総 説
伝統発酵食品における微生物発酵様式の
多様性・頑健性と細菌叢形成の特徴
Diversity and Robustness of Fermentation Property and
Bacterial Microbiota Formation in Traditional Fermented Foods
小 喬
〠921‒8836 石川県野々市市末松1‒308
（石川県立大学生物資源環境学部食品科学科食品微生物学研究室）
Takashi KOYANAGI
（Laboratory of Food Microbiology, Department of Food Science, Faculty of Bioresources and Environmental Sciences, Ishikawa Prefectural University: 1‒308 Suematsu, Nonoichi, Ishikawa 921‒8836）
は じ め に わが国において発酵食品は食文化上重要な位置づけに あり，その種類も極めて豊富である1）．最も食卓に登場 する機会が多い代表的存在として，醤油，味 などの塩 蔵発酵調味料，さらに清酒やみりんなどの酒類，漬物・ 納豆・ヨーグルトといった食品が挙げられよう．これら の食品においては，微生物の代謝活動を利用することに よって食品成分に変化をもたらす発酵プロセスが，製造 における鍵となっているのは言うまでもない．加熱処理 などにおいて厳正な規格を満たす多数の加工食品が食さ れる現代の食生活の中で，(i)食品原料（もしくは原料 の一部）が非加熱状態で，しかも微生物の繁殖可能温度 域で一定期間インキュベートされたものが食用とされ る，(ii)通常生菌数の制限が求められる場合が多い他の 一般食品に対し，あえて高い生菌数を保持する形態で提 供される，といった特徴から，発酵食品はある意味特異 な性質をもった食品とも捉えられる．もちろん，一般的 な清酒や醤油などは通常火入れ（低温加熱処理）の後に 消費者の口に入るため殺菌後の提供となるが，ヨーグル トや発酵漬物のように非加熱での提供を前提としている 食品もあり，酸性化やアルコール生成等の微生物活動に より付与される特徴により，食品としての安全性が担保 されている．これは，発酵食品中において生育する微生 物（主に乳酸菌，麹菌，酵母など）が再現性よく優勢菌 叢を形成し，食品の保蔵状況を安全レベルに維持するこ とによる効果である．この作用によって，コールド チェーン発達以前の常温保管が前提となる時代から，数 多くのなれずし，塩辛，発酵漬物といった伝統発酵食品 群が保存食として受け継がれ，今日も食文化として各地 に存在している． 発酵プロセスを均一化，安定化させる手立てとして， 現代の発酵食品群の多くにおいて種微生物（種菌）を接 種する手法が取られている(Fig. 1)．清酒やヨーグルト をはじめとし，主発酵を担う微生物（酵母，乳酸菌等） を添加して積極的に微生物制御を行い発酵をうまく導く 食品があるほか，醤油および味 等のような塩蔵プロセ スを含む発酵食品でも酵母や乳酸菌の添加技術が確立さ れている．一方で，「なれずし」をはじめとする水産発 酵食品群のように，基本的に種菌の接種は行わず微生物 の自発的な増殖にのみ依存する形式の食品も現代におい 連絡先 TEL: 076‒227‒7460 E-mail: [email protected] Fig. 1 さまざまな伝統発酵食品の微生物（種菌）利用に よる分類 培養した種微生物の菌体を接種する操作が一般的 に行われるか否かにより，主な発酵食品を分類し た（ただし，各食品には例外も存在する）．
