感染を伴わない細菌からの免疫刺激と私たちの病気
猪 原 直 弘
山梨大学医学部生化学 2 要 旨：人体は環境中にいる細菌から来る物質に常に晒されています。特定の細菌成分は炎症応答 などの細菌から体を守るしくみを活性化しますが，細菌以外の異物排除のしくみであるアレルギー 応答を抑えます。幼少期の細菌成分への接触の機会の低下はアレルギー疾患にかかりやすさを跳ね 上げます。私たちは Nod という細菌成分を人体が見つけるために必要なタンパク質群について調 べてきましたが，その遺伝子の配列の差でアレルギー疾患やクローン病などの自己炎症性疾患のか かりやすさが上がります。こうした環境と遺伝に影響を受ける病気の研究の最先端では，ヒト全ゲ ノム配列が決定された今，新たな時代を迎えようとしています。病気のかかりやすさを決定する環 境因子と人体のしくみを分子レベルで調べ，結びつける研究が始まりました。本稿では，私たちの 今までの研究を中心にこうした研究のあり方について述べていきます。 キーワード Nod ファミリー，免疫刺激性細菌成分，自然免疫，アレルギー，クローン病 はじめに∼アレルギー疾患と炎症性疾患 における衛生仮説 ぜんそく，花粉症，アトピー性皮膚炎，食ア レルギーなどのアレルギー疾患はダニ，ゴキブ リ，花粉，食物などの成分に対して過剰にアレ ルギー応答をするものです。このアレルギー疾 患は，自然に恵まれ，農業が盛んな環境に生ま れた子供に少ないことが知られています1-6）。 これは，田園部にある田畑，森林，納屋，家畜 小屋には大量の非病原性細菌がいるためである と考えられます。乳幼児期（特に 0 歳児期）に 細菌または細菌成分への曝露する機会が多い と，アレルギー疾患の罹患率が低下します7-16） （図 1）。この現象は約 20 年前に見つけられて， 当時衛生仮説と名付けられ17,18），以来，多くの 議論と研究がなされてきた結果，わかったこと です。この間，衛生的な環境というと，アレル ゲン（非細菌成分）と細菌成分も両方除かれた 環境をイメージすることもあり，衛生仮説とい う呼び方は多々誤解を与えて来ました。細菌成 分への接触機会の増加は田園環境のほか，ペッ ト（特に犬）を飼っているとか家族が多い，窓 の存在などといった環境で見られ19-27），乳児の その後のアレルギー傾向を抑制します13,25,28-31）。 この抑制の度合いは，犬，子供などの戸外での 活 動 に よ る 細 菌 成 分 の 流 入 量 に 依 存 し ま す25,27,30,31）。アレルギー疾患の発症は掃除機で 部屋をこまめに掃除してアレルゲンを除くこと で抑制されます32）。一方，細菌成分は掃除機 で除けないので影響を受けず32），乳児の細菌 成分とアレルゲンへの暴露は，のちのアレルギ ー疾患発症に対して反対の効果を持ちます。一 方，一旦アトピー体質が獲得された子供も大き くなると，大人同様に特定の細菌成分は喘息の 喘鳴症状などの悪化を引き起こすらしいことが 知られています33-36）。つまり，細菌成分による 〒 409-3898 山梨県中央市下河東 1110 受付： 2008 年 2 月 1 日 受理： 2008 年 2 月 5 日総 説
免疫刺激でアトピー傾向が抑制されるのは人生 の中の極めて早い時期であると言えます。 細菌は外環境だけではなく我々の体にも大量 に存在し，実は我々の細胞数より多いです。ア レルギー疾患の子供の過去を調べてみると，乳 児期の細菌叢の差が見つかっています37-41）。乳 児期腸内では当初好気性の細菌の大増殖が可能 なのですが，アトピー傾向者は大腸菌を始めと する好気的な偏性嫌気細菌の増殖と相関し，嫌 気的な絶対嫌気性菌の量と逆相関することが知 られています37-40）。こうした腸内細菌叢の研究 から，乳酸菌導入の効果が調べられました。効 果はアレルギー疾患のかかりやすさは変わらな いという結果で，むしろ症状を改善するのかも しれないのですが42-45），残念ながら改善効果は 弱いらしく，無効であると結論付けるグループ もあります46）。このように腸内細菌の影響は はっきりとしているものの，摂取については発 酵業界などからの影響を受けやすい，Research Conflicts のある研究のため，結論を出すのが むずかしくなっているように見えます。 アレルギー疾患は細菌のような環境因子だけ ではなく遺伝的素因によっても影響を受けま す47）。環境と遺伝両方に影響を受ける疾患はア レルギー疾患だけではなく，炎症性腸疾患など の疾患でも認められることです。