cerebral peduncle 13 55.15% -Optic tract 21 53.24% -Substantia nigra 12 50.04% +/-Lateral lemniscus 6 48.55% -Amygdala 31 42.25% + Hypothalamus 32 39.32% +/-Cerebral cortex 1 22.01% + Cerebellum 37 20.95% +/-Brainstem (remainder) 2 20.74% -Interpeduncular nucleus 14 8.00% -Olfactory areas 34 1.06% -Spinal trigeminal tract 36 0.74% -Pontine gray 11 0.00% -Pineal gland 30 0.00% -Cochlear nuclei 35 0.00% -total 39.20% PLOS ONE Figure 6 (2012 Y Okamura‐Oho et. al) Htt: ハンチントン病責任遺伝子 Bdnf: ハンチントン病を 軽快させる可能性のある 遺伝子 Htt(+)/ Bdnf(‐) 領域を ＭＲＩ画像に基づく脳図譜の解剖学名ラベルで表示 疾患特異的神経細胞死が起こる領域が ラベルされている。
５．実用化に向けた課題
‐1. ＴＴ法システムの改良
• 測定に用いるコンピュータ・プログラムを パイプラインとして広く提供する。 • 解析結果を分かりやすく示す、インターフェー スを開発する。‐2. ＴＴ法の周知
• 市場のニーズに合った解析ができる事を示す。 • 公開データベース（ViBrism‐DB) の内容を充実 させる。６．企業への期待
‐1. ＴＴ法のエンドユーザー
産業分野：製薬・医療・畜産・漁業・バイオ
‐2. 実用化モデル（図６参照）実現に向け、
共同で研究・開発を行うパートナー
• 発現解析情報に加え、 ３D-ISM機器とそのシステムも 最終製品とする。 創薬 先制医療 ViBrism 公開ＤＢ ViBrism 非公開ＤＢ 機器 販売企業 ＲＩＫＥＮ 公費 研 究 公開 情 報 非公 開 情報 利用料 ＤＢ バイオ企業 ＴＴ実施 ライセンス/ ライセンス料 システム販売 /代金 解析結果 科学教育 NPO DB維持 解析 ViBrism 公開ＤＢ ViBrism 非公開ＤＢ NPO BReNt‐ DB維持 データ 解析 ＲＩＫＥＮ ＴＴ実施 公費 研 究 公開 情 報 企業・ 研究所 委託元 非公 開 情報 Ｄ Ｂ 利用料 共同研究 解析結果 解析 委 託 科学教育 創薬 先制医療 • ViBrism‐DBの維持発展の資本調 達を目的とする。 • 発現解析情報を最終製品とする。 • エンドユーザーは、ＴＴ法を使った 解析結果の対価として、ＤＢ-利用 料を支払う。 ‐1. 非営利モデル ‐2.ライセンス化を含めた 一部営利モデル 図６：実用化モデル
６．本技術に関する知的財産権
発明の名称：遺伝子発現画像構築方法及び遺伝子発現画像 構築システム 国内出願番号： 特願２００５－２４８３１２、出願日：2005年8月29日 特許公開番号：特開2007-064689 特許登録番号：4724497 出願人：独立行政法人 理化学研究所 発明者：横田秀夫、於保祐子、下川和郎 PCT番号：PCT/JP2006/316997、 出願日：2006年8月29日 国際公開番号：WO2007/026705A1 国際ステータス：指定国移行状況：移行済：国名：GB,DE,FR,CH： 登録済国：ＵＳ 周辺・関連特許件数：特許査定済み：3件７．謝辞
この発表の内容は、 JST 知財活用促進ハイウェイ 「大学特許価値向上支援」、 JSPS 科研費 25560428、 理研戦略的研究展開事業（理事長ファンド）の 助成を受けた研究に、基づいています。 この研究の一部は、国際ニューロインフォマティクス統合機構（INCF) デジタル脳図譜プログラム ワクスホルム空間 (Waxholm Space)作業部会 の活動として行われました。 出典Transcriptome Tomography for Brain Analysis in the Web-Accessible Anatomical Space. 2012 PLoS ONE 7: e45373.
Okamura-Oho Y, Shimokawa K, Takemoto S, Hirakiyama A, Nakamura S, Tsujimura Y, Nishimura M, Kasukawa T, Masumoto K, Nikaido I,
ウェブサイト情報 この発表で紹介した発現地図は RIKEN ViBrism-DB http://vibrism.riken.jp/3dviewer/ex/index.html から、ダウンロード可能です。 更に詳しい情報や、発現地図を使った解析例は BReNt-ブレインリサーチネットワーク BReNt-プロジェクト・ウェブサイト http://opensciences.brent-research.org/ で、閲覧できます。
