博 士 （ 医 学 ） 堀 田 哲 也
学 位 論 文 題 名
抗リン脂質抗体症候群患者由来モノクローナル 抗プロトロンビン抗体の作成とその特性
学位論文内容の要旨
1．緒 言
抗 リン脂質抗体症候群(antiphospholipid syndrome，APS)は，血中にりン脂質に対する自己 抗 体が 検 出さ れ，各種動静脈血栓症 や習慣流産などの妊娠合併症 をはじめとする多彩な臨 床 症状 を 呈す る症 候群 で ある ．代 表的 な抗 リ ン脂 質抗 体に は， 固 相酵 素抗 体法(Enzyme immunoassay，EIA)で検出される 抗カルジオルピン抗体と活性 化部分トロンボプラスチン時 間 な ど の ル ン 脂 質 依 存 性 の凝 固時 間の 延長 で 判定 され るル ー プス アン チコ アグ ラ ント (lupus anticoagulant，LA)が あ る が ，LA陽 性 のAPS患 者 に お い て 抗 プ ロ ト口 ン ピン (prothrombin，PT)抗 体が しば しば 検 出されることが明らかとな り，抗PT抗体とLAの関連 が 指摘 さ れる よう にな っ た． しか し過 去の 報 告で は， 抗PT抗体 とAPSの 臨 床症 状と の関 連 につ い ては 報告 によ り 差異 がみ られ ていた．抗PT抗体の検出 には，通常EIA法が用いら れる が，酸素化プレートに直接固 相化されたPTを抗原とする方法(aPT‑oxygenated)と，カル シ ウム 存 在下 にホ スフ ァ チジ ルセ1」 ン(PS)とPTの 複 合体 を抗 原と するPS依存 性抗PT抗 体(aPS/PT)の 二種 類が あ る． 近年aPT‑oxygenatedと比 較しaPS/PTがAPSの 臨床 症状 とLA の 存 在 に 強 く 相 関 す る こ とが 明ら かと なり ，PSとPTの 複合 体 がLAの対 応抗 原の ー つで あ るこ と が示 唆さ れた ． 以上 のよ うな 背景 か らaPS/PTのAPSの 病態 に及 ば す影 響を 検討 する ために，APS患者よルモノク ローナルaPS/PTを作成し，そ の免疫学的特異性ならびに，
凝固 学的特性を検討した．
2．方法
APS患 者末 梢 血よ り単 核球 を採 取 し，B細 胞マ ーカ ーで あるCD19に 対する抗体が結合し た磁 性 ピーズ を使用しB細胞を精製した． 続いて，Epstein‑Barrウイ ルスをB細胞に添加し 卜ラ ン スフ オー メー シ ョン を行 い，aPS/PT抗体産生能を持っトラン スフオームされたB細 胞を ， 免疫グ ロブルン非産生のマウスと ヒトのへテロハイブリドーマ とポリエチレングリ コー ル を用 い細 胞融 合 をお こな った ．そ の 後aPS/PT産生 ハイブリド ーマを限界希釈法を 繰り 返 すこと によルクローニングした．aPS/PT産生ハイプルドーマを 大量に培養し，培養 上清 を 回収し ，ゲルろ過法を用いて精製 をおこなった．樹立したモノ クローナル抗体の免 疫学的特異性を検 討するために，（1） PSとPTとの複合体に対する結合性，(2)酸素化プレー トに 直 接固 相化 され たPTに 対す る結 合性 ，(3)非 酸 素化 プレ ート に直 接 固相 化さ れたPT に対 す る結 合性 をEIA法 で検 討し た．さ らにモノクローナル抗体のェ ピトープを検討する た め に ， リ ン 脂 質 結 合 部 位 で あ るGlaド メ イ ン を 有す るPTのN末端 側の フラ グ メン ト1 とPSの 複合 体に 対す る 結合 性をEIA法で 検討 した ． 次に モノクロー ナル抗体の，APSで認 められる抗カルジ オリピン抗体の対応抗原である{32‑グリコプロテインI（{32‑GPI)への結合
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性およびPTと同様にN末端にりン脂質結合部位であるGlaドメインを持つ第X因子，第 VII因子への結合性をEIA法で検討した．またモノク口ーナル抗体がLA活性を有するか否 かを検討するため，活性化第X因子，第V因子，リン脂質，カルシウムイオンからなるプ ロ卜ロンピナーゼ複合体によるa．トロンピン生成に対するモノクローナル抗体の影響を．
a．トロンピンに特異的な合成基質S‑2238を用いて検討した．リン脂質濃度の影響を検討す る た め 添 加 す る り ン 脂 質 濃 度 が 低 い 条 件 と 高 い 条 件 で 検 討 を 行 な っ た ．
3．結果
2例のAPS患者より，4種類のIgMクラスのモノクローナル抗体(HG‑4，KE‑6，KF‑5．KF‑
6）を作成した．樹立した4種のモノクローナル抗体はすべてaPS/PT活性を持っていた．酸 素化プレートに結合したPTに対する結合性は異なり，HG4，KF‑5，KF‑6は結合性が認めら れなかったものの，KE‑6はllig/mlの濃度で結合性が認められた，いずれのモノクローナ ル抗体も，非酸素化プレートに直接固相化したPTには結合しなかった．作成した4種のモ ノク口ーナル抗体ともPSとフラグメント1の複合体に対する結合は認められなかった.4 種のモノクローナル抗体ともp2‑GPI依存性抗カルジオリピン抗体活性は認められず．PSと 第VII因子，第X因子の複合体のいずれにも結合しなかった，トロンピン生成に及ぽす検 討では，コントロールのヒ卜ポリクローナルIgMの存在下での卜ロンピン生成を100%と した場合，リン脂質が低濃度と高濃度でのトロンピン生成はそれぞれ，HG‑4の存在下では 83.9%と101.9%，KE‑6の存在下では67.1％と101％，KF‑5存在下では41.3%と83.8%であっ た，これらの3クローンは，リン脂質濃度を上げることによルトロンピシ生成に対する抑 制効果は減弱する傾向がみとめられ，LA活性を有すると考えられた，一方，KF‑6はりン脂 質 濃度 に 関 わら ず ， 明 らか な ト 口ン ビ ン 生成 の 抑 制効 果 は 認め られ なかった ．
4．結語
2例のAPS患者末梢血リンバ球より，4種のIgMクラスのモノクローナルaPS/PTを作成 した.4種のモノクローナル抗体うち3種は，酸素化プレー卜に直接固相化されたPTには 結合せず，1種のモノクローナル抗体は酸素化プレートに直接固相化されたPTにも結合し たこ とより，aPS/PTはaPT‑oxygenatedと 異なっ た抗体と考えられるが，一部にaPT‑
oxygenatedとしての活性をもつものがあることが示された．カルシウムの存在下にPTがPS と結合すると酸素化プレートの場合とは異なる高次構造の変化が起こり，aPS/PTが認識す るエピトープが表出する可能性が考えられた.4種のモノクローナル抗体とも，PTのN末 端のフラグメント1とPSの複合体には結合しなかったことから，aPS/PTの認識するエピ トープはPSに結合したフラグメン卜1分子上には表出しておらず，エピトープの形成には．
さらにC末端側の構造が必要であると考えられた．また3種のモノクローナル抗体は．in vitroで卜ロンピン生成を抑制し，LA活性を持つことが明らかとなったが，一部にもたない ものがあり多様性があることが示された．今後APSの病態に及ぽすaPS/PTの影響を検討 し，また測定系の標準化を行う際に，本研究で樹立したこれらのモノクローナル抗体は有 用であると考えられる．
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