こうした疾患 の研究は，フェニルケトン尿症のような遺伝子 変異が発症と直接的に結びつく疾患や，感染症 のような環境因子（この場合，病原細菌）が直 接に結びつく疾患に比べて遅れてきた傾向にあ ります。しかし，ポストゲノム時代を迎えて， 私たちの Nod 関連疾患の研究を含めて徐々に 解明が進んできています。アレルギー疾患の衛 生仮説についていえば，近年，田園部において も衛生状態が改善し，感染症罹患率は低下して います。にもかかわらず，アレルギー疾患発症 率が低いのは，細菌そのものというよりは細菌 成分への曝露が重要である可能性を示唆してい ます。 これはアレルギー疾患だけではありません。 図 1．アレルギー体質と細菌成分とアレルギー刺激の関係 ぜんそく，花粉症，アトピー性皮膚炎などのアレルギー疾患は抗原（アレルゲン）に対する過剰なア レルギー反応によって起きる。アレルギー疾患は環境と遺伝で影響を受ける。環境因子はアレルギー体 質決定と発症の 2 つの段階で関わる。アレルギー体質は，幼少時，特に 0 歳児のときに決まり，田園環 境などで細菌成分による免疫刺激によってアレルギー体質はアレルギー体質にはなりにくくなる（衛生 仮説）。一方，アレルゲンへの曝露は二次免疫誘導の引き金となるので，生育時期に関わらず，アレル ギー疾患を起こしやすくする。LPS などの細菌成分については，こうしたアレルギー体質獲得後，アレ ルギー発症段階において一部の症状を悪化させることが知られている。つまり，細菌成分は乳児期には アレルギー体質抑制に，成長するにつれ，アレルギー体質となった人のアレルギー疾患発症を促進する 二面性がある。細菌から放出される Nod1 刺激分子は極めて安定で，環境因子中での残存性が高い。 Nod1 遺伝子の配列の違いは，細菌成分に触れやすい環境でのアレルギー体質抑制傾向に影響を与える。
炎症性腸疾患であるクローン病（CD）のかか りやすさにも細菌が影響しているらしいことが わかっていますが48），細菌感染そのもので CD のかかりやすさが説明できるものではありませ ん。CD もアレルギー疾患同様に，単に環境因 子だけではなく遺伝によって影響を受けること が知られています49）。白人では特に CD のかか りやすさに遺伝が影響し，現在，複数の CD 感 受性遺伝子が決定されています49）。 Nod タンパク質による細菌成分の認識と生体 防御での役割 このうち，Nod1 と Nod2 の遺伝子の配列の差 （多型）でアレルギー疾患や CD のかかりやす さが変わることがわかりました53-58）。Nod1 と
Nod2 は Ipaf, CIAS1 など約 20 種類のメンバー
とともに Nod と名付けたタンパク質ファミリ ーに属する細胞質内タンパク質です（表 1）50-52）。 田園部では，都市部よりぜんそくにかかる率が 通常低いのですが，ある Nod1 遺伝子多型があ ると田園部でも都市部並みにぜんそく罹患率が 上がります55）。また，Nod2 遺伝子では CD の 罹患率を跳ね上げる多型が複数見つかりまし た56-58）。私たちの以前の解析結果などから，正 常な Nod1 と Nod2 は元来，細菌のペプチドグ リカン（PGN）と関連する小分子群の認識に 関わります56,59-66）。Nod タンパク質は細胞内に 存在し，様々な方法で細胞内に細菌成分を導入 すると応答しやすいことから，細胞内で細菌成 分 を 認 識 し て い る も の と 考 え ら れ て い ま す59,62,66-68）。細菌成分は，細胞表面で Toll 様受 容体（TLR）などを介して認識されることは知 られていたのですが，さらに，この発見によっ 1）複数のグループによる生理的条件下での解析で結果が一致するもののみを示した。直接結合する下流分子の みを示した。2）提唱されている cryopyrin のリガンドは複数ある（本文参照）。3）報告されている結果と組織 発現データーベース SymAtlas を総合して判断した結果を示した。4）N 末端側の PD を介して ASC に，C 末端 側の CARD を介して caspase-4,5 に結合することで caspase-1 を活性化するモデルが提唱されている。5）樹状細 胞には N 末端側に CARD が存在し，MHC-II 遺伝子の転写誘導能を高めるがエフェクタードメイン AD とは異 なる。6）研究者によっては PD ではなく CARD に分類しているが，PD と CARD はαへリックスに富んだ類似 の構造をしているので，両者の区別ははっきりしない。7）マウスの感受性を指標とした。