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合 成 培地 に お け る ポ ビ ドソ ヨー ドの抗 菌 力 に関 す る研 究
京都薬科大学病院薬学教室水
上
洋
一
横
山
照
由
(平成5年5月6日 受 付) (平成5年7月12日 受 理)Key words: povidone-iodine, synthetic media, minimal inhibitory
concentration, phenol coefficient
要 旨
ポ ビ ドン ヨ ー ド(PVDの 抗 菌 性 を 調 べ る た め に,蛋 白質 成 分 を 除 い た 合 成 培 地 を 調 製 した.ハ ー トイ
ン フ ユ ー ジ ョン培 地(HIB:天 然 培 地)と 合 成 培 地 で 有 効 ヨ ウ素 の 安 定 性 に つ い て 検 討 し た と こ ろ,HIB
で は,PVI添 加 直 後 に 有 効 ヨ ウ素 は 急 速 に 減 少 した が,合 成 培 地 で は 安 定 に 存 在 し,抗 菌 力 測 定 が 可 能
に な った.ま た,Esckerickia coliやSalmonella enteritidisは,合 成 培 地 で 正 常 な増 殖 を 示 した.こ れ
らの 培 地 を も ち い て 最 小 発 育 阻 止 濃 度(MIC)を 測 定 した と こ ろ,MICはHIBで の そ れ に上ヒベ1,000分 の1に 近 い 値 を 示 し,セ フ ァ ロ ス ポ リン系 抗 生 物 質 と ほ ぼ 同 等 で あ っ た.ま た,同 培 地 で の 石 炭 酸 係 数 はHIBに 比 べ20∼30倍 高 い値 に な り,有 機 物 が 存 在 し な い 条 件 下 で は,PVIは 強 力 な 殺 菌 作 用 を 有 して い る こ とが わ か っ た. 序 文 最 近,病 院 内 に お け る 日和 見 感 染 が 問 題 とな り, 日和 見 菌 を 含 む細 菌 汚 染 の 防 止 対 策 と して 殺 菌消 毒 剤 が 再 認 識 され て い る.消 毒 剤 の殺 菌 力 の 比 較 に は,石 炭 酸 係 数 測 定 法(PC法)が 用 い られ て い る が,供 試 菌 の 培 養 条 件 あ るい は前 培 養 に用 い る 培 地 成 分 が 試 験 成 績 に 影 響 を 及 ぼ す 欠 点 が あ る1).特 に,ポ ビ ドン ヨ ー ド(PVI)の よ うな消 毒 剤 は,前 培 養 培 地 に含 ま れ る微 量 の タ ンパ ク質 と 反 応 して 不 活 化 され るた め,場 合 に よ って は殺 菌 作 用 を 有 して い な い よ うな試 験 成 績 が え られ る こ と も あ る.ま た,1974年 に 改 良Kelsey-Sykes法 (KS法)が 提 案 され,本 法 は 全 て の 消 毒 薬 の殺 菌 効 果 が 評 価 で き る と い わ れ て い る が2),秋 山 ら3) は,K-S法 は 殺 菌 力 試 験 法 とい う よ りむ し ろ,消 毒 薬 の使 用 濃 度 推 定 試 験 法 とい った 方 が い い と述 べ て お り,消 毒 薬 の殺 菌 力 を正 確 に 評 価 して い る と は言 え な い.一 方,抗 生 剤 の評 価 に常 用 され て い るMICお よ びMBC測 定 法 を 消 毒 剤 の 検 定 に 応 用 す る際,培 地 成 分 に よ り消 毒 剤 が不 活 化 され る場 合 もあ る.特 に,PVIは 培 地 成 分 の タ ンパ ク 質 に よ り急 速 に不 活 化 され る.こ のた め,正 確 な MICが 算 出 で きな い.こ のMIC法 は,長 時 間,菌 と薬 剤 が 接 触 した 状 態 に あ り,短 時 間 の 殺 菌 を 必 要 とす る消 毒 剤 を評 価 す る方 法 と して は 不 適 切 だ といわ れ て い る1)4)5).