答 関 研究 網膜色素 皮 高 浸透圧応

金 沢大学 十全 医 学会 雑 誌 第¹0 0巻 第5 号 9 0 9 ^叫93 2 く¹99い

ヒ ヨ コ 網 膜 色 素上皮^の高浸 透圧 応答^に関す ^る研 究

一 細 胞 膜 電 位か ら の検討 ^一

金 沢 大 学 医 学 部眼科芋 講座 は 任^こ河 崎 ^一夫 教 授う

白 尾 裕

く平成3 年 9 月10 日受 付ン

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浸 透圧勾 配がヒ ヨコの遊 離 神 経網 膜^一 網 膜 色 素上皮 t^{r et}in al _pi_gm e nt epitheliu m，R P El 層^一 脈 絡 膜標 本^の電 気的 性 質^{に お}よ ぽ す効 果を検 討し た． 非 光 刺 激によ る R P E 機 能 検 査 法と して臨床 的^に用^い ら れ る高 浸透圧応 答^の際^に生 じ る と考え ら れ る浸 透圧勾 配に近 似し た浸 透圧勾配の効 果を主に調^べた．

上記標 本^の光^に対す る応 答お よ び R P E 細 胞^の電 気 的 性 質は， 硝子体 側ま た は脈 絡 膜 側の濯 流 液に 2 5^m M マ ニト^{ー ル}を加え る^ことくそ れ ぞ れ硝子体 側 高浸透圧負 荷ま た は脈 絡 膜 側 高 浸 透圧 鄭 削 ^によ っ

て得ら れ た浸 透圧勾 配^によ^って変 化し た^■ す な わ ち硝子体 側 高 浸 透圧負 荷は， 神 経 網 膜を は さ む電 位 く^{tr a n s−n e u r a}lr etin al pote nti al，V RJ を変え ること な く R P E 層を は さ む電 位くtr a n s⁻epitheli al pote nti al，

T E PI を増 大さ せ その結果 標 本を は さ む電 位t^{tr a n s−t}is s u epote ntial，T T P l も増 大させ ，標 本を は さ む電 気抵 抗 くtotal tis s u e r e sistan C e，RT 。，I を減 少さ せ， R P E ベ ^ー ザ^ル膜電 位を脱分極さ せ^， R P E 細 胞膜 電 気 抵抗比^a くR P E ア ピ か^レ膜 電 気 抵 抗ノ^{R P E ベ ー ザル}膜 電 気 抵 粕 を上 昇 さ せ， スロ ^ー P 川振 幅を変え る こと な く R P E c 波 振幅 を増 大さ せ その結 果 網 膜 電 図 く^ele ctr o r etin og^{r a m ，}E R G I c 波振 幅を増 大さ せ，

R P E c 波^の起 源^であ る と^ころの R P E ア ピ カ^ル膜過分極^の振 幅を減 弱さ せ た^． 上記の結 果は， 硝子体 側 高浸 透圧負 荷^{は R P E ベ ー ザル}膜 電 気抵 抗を減 少させる と考え れ ば も ^っと も簡 潔^に説 明さ れ た． 脈絡 膜 側高 浸 透圧負 荷は， V Rを変え ること な く T E P を減 少さ せ その結 果 T T P を減 少さ せ^， RT 。，を増 大さ せ， R P E 細 胞 膜 電 気 抵抗比 ^a を低 下さ せ． スロ ^ー P III振幅を変え ること な く R P E ^c 波振 幅を減 弱さ せ そ の結 果E R G c 波 振 幅を減 弱させた^一 上記^の結 果は， 脈絡 膜 側 高浸透圧負荷は R P E ^{べ −} ザル膜 電 気抵 抗を増加さ せ る と考え れ ば もっと も簡 潔に説 明さ れ た． 硝子体， 脈 絡 膜の いず れの側^の高 浸透圧負 荷も E R G 明 極大を減 弱^{させた が}両側 同 時の高浸透圧負 荷は E R G c 波^およ び 明極 大の発 現には影響^{せ ず}， 高 浸透圧自 体よ り も浸 透圧勾 配が R P E に対す る 上記の効果の発 現^に必要な^こと が判明 し た^． 本研 究は，