ピロリ菌については 細胞内に PGN 断片を注入すると報告されている。8）発現レベルは極めて低い。9）上皮などでも発現が NF-κB で誘導される。10）M φでの発現は IFNα 誘導性である。11）発現を支持する報告,EST, SymAtlas, マウスのオ ーソログが存在せず，偽遺伝子の可能性がある。12）タンデム遺伝子。13）タンデム遺伝子。セントロメア側 から Nod6,Nod17,PYPAF4,Nod14,Nod16,Mater の順に並ぶ。マウスの対応遺伝子座では 11 個の Nod 遺伝子が並 ぶ。略号： FCAS,家族性寒冷自己炎症性症候群;MWS, Muckle-Wells 症候群;NOMID, neonatal onset multisystem inflammatory disease; M φ,マクロファージ;WDR,WD40 リピート; PD, LRR, 本文参照。
てヒトの細胞は細胞の内側，細胞質においても 細菌成分を認識できることがわかりました50-52）。 実際に，病原細菌の一種，リステリア，サルモ ネラ，野兎病菌などは細胞内まで感染してきま すが，これらの細菌への免疫応答に Nod タン パク質が重要な役割を果たしています69-80）。そ れぞれの Nod タンパク質は細菌の異なる成分 を認識します（表 1）。Nod1 と Nod2 が認識す る小分子群はそれぞれ iE-DAP と MDP と呼ぶ コア構造を持ちます61-64）。他の Nod タンパク 質である Ipaf, CIAS1 も細菌成分であるフラジ ェリンと細菌 RNA をそれぞれ認識しますの で72,75），Nod タンパク質は細胞内での細菌セン サーとしての役割を果たしているとも言えま す。実際，Nod タンパク質は細胞内感染を起 こす細菌の感染症における生体防御において重 要な役割を果たしています70,71）。各 Nod の担 当する病原細菌の種類は異なります（表 1）。 これは Nod タンパク質の認識する成分の違い を反映しているように見えます。各 Nod タン パク質の介する免疫応答は排除できる細菌の種 類が異なります（表 1）。この違いは，認識成 分の差だけによるのではなく，働いている組織 や誘導する免疫応答の差にもよります。例えば， Nod1 と Nod2 は好中球などの呼び寄せに大切 なキモカインの分泌や炎症応答の増強に NF-κ B などの転写調節因子を介して大切な役割を 果たしています67,68,81,82）。一方，Ipaf, CIAS1 は 炎症性サイトカインである IL-1β の分泌に必要 なプロテアーゼ Caspase-1 活性化に重要な役割 を果たしています71-77）。こうした細胞内の信号 伝達の結果，Nod は病原細菌が最初に侵入し たときに働く自然免疫と呼ばれる最初の生体防 御機構を誘導し，さらに，いわゆる「免疫がつ く」にあたる，度重なる感染に対する備えであ る二次免疫の獲得を促します70,72,83）。このよう に Nod タンパク質は細菌に対する生体防御に 重要な役割を果たしています。 Nod タンパク質と関連する遺伝子疾患 Nod タンパク質は本来，細菌に対する免疫 応答，とりわけ炎症応答に重要なのですが，こ の機能がどのように免疫疾患と結び付くのでし ょうか。CD と関わる Nod1 の多型はイントロ ン中にあって機能への影響は未解明ですが53-55）， Nod2 の場合は，CD 関連多型群はコード領域 内に存在し，タンパク質の構造が変わります56-58）。 CD は慢性の炎症を伴う疾患なので，疾患関連 Nod2 多型は炎症を恒常的に活性化する変異で あると考えるとわかりやすいです。ところが， 実際に調べてみると，CD 罹患性に関わる多型 をもつ Nod2 は細菌成分への応答がないか，微 弱であることがわかりました56,60-62）。つまり機 能欠損型の表現型を示すわけですが，事実， CD 関連 Nod2 多型について遺伝型ホモの人で のみ著しい CD 罹患率上昇が認められ，ヘテロ の人ではせいぜい 1.5 倍程度の罹患率上昇でし かありません56-58）。さらに Nod2 遺伝子では優 性の機能亢進変異が知られており，この場合， Blau 症候群という別の全身性自己炎症疾患と なります84,85）。Nod2 による炎症応答促進がな くなることで CD にかかりやすくなるという発 見から，CD による炎症は Nod2 の恒常的活性 化では説明がつかず，もっと複雑なしくみが裏 にあることがわかりました。