しか し,PVIの よ うな生 体 消 毒 薬 は 皮 膚 や 粘 膜 な ど に長 時 間,接 触 した 状 態 で 使 用 され る こ とが 多 く6)7),重篤 な副 作 用 も報 告 さ れ て い る8).こ の た め,生 体 に 与 え る毒 性 を 考 慮 し た 場 合,器 具 や 手 指 の殺-菌を 想 定 した 短 時 間 で の 殺 菌 作 用 だ け で 薬 効 を 評 価 す る こ とは 適 当 とは い え な い.そ の た め に も,消 毒 剤 の活 性 を 損 な うこ とな く,殺 菌 効 果 あ る い はMICが 測 定 で き る 培 地 が 求 め られ る.今 回,著 者 らは ヨ ウ素 系 消 毒 剤 の 抗 菌 力 測 定 用 培 地 の選 択 を 行 い,MIC,MBC法 お よ びPC法 で 抗 菌 力 を 比 較 検 討 した. 別 刷 請 求 先:(〒812)福 岡 市東 区馬 出3-1-1 九 州 大学 医学 部 第2生 化 学教 室 水上 洋 一
材 料 と方 法 1.供 試 薬 剤 及 び 試 薬 被 験 消 毒 薬 は ポ ビ ド ン ヨ ー ド(PVI)(100mg/ ml・ 有 効 ヨ ウ 素10mg/ml,明 治 製 菓)を 用 い,対 照 消 毒 剤 と し て は 塩 化 ベ ン ザ ル コ ニ ウ ム(BZC) (10W/V%水 溶 液,日 本 製 薬)お よ び グ ル コ ン 酸 ク ロ ル ヘ キ シ ジ ン(CHG)(5W/V%液 ,住 友 製 薬) を 用 い た.ま た,対 照 抗 生 物 質 に は セ フ ミ ノ ク ス ナ ト リ ウ ム(CMNX,明 治 製 菓)を 使 用 し た . ハ ー ト イ ン フ ユ ー ジ ョ ン 培 地(HIB培 地)は Difcoを 用 い,そ の 他 の 試i薬 は 試 薬 特 級(和 光 純 薬)を 使 用 し た. 2.使 用 菌 株
試 験 菌 と し て Staphylococcus aureus FDA
209-P, Staphylococcus epidermidis ATCC 14990, Escherichia coli ATCC 8739, Escherichia coli JCL, Escherichia coli NIHJ JC-2, Salmonella enteritidis IFO 3313, Proteus mirabilis ATCC 21100, Pseudomonas aeruginosa IFO 126890D 6
種8株 を 用 い た. 3.抗 菌 力 測 定 用 培 地 の 調 製 1)合 成 培 地 A)SM培 地9):リ ン 酸 一 水 素 カ リ ウ ム7g,リ ン 酸 二 水 素 カ リ ウ ム3g,ク エ ン 酸 ナ ト リ ウ ム(2H2 0)0.5g,硫 酸 マ グ ネ シ ウ ム(7H20)0.1g,硫 酸 ア ソ モ ニ ウ ム1g,ブ ド ウ糖(10%溶 液)20mlに 脱 イ オ ン 水 を 加 え て1,000mlと し,濾 過 滅 菌 し て 調 製 し た(pH7.4). B)SMM培 地:SM培 地 か ら ブ ド ウ 糖 を 除 き,等 モ ル の マ ン ニ ッ トを 添 加 し て 調 製 し た. 2)半 合 成 培 地 SMC培 地:SM培 地 に カ ザ ミ ノ酸 を 最 終 濃 度 1%に な る よ うに 添 加 し た. 3)天 然 培 地 ハ ー トイ ン フ ユ ー ジ ョ ン培 地(HIB培 地)を 用 い た. 4.培 地 中 の 有 効 ヨ ウ 素 量 の 測 定 法10) SM培 地,SMM培 地,SMC培 地 お よ びHIB培 地 に つ い て,PVI添 加 後 の 有 効 ヨ ウ 素 濃 度 の 経 時 変 化 を 脱 イ オ ン 水 希 釈PVI液 と比 較 し た.す な わ ち,培 地 内 有 効 ヨ ウ素 濃 度 が1mg/mlと な る よ う に 調 製 し,こ れ らを37℃ の 恒 温 器 に放 置 し,有 効 ヨ ウ素 量 の 変 動 を 経 時 的 に滴 定 法 で測 定 した .