弱^い浸透圧勾配 は^いず れの方 向であって も 主^に R P E ベ ^ー ザル膜に作用 し， かつ E R G c 波は R P E ベ ^ー

ザ^ル膜 電 気 抵 抗^の変 化を鋭 敏に反映す ること を明らか にし， さ ら^に臨 床 的 高浸透圧応 答^{に生 理}学 的 基盤 を与え た^．

Eey ^{w o r}ds ele ctr o r etin og^{r am} ， O S m Otic g^{r a}die nt， r etin al _pi_gm e nt epi_thelium ，

m e mbr an e P^Ote ntial， Chick

眼球^には暗所に おい て後 極 側^に対して前極 側 陽性^の 層^から 発 す ること が 知 ら れてし¹る^{5 J．} 当 教 室^{に お い}て 直流電 位が存 在し， これ は 眼球 常 存 電 位と呼ば れ 高浸 透圧溶 液の静脈 内投 与は 眼 球常存 電 位を減弱 させ る^{I I．} 眼球常 存 電位の ^一 部は角 膜²⁻， 毛 様 体^{3 ，}な ら びに水 ること を 発見し^{． ニ}れ を高 浸 透圧応 答と命名し， さら

晶僻 な どに由 来す る が， その大 部 分^は網 膜 色 素上皮 にその発生母 体が網 膜 色 素上皮 層であ ること を明らか

A b br e viatio n s ニ E R G ， ele ctr o r etin og^{r a m} 三iR_， intr a r etin al extr a c ellula r c ur re nt ニ R 恥 apic al

m e mbr a n e r e sistan C ei Rb a_，b a s al m e m bra n e r e sista n c ei R P E ， r etin al _pi_gm e nt epitheliu 町 R R_，

i

n_tr a r etin al e xtr a c enu a r r e sistanc ei RR P E， r etin al pi_g m e nt epitheli al _{r e s}ista n c e3 Rs_，p^{ara C e}uula r

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にし^{6 ト 1 刀}， 高 浸透圧応 答が原 発 性 黄斑部 変 性症^{1 8 −}． 糖尿

病 性 網 膜症^{1 即}， 網膜 色素 変 性 症^{2 0 I}． 網 膜 剥 離^{2 1，}． その他

の網 脈 絡 膜 疾 患^抑や白 内障 手 術 後^{2 2 1な どに おい てし ば} し ば異 常を 呈 す る^こと を見 出し た^． 高 浸 透圧応 答^は網 膜 色 素^上皮 層 機 能を評 価す る方 法と し て網 膜 電 図 く^ele ctr o r etinogr a m ，E R G I c 波^{2 3}や 明極大^{封 ト 2 6I}と は異な り光 刺 激を 必要と し なし¹の で． 神経 網 膜や 瞳孔^2丁−の状 態^に直 接 影響さ れ ずに網膜 色 素上皮 層^の状 態を調^べ ら れ る という利点を宿す る^． 向^{1 6 −}はカエ ル の遊 離網 膜 色 素上皮 層 ^一脈 絡 膜 標 本^の脈絡 膜 側^{に 1 0 0m} Os m ド ^ニ

ト^{ー ル}1 00n lM 添 加 ^の高 浸 透圧 を負荷し． 摘 出眼杯 動物 実 験^{1 1 Iぉ}よ び^ヒト^{に お} け る高 浸 透圧応 答^{1 2，}と同 極 性の電 位 変 化を記録し た， 本 研 究で私は高 浸 透圧応 答

の発 生機 構を温 血動 物眼 で明ら^{か に}す る^こと を目 的と し て， 1 0 0m Os m のみ な らずむ し ろ^ヒトに用^い ら れ る 程 度^の軽 度の高 浸 透圧負荷^{1 2 −}を^おもに用^いて^{ヒ ヨコ}遊 離 神 経網 膜一網 膜 色 素上皮 層^一 脈絡 膜 標 本^に対す る高 浸 透圧負荷^の影 響を調^べた^{． ヒ ヨコ}は カエル には欠如 す る が^ヒトには認め ら れ る 明極 大を有す る と^いう点

で_， カ^エル にく ら^べて^ヒト^{に お} け る高 浸透圧応答^の機 構を類 推す る^{の に}適す る． 本 報^{で 用いたヒ ヨコ}遊 離神 経 網 膜 ^一 網 膜 色 素上皮 層 ^一脈 絡 膜 標 本は少な く と も下 記^の3 つの利 点を有す る^． す な わ ち^{こ の}標 本で はQ 安 定な直 流 増 幅E R G 記録が 可能^であり E R G c 波およ び 明 極 大の記 録^の試み が可能^であ る^． 明 極 大は網 膜 色 素 上皮 層機 能 検 査^に従 来用^いら れ て き た が^引， 温血動 物