一部のグループか ら，Nod2 は本来他の病原受容体による炎症応 答を抑えるものであることが報告されました が86），後に否定されました87）。従って，Nod2 が炎症応答の直接的抑制因子であるという説も 否定されています。Nod2 が働かなくなったこ とによって，逆に腸の炎症性疾患になるという 現象は，Nod2 が炎症応答の一部を誘導すると いう事実と一見反するようにみえます。今のと ころ，きちんとこの CD での病態を説明する正 確なしくみはわかっていません。でも以下のよ うな仮説も立てられるのではないでしょうか。 腸には大量の非病原性細菌がいるため，健康な 場合，過剰に免疫応答しないように他の組織と 違って，細菌成分に応答しにくくなっています。
ところが，Nod2 という目を失って敵が見えな くなったことによって，細菌に対して敏感に反 応しやすくなっているのではないでしょうか。 こうした炎症の刺激に対する感受性を Nod2 が 決めている可能性を今後探っていく必要がある と考えています。 Nod1 刺激性という細菌との接触を伴わない細 菌からの環境免疫刺激 細菌成分認識に関わる Nod1 の遺伝子配列の 違いがぜんそくなどのアレルギー疾患の罹患率 に関わっているという発見53-55）は，疫学的解 析から建てられた衛生仮説を裏付けるものとし て注目に値します。特に，最近，Nod1 が特定 の遺伝子配列をもつと，たとえ田園部の人でも 都市部と同程度のぜんそく罹患率となるという 報告55）は，田園部のなんらかの環境因子が Nod1 を介してぜんそくのかかりやすさを決め ていることを示唆しています。しかし，この現 象を考えるとき，当時 3 つの疑問がありました。 1 つめはこれらの仕事は欧米先進国などの疫学 的解析が中心であり，これらの地域では田園部 でも衛生的で細菌感染症がさして多いとは考え られないこと，2 つめは Nod1 が細胞質内にあ るため，細胞外にある細菌分子が本当に刺激で きるのか，3 つめは Nod1 刺激活性をもつ細菌 や細菌成分はアレルギー疾患に影響を与えるぐ らいどこでも存在するものか，という疑問です。 これらの疑問は相互に関連しています。Nod1 は細胞質内にあるわけだから，Nod1 を刺激す るのはリステリアのような細胞質内に進入する ような病原細菌である必要があり，そんな細菌 への感染機会はそんなに衛生環境のいい現代田 園部で多いものか，という疑問に置き換えられ ます。たしかに，私たちは細胞膜透過性を改善 するような人工 Nod1 刺激薬を大阪大学との共 同研究で開発しましたが，この試薬は iE-DAP と比べて千倍もの強い Nod1 刺激活性を持ちま す66,68）。また，リステリアは Nod1 と Nod2 の 働かない RICK 欠損マウスで易感染性を示しま す88,89）。ところが，細胞質内に侵入できないリ ステリア変異体を用いても同じ Nod1 刺激活性 があることがわかりました90）。さらに，体の どの細胞が Nod1 刺激性成分に応答するかを調 べてみると，驚いたことに上皮・中皮のいわゆ る「非免疫」細胞の方が免疫細胞よりも強い免 疫応答を示しました68,69,90）。免疫細胞で主に働 いている他の Nod や TLR などの病原成分認識 受容体とは対称的です。貪食能のない上皮細胞 の Nod1 が，細胞に侵入しない細菌で刺激でき るという発見から，どうも Nod1 刺激性細菌は そんなに特殊な病原細菌ではないらしいことが わかりました。そこで，私たちの周りにいる細 菌を片っ端から単離し，その免疫刺激活性を測 定する方法を開発し，調べたところ，土壌にい るバチラス属細菌に高い Nod1 刺激活性が認め られました90）。バチラス属には炭疽菌や病原 性セレウス菌もいますが，納豆菌（枯草菌）や 非病原性セレウス菌メガテリウム菌などの無害 な細菌が多く，植物の枯草・枯葉などを餌とす るため，森林，田畑，納屋などのいわゆる田園 環境に大量に存在します。さらに調べてみると， 多くの免疫刺激物質が細菌の体そのものに含ま れているのに対して，かなりの割合の Nod1 刺 激分子が細菌から放出されていることがわかり ました90）。私たちは以前に PGN 分解断片が Nod1，Nod2 刺激活性をもつという発見をして いたので59-61,64），一部の教科書では Nod1,Nod2 は PGN を認識すると間違った記述がしていま すが，実際には巨大分子である PGN には応答 しないです61,64）。PGN 自体に応答するのなら ほとんどの細菌が等しく PGN を持つから，ど んな細菌でも Nod 刺激活性はあまり変わらな いはずなのですが，実際には細菌の種類によっ て大きく異なります90）。加えて，貪食能のな い上皮系細胞は巨大分子 PGN は取り込むこと ができませんので，そのことからも Nod1 刺激 分子がこのような放出型小分子であることは重 要です。この Nod1 刺激分子は何かをさらに詳 しく調べてみると，細菌が分裂する際に殻であ る PGN を壊すときや，合成の途中でできる物