本稿では，この種微生物非接種型の伝統発酵食品におけ る微生物学的特徴と細菌叢について，一部の食品に限ら れた知見であるが紹介したい． I. 生もと系酒母（山廃酒母）における細菌叢推移 我が国の発酵食品の微生物研究を牽引した存在とし て，清酒（日本酒）とその微生物に関する研究が挙げら れる5‒7）．清酒は酵母 によるア ルコール発酵を主軸とするプロセスで製造されるが，麹 菌 による米でんぷんの糖化と同時に アルコール生成が行われる並行複発酵形式が取られる． 麹菌によるタンパク質・でんぷん分解活性や酵母の代謝 能に着目し，その後微生物利用に関するさまざまな研究 が展開したことは研究史上言うまでもない．さらに，清 酒の発酵スターターである酒母（もと，酛）に関する乳 酸発酵形式についても古くから研究が進み，すでに1934 年には片桐らにより生もと系酒母中の主要乳酸桿菌 （原 著 に お い て はLactobacillus Saké, 現・ ） が 分 離 さ れ て い る8）． は酒母を乳酸酸性に導き，雑菌の増殖を抑制した うえで，その後の によるアルコール発酵を 成功させる足掛かりをつくる役割を担っている．本菌種 は，一般に酒母発酵初期における硝酸還元菌 （主に 属等） および野生酵母の存在を経た後， 乳酸球菌である 属乳酸菌がいったん優勢化 し （主に ，その他 の優勢化報告もあり），これにやや遅れて優 叢形成を示さない生もと系酒母も存在することが見いだ されており15∼17），筆者らも発酵初期に全く硝酸還元菌 が存在せず，亜硝酸も検出されなかった山廃酒母の例を 報告している18）．この酒母においては，発酵初期より 属細菌が優勢に存在しており，特に が最優勢乳酸菌として検出された (Fig. 2)．さらに，同じ清酒製造業者において別年度に 製造された山廃酒母では，通常の硝酸還元菌から始まる 細菌叢変遷が確認されたため，蔵元別に細菌叢パターン が定まっているわけではなく年ごとに異なる可能性を示 唆するものであった19）(Fig. 3)．一方で，これら2種の 山廃酒母では発酵後期にはいずれも が定石ど おり優勢化しており，本菌種の頑健な優勢化の仕組みが 存在することがわかる．しかし，発酵初期の細菌叢の不 安定さをみると，必ずしも教科書通りの細菌叢変遷を同 一業者の生もと系酒母サンプルの中でさえも示さないこ とがあるのが興味深い． 山廃酒母中での細菌叢の違いが最終的な酒質に及ぼす 影響は，長い清酒醸造の歴史の中で興味を持って研究さ れてきたにもかかわらず，詳しくは明らかにされていな い20）．しかし，今後メタボローム解析等を組み合わせ て代謝成分の特徴を把握することにより，最終製品とな る清酒の微妙な成分的差異が明らかになる可能性があ る21）． 優勢の山廃酒母においては，麹菌酵素に よってグルコース濃度および遊離アミノ酸濃度が発酵期 間中にともに増大していくが，20種の主要遊離アミノ 酸のうちアルギニンについてのみ発酵中期以降に顕著な Fig. 2 生もと系酒母（山廃酒母）中での一般的な細菌叢変遷（左）と解析例（右） 16S rRNA遺伝子塩基配列（V1‒V2可変領域）をGS FLX高速シークエンサーにより解読して得られた細菌叢を属レベ ルで示し， 属の内訳について最も近縁な種を各バーの内側に示した．左図は文献9より，右図は文献18 より改変．ただし， 属については旧分類として示した．
減少がみられ，それに伴い代謝生成物であるオルニチン の増加がみられるのが特徴である19）(Fig. 4)．発酵中に 同サンプルから分離された については，そのう ち38％（24株中9株）の菌株にオルニチン生成能が認め られた19）．オルニチンの生成は本菌種が有するアルギニ ンデイミナーゼ (ADI) 経路によるものであり，代謝に 伴って2分子のアンモニアと1分子のATPが生じる22）． ヨーロッパの発酵肉製品からも頻繁に subsp. が分離され，このケースにおいては肉中に糖質 が乏しいためタンパク分解に伴うアルギニン代謝によっ てエネルギー獲得経路としてADI経路が機能する推測 がなされている22, 23）．しかし，山廃酒母は発酵肉と 違った極めて糖質リッチな環境であり，グルコース濃度 はFig. 4から明らかなように発酵開始後15日目におい て20％を超える19）．山廃酒母は最終pHが4を切る酸性 環境でもあるため，ADI 経路の機能は発酵肉中と異な りアンモニア生成に伴う耐酸性機構の方が，むしろ重要 となっている可能性があると筆者らは推察している．