有 効 ヨ ウ素 の 定 量 は,SM培 地,SMM培 地 お よ び脱 イ オ ン水 で は デ ン プ ン 液 を 指 示 薬 と して0.1Nチ オ硫 酸 ナ トリ ウム液 で滴 定 した. 5.各 種 培 地 に お け る細 菌 の 増 殖 試 験 前 項 の6種8株 につ い て,各 種 合 成 培 地 あ る い は 半 合 成 培 地 お よ びHIB培 地5mlに 各 菌 株 の HIB培 養 菌1白 金 耳 を 移 植 して,37℃,24時 間 培 養 後 の 被 験 菌 の 増 殖 状 態 を調 べ た.増 殖 を 示 し た もの に つ い て は 平 板 塗 布 法 に よ り生 菌 数 を 測 定 し,1×107cells/ml以 上 を+,1×107cells/ml以 下 を ± と して 表 した.ま た,増 殖 を 示 さ な か った も の は 一 と した. 6.最 小 発 育 阻 止 濃 度(MIC)お よ び最 小 殺 菌 濃 度(MBC)の 測 定11)
試 験 菌Ecoh ATCC 8739お よ びSmteritidis
IFO 3313に 対 す るMICお よびMBCを 化 学i療法
学 会 基 準 のMIC測 定 法(微 量 液 体 希 釈 法)に 準 じ てSM培 地 お よ びSMM培 地 を 用 い て 測 定 し, HIB培 地 の結 果 と比 較 した.ま た,MBC法 は, MIC測 定 後,1白 金 耳 を 各 培 地 に移 植 し,37℃ で 24時 間後,増 殖 を 認 め な い最 小 濃 度 をMBC値 と した.な お,供 試 菌 液 は2× 105 cells/mlと な る よ う に調 製 した も の を用 い た. 7.殺 菌 力 の 測 定12) 石 炭 酸 係 数 測 定 法 に 準 じ て行 った.各 被 験 消 毒 液 の 希 釈 水 溶 液5mlとSM培 地 あ る い はHIB培 地 に3代 継 代 培 養 した供 試 菌(108cells/ml) 0.5ml との 混 液 を20℃ の 恒 温 槽 中 で 反 応 させ た 後,経 時 的 に2.5,5,10,15分 ご と に1白 金 耳 取 り出 して 5mlず つ 分 注 した 後 培 養 培 地 に 移 植 し,37℃ で48 時 間 静 置 培 養 後,菌 の発 育 の 有 無 に よ り殺 菌 効 果 を判 定 した. 成 績 1.培 地 中 の 有 効 ヨ ウ素 Fig.1は,PVI液(有 効 ヨ ウ素 濃 度1mg/ml)を 含 む4種 類 の 培 地 に つ い て,有 効 ヨ ウ素 の 経 時 変 化 を 脱 イ オ ン水 希 釈PVI液 と比 較 した 結 果 で あ る.HIB培 地 に お い て は,殺 菌 能 を 有 す る有 効 ヨ ウ素 は混 合 直 後 か ら15%に 減 少 し,混 合3時 間 後 平 成5年11月20日
1054 水 上 洋 一 他
Fig. 1 Residual amount of available iodine in
each medium at 0, 3, 24hr after addition of 10%
povidone-iodine. Each column represents mean+
S.E. of 3 experiments. で は,全 く 検 出 さ れ な か っ た.ま た,SMC培 地 も, HIB培 地 と 同 様 に 有 効 ヨ ウ 素 の 減 少 が 顕 著 で 培 地 と混 合3時 間 後 の 残 存 率 は10%で あ っ た.一 方, SM培 地 で は,有 効 ヨ ウ素 の 減 少 速 度 は 遅 く,混 合 3時 間 後 で は,約80%が,24時 間 後 で も,40%の 有 効 ヨ ウ 素 の 残 存 が 認 め ら れ た.さ ら に,SMM培 地 で は,混 合24時 間 後 で も 有 効 ヨ ウ 素 は 約88%残 存 し,脱 イ オ ン 水 希 釈PVI液 の 残 存 率 と差 は 認 め ら れ な か っ た. 2.各 培 地 に お け る 細 菌 の 増 殖 試 験 Table1は 合 成 培 地 お よ び 半 合 成 培 地 で の 試 験 菌 の 発 育 状 況 を 比 較 し た 結 果 で あ る.SM培 地 に カ ザ ミ ノ酸 を 添 加 し たSMC培 地 は,全 て の 試 験 菌 がHIB培 地 と 同 程 度 の 発 育 を 示 し た.一 方,合