の遊 離 神経 網 膜一網 膜 色素上皮 層^一脈 絡 膜 標 本^{に お}い

て は明 極大^の記線^の報 告は稀で あ る^． 母網 膜 下 腔1 網 膜 色 素上皮 層よ り も神 経網 膜 側^にあ る視 細 胞 外節 周 囲

の細 胞 外 空 間1 内^およ び網 膜 色 素上皮細 胞 内^からの ガ ラ ス微 小 電 極^によ る電 位 導 出^およ び網 膜 下 睦 内^{に お}け る イ オ^ン濃 度^のイ オン選 択 性ガ ラ^ス微小電 極^によ る測 定が可 能^であ る． ゆ^{負 荷すべき高 浸 透圧の程 度を精密}

に管理でき る^． 本 報で はヒ ヨコ遊 離 神 経 網 膜一^{網 膜 色} 素上皮 層^一脈 絡 膜標 本^に網 膜 下 艦 内ガ ラ^ス微小電 極 法 を 用^いて， 主^{に と}卜に用いら れ る程 度^{1 2 一に}近 似の軽 度

の高 浸 透圧 負荷^によ^って生じ るゆ^{遊 離神 経 網 膜}一網 膜 色 素上皮 層一脈 終 膜 標 本^{を は さ む}電 位く^{tr a n s}−^{tis s u e}

pote nti al， T T Pl の変 化を網 膜 色 素上皮 層 由 来^の成 分 と神 経 網 膜 由 来^の成 分とに分けて調べた^． さ ら^に魯 網 膜 色素上皮 細 胞 内ガ ラス微 小 電 極 法^によ り網 膜 色 素上 皮 層 由来^の成 分を裏 付け る網 膜 色 素上皮 細胞 膜 電位 変

尾

化を調^べ た^． 同 時に命^{綱 膜色 素上皮 細 胞 内にガラス}微 小 電 極を刺入 し た状 態^で遊離 神経 網 膜w 網 膜 色素上皮 層一脈 絡 膜 標 本を は さ む 方向^の外 因性電流を流すこと によ^って遊 離 神 経 網 膜一網 膜 色 素上皮 層一脈 絡膜 標本 全 体^の電 気 抵 抗と網 膜 色 素上皮細 胞膜 電 気抵 抗の推移 を調^べ， CD 最 後^に E R G ^c 波^およ び 明極大に およ ぽ す 高浸 透圧負荷の影 響を網 膜 下 腔 内ガラ ス微 小電 軋 網 膜 下 腔 内K イ オ^ン選 択 性ガ ラス微小電 極な ら びに網膜

色 素上皮 細胞 内ガ ラス微小電 極を 用 ^いて調べた^．

材 料およ び 方 法 工． 模 本作 成方 法

膵 化 後2 ^へ12 日^の白 色 家 鶏 くGク7Jz 蒔 加椚 e 5オブc 51 ^ヒヨ コ7 6 羽 を 用^いた^． 標 本 切り出し中^の網 膜 剥 離を 予防す る目 的^で， 約2時 間白 熱 電 球 下し約5 0 0 1u xラ で 明 順応

の後． 約1 0分 間の暗 順 応を与え写 真用暗 赤 色灯^による 照明 下 で断頭し 眼球を摘 出し た^． 摘 出し た 眼球を角膜 を 下にむ け て^シアノアクリ^{レ ー} ト系 接 着 剤 く^{スー パ ー} ボンド ア^{ロ ン}アル ファ壬i

， 小西 産 業t 大 阪1^で標 本切り 出し 用水 槽 内^の台 座^に固 定し た^． 標 本 切り出し 用の水 槽 内を対 照 濯 流 液く組 成^こ1 2 0．Om M NaC l． 2 5 ．OmM NaH C O3_，2 5^．O ^m M G lu c o s e， 5^．O m M K C l，3 ^．OmM M_gC l^{2． 1．}8 ^m M CaC 12． S igm a C he mic al Co mpa ny⁻ S^t．Lo uis，M O ， アメリ カ合 衆巨副 で満た し^， 濯流液中