こ のように，同一の菌種でもところ（食品）変われば代謝 機能の生理的意義も異なる可能性も推測され，発酵環境 とリンクして各優勢菌の性状を理解する必要性が伺われ る．最終的には，ADI経路遺伝子欠損株を使用して山 廃酒母中での の生育挙動を評価し，真のADI経 路の存在意義を判断する必要があろう．いずれにして も，山廃酒母の化学成分には上記のような細菌叢の特徴 が反映されている可能性が高く，清酒の精密な伝統的微 生物制御技術に科学的な考察と検証を加えて性状把握を 行っていくことが重要である． その他，生もと系酒母においては，乳酸桿菌が優勢化 せず 属乳酸球菌のみが優勢化するパターン や16）， でなく （現・ ）が乳酸桿菌として優勢化する ケースも報告されている24）． については 清酒醸造において好ましい菌種としてはこれまで捉えら れてこなかった面があるが，近年の報告によると，菌株 によっては生もと系酒母において好ましい品質を得るこ とも可能であることも明らかになっている25）．生もと 系酒母の今後の品質制御のためにも，このような優勢乳 酸菌種の違いが与える最終酒質への影響も今後精密に評 価していくべきと考えられる． II. いずし系なれずし「かぶら寿し」の細菌叢 山廃酒母と同じく 優勢型の細菌叢推移を示す 食品として，北陸・加賀地域の伝統食である「かぶら寿 し」が挙げられる2）．かぶら寿しは，北海道から東北・ 北陸にかけて多く製造文化がみられる「いずし系なれず し」に分類される発酵食品であり，魚介類 （かぶら寿し の場合は，ブリが多用される） と米を混合するなれずし Fig. 3 生もと系酒母 （山廃酒母） 中での細菌叢変遷の例 （Fig. 2 と別年度）
16S rRNA遺伝子塩基配列 （V4可変領域）をIllumina MiSeq高速シークエンサーにより解読して得られた細菌叢を属 レベルで示した．文献19より改変．ただし， 属については旧分類として示した．
Fig. 4 生もと系酒母 （山廃酒母） 中の各化学成分濃度
山廃酒母 （Fig. 3と同一サンプル） について糖 （グルコース，マルトース，およびイソマルトース） （左図），総遊離ア ミノ酸濃度 （主要アミノ酸 20 種） （中図），アルギニンデイミナーゼ経路に関連する特定のアミノ酸濃度 （アルギニン， シトルリン，およびオルニチン） （右図） を測定した．文献 19より改変
地方の「大根寿し」から が遺伝子レベルで検出 されていたが28），筆者らの菌叢解析例においてもやは り の旺盛な増殖が観察された29）． の増 殖は発酵開始後2日目にはすでに始まり，発酵終了日 （8日目）では細菌叢の80％以上を が占有する に至っている (Fig. 5)．発酵開始後 5∼7日後から一般 的に の増殖がはじまる山廃酒母よりも生育が早 く見られており，これは(i)あらかじめ酵素消化を十分 進めたグルコースリッチな糖化甘酒を多量に混ぜ込むこ と，(ii)米と米麹のみを主原料とする山廃酒母と異なり， 野菜およびブリの切り身から供給される栄養源が のいち早い生育を後押しすること，(iii)発酵時に 10℃以下の低温に長く保持される山廃酒母に比してかぶ ら寿しの発酵温度は10℃以上が取られることが多いこ となど，いくつかの要因があると考えられる．しかし， 特徴の異なる 二つの食品の間で同一菌種が優先乳酸菌 となることはやはり興味深い．山廃酒母もかぶら寿し も，冬季に15℃以下の低温で発酵される食品であり， 低温増殖性を有する にとって有利な環境である こと30），本菌種を発酵基質に持ち込む媒体となりうる 米麹をともに利用することなどが，その要因として挙げ られよう．過去の生もと系酒母についての報告では， 属乳酸球菌については製造環境中の仕込み 用器具表面などに年を跨いで同じ株が生残するのに対 し， については年ごとに異なる菌株が蔵に持ち 込 ま れ 増 殖 す る こ と が 示 唆 さ れ て い る31）． パ ル ス めて向上しているため，全ゲノムの塩基配列解析による 株の製造原料・製造環境中における分布の把握 も今後各段に行いやすくなると考えられる． III. 