成 培 地 で は,Ecoli ATCC 8739,Ecoli JCLお
よ びSenTeritidis IFO 3313の3株 が 良 好 な 発 育
を 示 した.
3.最 小 発 育 阻 止 濃 度(MIC)お よ び 最 小 殺 菌 濃
度(MBC)
SB-1培 地 お よ びSB-IM培 地 を 用 い,試 験 菌E
coliATCC 8739お よ びSenteriTidis IFO 3313に
対 す るMICお よ びMBCを 測 定 し,HIB培 地 と 比 較 し た 結 果 をTable2,3に 示 す.SM培 地 お よ びSMM培 地 で のPVIのMICお よ びMBCは と も に0.625∼1.25μg/mlで あ っ た.し か し,HIB 培 地 の 場 合,MICお よ びMBCと も に1,250μg/ m1と な り,合 成 培 地 で のMIC,MBCと 大 き な 差
Table 1 Growth in each Medium
SM: Synthetic medium, SMM : Synthetic medium with mannitol and without glucose
SMC: Synthetic medium with casamino acid, HIB: Heart infusion broth
+: growth (>1•~10' cells/ml),•}: growth (<1•~107 cells/ml),-: no growth
Table 2 Bactericidal Activity of Antiseptic and
Antibiotic against E. colt ATCC 8739 in each
Medium
PVI: Povidone-iodine, BZC: Benzalkonium chloride, CHG : Chlorhexidine gluconate, CMNX: Cefminox sodium, Inoculum size : 2•~10' cells/ml
Table 3 Bactericidal Activity cf Antiseptic
against S. enteritidis IFO 3313 in each Medium
Inoculum size: 2•~105 cells/ml
が 認 め られ た.一 方,BZC,CHGCMNXで は 培 地 に よ る抗 菌 作 用 の 変 化 は 見 られ な か った. 4.前 培 養 培 地 成 分 の殺 菌 作 用 へ の 影 響 SB-1培 地 培 養 菌 お よ びHIB培 地 培 養 菌 を 用 い て 消 毒 薬 の 殺 菌 力 を 比 較 し た 結 果 をTable4,5 に示 した.試 験 菌E.coli ATCC 8739お よびS
Table 4 Phenol Coefficients against E. coli ATCC 8739 in each Medium
Inoculum size: 1•~108 cells/ml
Table 5 Phenol Coefficients against S. enteritidis IFO 3313 in each Medium
Inoculum size: 1•~108 cells/ml
enteritidis IFO 3313に 対 す る石 炭 酸 の 殺 菌 作 用 に は差 は 見 られ な か った.し か し,PVIで は培 地 成 分 に よ り殺 菌 力 に 差 が見 られ た.す な わ ち,HIB 培 地 培 養 菌 で の 石 炭 酸 係 数 は65∼72で あ る の に対 し て,SM培 地 培 養 菌 で の 石 炭 酸 係 数 は 1,500∼1,905で あ り,HIB培 地 培 養 菌 に比 べ,石 炭 酸 係 数 で 約20∼30倍 の 高 値 を 示 した.一 方, BZCお よ びCHGは と も に 培 地 成 分 の 影 響 は 受 け な か った. 