質ではないことがわかりました90）。現在，こ の新分子の構造は決定中であり，どのようにし て合成・分泌されるのか調べている最中です。 この Nod1 刺激分子には驚くべき特徴があり ました。加熱しようと，強酸，強アルカリ処理 しようと，有機溶媒変性処理しようと，免疫刺 激活性は失われることはありませんでした64,90）。 このことは，食品や水をいくら滅菌しても，そ の中に今まで見落とされていた免疫刺激活性が 残ることを意味します。こうした無菌食品中に 存在する Nod1 免疫刺激活性がどのくらいある のか，組織的に調べられたことがないので，現 在どの程度私たちの体に影響を与えているの か，不明です。発酵食品についていえば，バチ ラス属を利用する納豆からは極めて高い Nod1 免疫刺激活性が認められる一方，乳酸菌を利用 するヨーグルトからは全く検出されませんでし た90）。また，極端な安定性から，食品以外に も細菌が元々住んでいた環境因子中には細菌を 除いた後にも Nod1 刺激活性が残存することが 示唆されましたが，実際に，自然林からの土壌 や腸内容物からは高い Nod1 刺激活性が検出さ れました90）。腸内細菌がアレルギー疾患を抑 えることは知られていましたが37-45），実際にこ うして刺激活性を測定されたのは初めてです。 こうした腸内細菌などの常在細菌の影響を見る ために無菌マウスが作成されてしばしば使われ ていますが，注意を要するのはマウスを飼うベ ッ ド 材 料 な ど に も Nod1 刺 激 活 性 が あ り ま す90）。つまり，枯れた植物をバチラス属は餌と するために，これらの飼育材料にはかつて存在 した細菌由来の免疫刺激活性があるのです。環 境因子に存在する免疫刺激活性を検討すると き，たとえ無菌マウスといえども，餌はもちろ ん，こうした飼育環境まで含めた徹底した管理 が必要に見えます。ですから Nod1 刺激性とア レルギー疾患の罹患性の関係を調べるとき，動 物実験が必要なわけですが，環境から Nod1 刺 激物質をすべて取り去るということはかなりの 慎重さが必要そうです。こうした場合，反対に Nod1 を欠くマウスの利用した実験のほうが， 同解析に向いているように思われます。私たち はトロント大学と共同研究により Nod1 欠損マ ウスを作製，解析をしてきました64）。こうし た遺伝子欠損マウスの利用によりアレルギー疾 患と Nod1 刺激との関係が明らかになるものと 期待されます。また，我々の開発した強力な Nod1 刺激薬がアレルギー疾患の罹患性や症状 改 善 を 示 す も の か ， 今 後 調 べ る 必 要 が あ り ます。 さいごに このように私たちの研究は，新しい学術分野， 概念を作ることをめざしています。ある人に 「新規じゃなくて免疫学，細菌学，環境学など の境界分野ではないか」と指摘されてしばらく 考えていたのですが，境界はある既成の学術分 野中にある人からの視点であり，例えば免疫学 という言葉ができる前の免疫学の初期の研究に 対する評価と似ています。基礎科学は医学，工 学，農学，薬学といった応用科学と異なって原 因不明の現象から新規概念を構築し，体系化し て理解することに主眼を置いています。私たち の研究も，免疫学，細菌学といった分野そのも のの構築と似て，上記の全応用分野で利用可能 な社会利益を与えるものと考えています。一方 で，特にアレルギー疾患や難治性疾患と関わる 学術分野の場合，目先の利益や応用への圧力は 科学研究助成の取得でさえ Research Conflicts を産みやすいです。事実，企業との関わり合い は利潤が高いだけに，大学での研究の独立性を 保つための保護ガイドラインの拡充が求められ ます。なお，環境と遺伝によって影響を受ける 疾患の解析には，私たちのとった逆遺伝学的ア プローチがきわめて有効です。今回述べた私た ちの研究経緯とこの方法論的メリットは限られ た紙面の都合省かせていただきますが，近く発 売される分子消化器病の「私の履歴書」シリー ズで紹介いたしますので，そちらをご参照いた だければうれしいです91）。今回述べた多くの 仕事は，私と私のポスドクたちだけではなく，