奥能登の「なれずし」の細菌叢 もう一つ興味深い細菌叢形成の例として，石川県奥能 登地域の伝統発酵食品であるなれずしを挙げたい．奥能 登のなれずしは「あじのなれずし」「あじのすす」ある いは「ひねずし」とも呼ばれ，小さなアジを塩蔵ののち に軽く酢漬け（あるいは酢洗い）し，米飯とともに仕込 む発酵食品である32, 33）．5月下旬から6月上旬にかけて山 椒の葉が能登半島に生い茂るころにこれを摘み取り，仕 込みの際に使用するのが大きな特徴である．能登のなれ ずしの発酵期間は1カ月以上取られるが，筆者らの解析 例では，その間9∼41日目までを通して 属 細菌が終始優勢であることが確認されている (Fig. 6)34）． 久田らの報告では，3サンプルの能登のなれずしのうち 二つにおいて が優勢種として存 在しており，残りの一つも と，ともに 属の占有率が高いことからも共 通性が伺われる35）．Fig. 6の例では優勢であったのは であり， 次いで （現・ ） という内訳であった．また，能登のなれずしにおいて6 種の異なる購入製品の細菌叢を調査したところ，全ての 製品において細菌叢の 9割以上が乳酸菌に占有されてい Fig. 5 かぶら寿しの外観および発酵中の細菌叢変遷 16S rRNA遺伝子塩基配列（V1‒V2可変領域）をGS FLX高速シークエンサーにより解読した結果得られた細菌叢 （属 レベル）（左） を示した文献29より改変）．また，かぶらずしの外観を示した （右）．ただし， 属について は旧分類として示した．
たものの，それぞれ最優勢の菌種は製品別に異なってい た （3製 品 で は ， その他の3製品ではそれぞれ , ，お よ び が 最 優 勢 で あ っ た）36） (Fig. 7)． が再優勢であるサンプルもやはり 存在したことから，久田らの報告とも共通する結果が得 られている．しかし， による共通した優勢化例が 多い山廃酒母やかぶら寿しに対し，能登のなれずしの優 勢菌種は製品ごとに極めてばらつきが大きいことが事実 として挙げられる．このように，乳酸発酵は必ず起こる という頑健性は保ちながら，菌種レベルで優勢菌が異な るという多様性も併せ持つところが，なれずしの乳酸発 酵の複雑性といえよう．各乳酸菌種の優勢化要因は今後 個々に明らかにする必要があるが，上に述べたとおり原 料の種類や栄養環境，発酵条件と精密に照らし合わせて 考察する必要がある． IV. 発酵食品間での細菌叢の比較とタイピング 上記のような主に乳酸桿菌優勢の食品群に比して，大 きく異なる発酵菌叢を形成する食品群も存在する．例と して，伝統的塩辛や魚醤油などの高い塩分濃度 （一般に 10％以上） を有する発酵食品が挙げられる．これらの食 品では， 属よりも高い耐塩性を有する 属乳酸球菌や 属細菌の ほうが生育，生残しやすくなる．また，微生物発酵は二 次的，補助的な役割を担っているのみであり，熟成過程 の進行のための主要因としては原料由来の自己消化酵素 に負うところが大きいのも特徴である．しかし，さらに 異なる細菌叢を有する発酵食品群もあり，乳酸菌でなく 属細菌や 属細菌といった特定 の別の細菌群が特徴的に検出される食品もみられる．伊 豆諸島のくさや汁の一部 （ 属および 属が製品により特徴的に存在）や37），アイスラ ンドのサメの発酵食品であるハカール （ 属が 優勢化）38），さらにスウェーデンのニシンの塩蔵食品で あるシュールストレミング （ 属が優勢 菌として分離・検出）39, 40） などが該当する．これらは， すべて本稿冒頭に紹介した種微生物の接種は行わない自 然発酵タイプの食品であり（ただし，くさや汁について は長年の継代培養を経た微生物集合体と捉えられる）， Fig. 6 奥能登のなれずしの外観および発酵中の細菌叢変遷 16S rRNA遺伝子塩基配列（V1‒V2可変領域）をGS FLX高速シークエンサーにより解読した結果得られた細菌叢 （属 レベル）（左） を示した文献34より改変）．また，奥能登のなれずしの外観を示した （右）．ただし， 属に ついては旧分類として示した． Fig. 7 奥能登のなれずし （あじのすす） 製品別の乳酸菌組成 6種類の奥能登のなれずし完成品 (a ∼ f) について16S rRNA遺伝子塩基配列（V1‒V2 可変領域）をGS FLX高速シーク エンサーにより解読した結果得られた細菌叢のうち，含有される乳酸菌について種レベルでの組成を示した．文献36か ら改変．ただし， 属については旧分類として示した．