に9 5％ 0ユー^{5 ％C O2混合 気体を常 時 通 気し， 濯 流液}

を直 流^ヒー タ ^ー く電 池 駆 動I ^で3 6士l ^OC に保ち， その pH を7^．5 0士0^．0 5^の範 囲^に保^っ た^一 眼球を標 本 切り出 し 用水 槽 内に固定し た後． 暗 赤 色 光照 明 と実体 頗微鏡 下で， あ ら か じ め防 錆 油を除 去して おい た剃刀 を 用^い て脈 絡 膜を破 損し な^い よ う に可 及 的 迅 速^に約3^x 3m m の強膜 窓を作 成し た^． 強 膜 窓よ り 眼科用^バラッ

ケ氏 虹 彩 労刀 を強 膜と脈 絡 膜との間^に挿入 し て^， ほ と ん ど す^べ ての強 膜を 切除し脈 絡 膜を露 出さ せ た^， 露出 さ れ た脈 絡 膜を鋭 利な剃刀片で穿 刺し^， そ^の創^から 眼 科用 ^バラッケ氏虹彩 努刀 を挿入 し て約5^x 5m m の遊 離神 経 網 膜 ^一網 膜 色素上皮 層一^{脈 結 膜 標 本を 切り出し}

た． 眼 球摘 出から強膜 窓開 窓ま^{で の}時 間が数分 を越え る と^， 遊 離 神経 網 膜一網 膜 色素上皮 層一^{脈 結膜標本切}

り出し^のさ^{い に}神経 網 膜^の白 色混濁_く^スプレ ツディン

グ デ ブ^レ ッ ショ ン^{2 8 ，}と考え ら れ る1 が し ば し ば観察さ れ た^． 切 り出し た遊 離 神経 網 膜 ^一網 膜 色 素上皮層^一脈 絡 膜 標 本を薄^い プ ラスチッ ク シ ^ー ト 描^いX線写真用

sh u nt r e sista n c eニ RT O T_， tOtal tis s u e re sista n c e三 T E P， tr a n S⁻epithelial _pote ntial _ニ T T Pl

tr an S⁻tis s u e p^ote ntial_三 V a 功 apical m e mbra n e p^ote ntial_三V ^，恥 apical m e mbr an e bat te ry i V 励

ba s al m e m br an e p^Ote nti al _i V ^，b a，ba sal m e m br a n e b atte ry ニV R，tr an S⁻n e u r al r etin al _pote ntial

ヒヨ コ網 膜 色 素上皮 細胞 膜 電 位^の高 浸 透圧応 答

の^{フ イ ル ム の}乳剤を剥 離し て自 作し た も^の1 ^に作ら れ た直径^{3m m の}孔を覆う よ うにし て脈 絡 膜を プ ラス チックシ ^ー ト側^に向け て載せた． ついで プ ラ^スチック シ^ートに遊 離 神経 網 膜一網 膜 色 素上皮層一脈 絡 膜 標 本 片を載せ た ま ま 切 り出し 用水 槽^から静かに引上げ， プ ラ^スチックシ^ー ト の孔^に対 向す る よ う^に直径3m m の 孔の開け ら れ た ア ク リ^ル樹 脂 製プレ ^ー トの間^には さ ん で， 濯 流用^の チェ ン バ ^{ー 嘉川和一}く図¹ ， 以下 単^{にチェ ン}

バ ^ーと略 記1 ^に挿入 し た^． 2枚のアク リ^ル樹 脂 製^プ

レ^ート^のう ち遊 離 神 経 網 膜一^{網 膜 色 素上皮層}一^{脈 絡 腰} 標本^に直接 接す る方の プ^{レ ー} ト^には標 本を過 度^に圧迫 し な^いよ うに， 直 径1 0m m で標 本^に対し て 凹 と な る よう^に頂角1 73^{8 の}円 錐 状の研 磨をあら か じ め施し て お いた^． 以 後， 遊 離 神 経 網 膜^一網 膜 色 素上皮 層一脈 絡 膜標本^{の 2} 面^のう ち本 来 硝子体に接し て^いた側を硝子 体臥 強腰^に接し て^いた側を脈絡 膜 側と称す る^． プラ スチックシ^ー ト， ア ク リ^ル樹月旨製プレ ^ー トおよ び チ^ェ ンバ ^ー 間^に生 じ る 空隙を^シリコ ン真 空グ リ ^ー ス く比gh Va c u u m