日米欧の合計 100 名ほどの共同研究者との成果 であることを最後に感謝とともに付け加えさせ ていただきます。
文 献
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Intermittent Retrograde Cerebral Perfusion is an Effective Means of Cerebral Protection during Deep Hypothermic Circulatory Arrest
Okihiko AKASHI, Hiroshi OSAWA, Shinpei YOSHII, Yusuke TADA and Masahiko MATSUMOTO
Departments of Second Surgery, Faculty of Medicine, University of Yamanashi
Abstract: Although continuous retrograde cerebral perfusion (CRCP) has been widely used, postoperative transient brain dysfunction sometimes occurs due to continuously elevated intracranial pressure. We have introduced intermit-tent retrograde cerebral perfusion (IRCP) and experimentally evaluated its cerebroprotective effect.
［Methods] Twenty-four rabbits were divided into control (n = 6), hypothermic circulatory arrest (HCA, n = 6), CRCP (n = 6), and IRCP (n = 6) groups. Circulatory arrest (at 20 °C) was done for 45 min in the HCA group, and for 90 min with CRCP or IRCP followed by 30 min rewarming in the CRCP and IRCP groups, respectively. IRCP was re-peated at 50 ml/kg with blood drainage into a reservoir and returned via the maxillary vein. The cerebral tissue
oxy-gen saturation (SdO2) was monitored using near-infrared spectroscopy and the tissue water content was measured
after the experiment.
［Results] During circulatory arrest, the median SdO2ratio (SdO2/pre-HCA SdO2) was 0.51, 0.64, and 0.73 in the
HCA, CRCP, and IRCP groups, respectively. The SdO2ratio at rewarming was significantly higher in the IRCP (1.03)
than in the CRCP (0.86) group. The cerebral tissue water content was 77.4%, 79.8%, and 78.2% in the control, CRCP, and IRCP groups, respectively.
［Conclusions] IRCP provides higher oxygenation for cerebral tissue, reduces cerebral edema, and is superior to CRCP for cerebral protection.
Key words: retrograde cerebral perfusion, hypothermic circulatory arrest, thoracic aortic aneurysm, Near Infrared Spectroscopy, cerebral edema