仕込み時の原料配合や発酵環境・条件によって優勢菌種 が決定されていることになる．このような水産発酵食品 においては，初発菌叢の複雑さや原料魚介類の違いなど によって細菌叢推移が微妙に異なってくる可能性がある ため，完全にその特徴を掴むことは現時点では容易では ない．しかし，上述のように共通した細菌叢の型をタイ プ別に抽出することはある程度可能であり，少なくとも 属をはじめとする乳酸菌叢形成型の食品 と，その他のタイプの発酵食品の細菌叢を分類すること は可能である．含有される代謝物の情報をここに組み入 れれば，さらに詳しく発酵形式のタイプ分けが可能とな ると考えられる．現在手元にある伝統発酵食品の細菌叢 の情報を一部まとめたものをFig. 8に示した．このよう な細菌叢パターンを，例えば「食品発酵型： food fer-mentype（ファーメンタイプ）」とも名付けてケース別 に精密に把握していけば，伝統発酵食品の微生物存在様 式を分かりやすい形で体系化できるのではないかと考え ている40, 41）．例えば，かぶら寿しや山廃酒母のように 初発菌叢は相互に異なっていても，発酵期間中に 優勢型の細菌叢に収斂していく様子が見て取れ る （Fig. 8，実線矢印）．腐敗食品の細菌叢も併せて解析 してパターン抽出すれば，「どこからが腐敗でどこから が発酵なのか，そのときの微生物学的特徴は何か」ある いは「どこが食べられる，食べられないを分かつ境界線 なのか」といったことを将来的に見極めることも可能と なるかもしれない．このような話題は，「将来何に役に 立つ知見なのか」と言われると少し弱ってしまうところ も確かにある．しかし先に述べたように，コールド チェーンの未発達な時代からどのようにして微生物によ る発酵作用から便宜を得つつ食品保蔵技術を編み出し， 新たな味覚の創出のために人類が努力を重ねてきたの か，その軌跡を知る意味でも，純粋に人間にとって興味 深い食品科学的に解明すべき命題であると考えている． 謝 辞 本稿の研究の一部は，地域イノベーションクラスター プログラム （都市エリア型） （文部科学省，平成21∼23 年度），東和食品研究振興会・学術研究助成（平成25, 27年度），ソルト・サイエンス研究財団・研究助成（平 成26年度），大下財団研究助成（平成28, 29年度）に よって遂行されたものである．上記プロジェクトにおい てお世話になった，熊谷英彦先生，片山高嶺先生，榎本 俊樹先生はじめ多くの先生方，石川県の発酵食品につい てご教授をいただいた久田孝先生，本研究遂行中に急逝 された松井裕先生と清原正志博士，石川県工業試験場の 辻篤史氏をはじめとする多くの石川県公設試験場の研究 員の方々と，サンプルをいただいた多数の企業の方々， 多くの学生諸氏に，ご協力とご指導をいただいたことに 深く感謝を申し上げる．また，本研究を開始する際に高 速シークエンス解析についてご教示いただいた園元謙二 先生，中山二郎先生に深く感謝を申し上げる． 参考文献 1） 日本の伝統食品事典．日本伝統食品研究会編，朝倉書 店，東京 (2007)． 2） 全国水産加工品総覧．福田 裕，山澤正勝，岡 惠美子 Fig. 8 各伝統発酵食品の細菌叢の特徴 主成分分析を使用，dはかぶら寿しおよび山廃酒母の発酵日数を示す．文献40より改変．ただし， 属につ いては旧分類として示した．
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