R

， Co min g M edical a nd Scie ntific， Ne w

Ha v e n，C T， アメリ カ合 衆 国I を 用^いて水漏 れ^のな^い

よう^に充 填し た^．

ヒ ヨコな どの網 膜で は， 低 温， 光 刺 激． 機 械 的 刺 激 な どで容 易^{に ス}プレ_ツディ ング デ ブ^レッ ショ ンを 生 じ ること が 知 ら れ^{て い}る^認l． これ を可及 的低 頻 度^に抑え る た めに_， 強 膜 窓 開 窓まで の時 間を^でき る だ け 短縮

T E P o r V_ba

鴨 ^{O r} 鳩p ^．鴨

T T Pく^{E R G}l

Sa m e Ast he C Iw roid^alSide

91 1

し， 眼 科顕微 鏡 手 術用器 具を 用^いて顕 微 鏡下で非 常^に 精細な標 本^の切 り出し を行ない， 濯 流 液の温 度を厳 密

に管理 し t 上記1， 湾 流液 中の M g^2十 濃 度を 比較 的 高く く3^．Om M l す る^ことによって． 遊 離 神経 網 膜 ^一網 膜 色 素上皮 層^一 脈 結 膜 標 本作 成^に伴うスプレ ツディ ング デ プレ_ツシ ョンを ほ ぼ 予防す ること が で き た が， 実 験 過 程 中^{に ス}プレ ツディ ング デ プレ_ッ ショ ンが生じ た場 合

には その実 験を検 討^の対 象か ら除 外し た．

王工^． 湾 流 方 法

チ^{ェンバ ー} は標 本の硝子体 倣^およ び脈 絡 膜 側^にそ れ ぞ れ別 個の流入孔と流 出 孔を有し た^． 濯 流 液^の流入出 は重 力によっ た^． 遊 離 神経 網 膜 ^一網膜 色 素上皮 層^一 脈 絡 膜 標 本の硝子体 側^およ び脈 絡 膜 側は ア ク リ^ル樹 脂 製 プレ ^ー ト^の孔を通じ て そ れ ぞ れ硝子体側^およ び脈 絡 膜 側^の濯 流 液^に接し たく接触 面 積は と もに0．0 7c mう^． 硝 子体 側お よ び脈 絡 膜 側^の潜流 液は遊 離神 経 網 膜 ^一 網膜 色素上皮 層^一 脈 絡 膜 標 本お よ び ア ク リ^ル樹 脂 製プレ ^ー

ト で隔^てら れ^{て い}るの で， 各々独 立に異な る濯 流 液^に 切り替え る^こと が 可能で あ^っ た^． 遊 離神 経 網 膜^一網 膜 色素上皮 層一脈 絡 膜 標 本の かわ りに密 閉用フ イ ル ム

くPa r afi lm ^R ， A m eric a n Ca n Co m pa ny，Ne e n ah，W I，

アメリカ合 衆 国I を は さ ん だ状 態で は硝子体 側と脈 絡 膜 側のチ^ェン バ ^ー く各々 の容 積は1．7mlI 間^の電 気抵 抗 は10 0 k Q 以 上 あった か ら， 硝子体 側^{およ び}脈 絡 膜 側 チ^{ェンバ ー} 間の電 気 的絶 縁は遊 離 神経 網 膜^一網 膜 色 素

圭三宝謁

に ニコ仁斎

拗 韓杉 L c。n S．a 。t C。，，e 。．J D C H^e

D C H^e融^er

S血Jr C e

Fig^．1^． Sche m e of the pe rfu sin_g a nd r e c o rd ing syste m ． T he pe rfu sing ap pa r atu s W a S ide ntic al fo r both of the vitr e al a nd cho r oidal ch am be r s． T he mic r od riv e is n otillu str ated he r e．T he p^{e r}fu sin_g cha mbe r，the mic r cd riv e，the r e s e rv Oir s an d a C O n Sta nt C u r T e nt S O u r C e fo r tr a n s⁻tis s u e c u r r e nt p^{a s s ln}g ^{W e r e} pla c ed in a n ele ctr o m agn etic sh ield c age．Pe rfu s ate s w e r e gr a vi_{t y}⁻fed， C O n Sta ntl_y bub bled with 9 5％0²−⁵％C O2 ga S a nd he ated by E C⁻he ate r sto yield a stab le te m pe r atu r e of 3 6士1^OC and a pH of 7^．5 0士0^．0 5^． Fo r ab br e viatio n s，S e e the lege nd fo r F ig^．2^．