考 察 Fig.1に 示 した よ うに,PVIは 天 然 培 地 中 で 急 速 に 有 効 ヨ ウ素 が 減 少 す る.こ の 現 象 は 合 成 培 地, 特 に,SMM培 地 で は 認 め られ な い こ とか ら,有 効 ヨ ウ素 の減 少 は 天 然 培 地 中 の タ ンパ ク質 が影 響 し て い る もの と思 わ れ る.ま た,SM培 地 で もSMM 培 地 に比 べ 有 効 ヨ ウ素 の 減 少 が 著 し い こ とか ら, ブ ドウ糖 も有 効 ヨ ウ素 の 不 活 化 の 一 因 で あ る と考 え られ る.ブ ドウ糖 を は じ め とす る単 糖 類 は 還 元 性 を 有 して い る とい わ れ て お り,有 効 ヨ ウ素 を 殺 菌 作 用 の な い ヨ ウ素 イ オ ン に還 元 す る可 能 性 が あ る.こ れ ら培 地 中 の 総 ヨ ウ素 量 を測 定 した と ころ, 経 時 的 な変 化 が 認 め られ な か った こ とか ら,SM 培 地 中 の 有 効 ヨ ウ素 の 減 少 は ヨ ウ素 イ オ ンへ の還 元 に よ る も の と思 わ れ た(成 績 未 表 示).ブ ドウ糖 の 代 わ りに還 元 性 を 持 た な い マ ン ニ ッ トを 加 え た SMM培 地 で は有 劾 ヨ ウ素 は 安 定 に 存 在 した.し か し,MICお よびMBCの 測 定 に 際 し て,SM培 地 とSMM培 地 で の 値 が ほ ぼ 同 じで あ った.こ の こ とか ら,PVIはSM培 地 中 で 有 効 ヨ ウ素 が 減 少 す る前 に 殺 菌 作 用 を 示 す と思 わ れ,SM培 地 は 本 測 定 系 に 用 い る こ とが で き る もの と考 え た.合 成 培 地 を 用 い て 測 定 したBZC,CHG,CMNXの MIC,MBC,PCはHIBを 用 い て 測 定 した もの と ほ ぼ 同 じで あ っ た.こ の こ とは 合 成 培 地 で の 培 養 が細 菌 自体 に影 響 し,こ れ ら薬 剤 の 感 受 性 を 高 め た の で は な い こ とを 示 し て い る.そ れ に もか か わ らず,PVIのMIC,MBC,PCが 合 成 培 地 を 用 い た 場 合,HIBに 比 べ か な り優 れ た 値 を 示 し て い た.有 機 物 に よ る有 効 ヨ ウ素 の 不 活 化 が起 こ ら な い条 件 下 で は,PVIは 強 力 な殺 菌 作 用 を有 して い る こ とが わ か った.こ れ ま で も,PVIのMIC測 定 は行 わ れ て いた が,培 地 中 に タ ンパ ク質 や還 元 性 の あ る有 機 物 が 含 ま れ て お り,正 確 にMICを 算 出 して い る とは 考 え に くか った13)14).今回 の 合 成 培 地 を 用 い たPC法,MIC法 に よ る効 力 試 験 は, そ の 簡 便 性 を 考 え合 わ せ る とPVIの 基 礎 的 な 評 価 法 と して 適 当 な もの と考 え られ る.し か し,こ れ ら合 成 培 地 に増 殖 可 能 な菌 種 は,限 られ て い る た め,今 後,他 の グ ラ ム陰 性 菌,グ ラ ム陽 性 菌 す べ て が 発 育 で き る培 地 の 開 発 が 必 要 で あ る.ま た, 消 毒 剤 は,こ れ まで 作 用 機 序 の 解 明 が ほ と ん どな され て い な か った15).今回,選 択 した 培 地 は こ う し た ヨ ウ素 系 消 毒 剤 の抗 菌 力 測 定,作 用 機 序 の 解 明 に 対 し,一 つ の 手 段 を提 供 す る も の と考 え る. 謝辞 本研究に対 し御指導賜 りました藍野医療短大微生 物学教室横 田芳武教授 および大 阪医大病院薬剤部長吉成 昌 郎博士 に深甚 なる謝意を表 します.稿 を終 えるにあた り御 校 閲 くだ さいました大阪医大微生物学教室 中井益代教授お よび佐野浩一助教授に深 く感謝いた します. 文 献 1) 五 島 瑳 智 子: 殺 菌 効 果 の 評 価 に つ い て. 臨 床 と細 菌, 5: 229-232, 1978. 2) 野 尻 務, 奥 村 実: 新 し い 消 毒 薬 の 試 験 法 Kelsey-Sykes法 に つ い て. 防 菌 防 徽 誌, 4: 170 -176 , 1976. 3) 秋 山 茂, 小 林 正 枝, 岩 下 正 人: 消 毒 薬 の 殺 菌 効 力 試 験 方 法 の 検 討. 改 良Kelsey-Sykes法 に 関 す る 実 験 的 考 察. 感 染 症 誌, 63: 575-583, 1989. 4) 五 島 瑳 智 子, 辻 明 良: 消 毒 薬 の 評 価 法. 検 査 と 平 成5年11月20日
1056 水上 洋 一 他
技 術, 8: 200-206, 1980.
5) 富 岡 一, 小 林 芳 夫, 内 田 博, 萩 原 薫: 消 毒 薬 の 殺 菌 効 果. 臨 床 と細 菌, 5: 239-246, 1978.
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7) Angelini, G. D., Ch, M., Lamarra, M., Azzu, A. A. & Bryan, A. J.: Wound infection following early repeat sternotomy for postoperative bleeding. J. Cardiovasc, Surg., 31: 793-795, 1990.
8) Pietsch, J. & Meakins, J. L.: Complications of povidone-iodine absorption in topically treated bum patients. Lancet, 7: 280-282, 1976.
9) 坂 崎 利 一: 新 ・細 菌 培 地 学 講 座 上 (坂 崎 利 一 編), p.269-270, 近 代 出 版, 東 京, 1978. 10) 日本 公 定 書 協 会: ヨ ウ素 の 測 定 法. 第12改 正 日本 薬 局 方 解 説 書,(日 本 公 定 書 協 会 編),p. c-2030 -c-2033 , 広 川 書 店, 東 京, 1991. 11) 日本 化 学 療 法 学 会MIC測 定 法 改 定 委 員 会: 最 小 発 育 阻 止 濃 度(MIC)測 定 の 改 訂 に つ い て. Chemotherapy, 38 (1): 102-105, 1990. 12) 医 科 学 研 究 所 学 友 会: 石 炭 酸 係 数. 細 菌 学 実 習 提 要,(医 科 学 研 究 所 学 友 会 編), p.335-339, 丸 善, 東 京, 1971.
13) Lacey,R. W.: Antibacterial activity of povidone iodine towards non-sporing bacteria. J. Appl. Bacteriol., 46: 443-449 1979. 14) Prince, H. N., Nonemaker, W. S., Norgard, R. C.
& Prince, D. L.: Drug resistance studies with topical antiseptics. J. Pharm. Sci., 67: 1629
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15) 五 島 瑳 智 子: 消 毒 薬 の 役 割 と 問 題 点 は 何 か. Mebio, 4: 95-100, 1987.
A Study on the Bactericidal Activity ofPovidone-Iodine in the Synthetic Mediums Yoichi MIZUKAMI & Teruyoshi YOKOYAMA
Department of Hospital Pharmacy, Kyoto Phrmaceutical University
