金 沢大学十全医学会雑誌 第84巻 第2･3号 117‑134 (1975) 117
polyomavirus'処理細 胞 にお け る Influenzavirus(NWS株) の増殖促 進現 象 につ いて
〔Ⅱ〕増殖増強 の機作 と活性因子 の性状 .
金沢大学 がん研究所 ウイル ス学講座 (主任 :波多 野基一教授 )
木 村 晋 亮
(昭和49年11月28日受付 )
本論文 の一 部 は,第45回 日本細 菌学会 総 会 (1972),第7回 および第10回 日本細 菌学会 中部支部総会 (1970,1973)で発表 した .
我 々は, これ までの報告t)2)で , 接 種 InRuenza virus(ⅠⅤ)(NWS株)の赤血球 吸着 誘発感 染価(HAD50)
と培 養液中 への産生 ウイル スの赤血球 凝 集 価 (fiA価 ) 測 定 法 を 主 と し て 用 い , Polyomavirus (PV) によ るNWS増殖増強現 象 を明 らか に し, そ の 機 作 解明 を試 みて きた .その結果 .NWS側 よ りみれば . PV処理 に よ り細胞 が NWSを特､に吸 著 し易 くな っ たので はな い こと,これ ら処理細 胞 で増殖 した NWS
は.正常 未処理細 胞で増殖 した もの と免疫 学 的 な 差 が ない こと,また PV存在下 で はNWSの 自家 干 渉 (autointerference)が減弱回復 され る こと.更 に この 自家干渉 に は interferonの産生放 出 が な い こ と な どを見出 した .一方,PV側 よ りみれば,PV処 理 で 細胞 が NWS増 殖 に促 進 的 に働 く stimulonや
enhancerの よ うな増殖促 進物 質3)を産生 す る の で は な く,かっ紫外線 (UV)不活化 PVで も増 強活性 が あ ることか ら,む しろPVサ ンプル中 に . 活 性 ウ イ ル ス粒子以 外 の活性 因子 が存在 す る可 能性 を指摘 して きた .
そ こで . この第2報 で は .UV半不活化 NWS も 含 めて,NWSのG2細 胞感染増殖 過程 に及 ぼす PV の影響 , PVサ ンプル中 の活性 因子 が , PV粒子 自 身 なのか或 いはPV増殖 に用 いたマ ウス胎 児 細 胞 の by‑productなのか などを中心 に検討 を加 え た .前 報 で は多用 で きなか った NWSの plaque assay4)ち その後改良 され .再現性 が確 実 にな ったので , 本 実 験 で は この方法 がNWSの定量 に多 く用 い られ た . 得 られた結 果 につ いて以下 述 べてみたい .
材 料 と 方 法 I.使用細胞
ヒ ト骨 巨細 胞 腫由来 の継代培 養細 胞 で あ るG2細 胞 を用 いた .培 養 条 件 は前 報1)2)と同 じ く, Eagle MEM培地 に コウシ血清 を10%に添加 した もので培 養
し,継代 は通常 の EDTA と trypsinを 用 い る分 散法5)に よ っ た . ウ イ ル ス感 染 後 の 細 胞 の 維 持 液 (maintenance medium :MM)に は,LEagleMEM
を用 いた .
Ⅰ.ウイル ス
Innuenzavirus(ⅠⅤ):A/NWS/39株 (NWS)の発 育鶏卵増殖継代株 を用 いた . 赤血球 凝集価 (HAU/
0.5ml)は,128‑256,plaque formingunit(PFU /ml) によ る感染価 は. 2.6‑5.0×107の ものを実験
に供 した .
Polyoma virus (PV):4B5‑6株 お よびSE株 を用 いた .何 れ もSwiss系 マ ウス胎児 (ME)初 代 培 養細 胞 で増殖 した継代株 で .主 と して用 いた4B5
‑6株 は,HAU/0.5mlが 1.024,感 染 価 が tissue culture infective doses (TCID50/0.2ml)で10日 を 示 した .SE株 は1,024HAU/0.5mlの もの を 使 用
した .
Cow pox virus (CPV):LBR株 で , VERO 細 胞 で増殖継代 した1.0×106PFU/mlの もの を実 験 に供 した .
ウイル スの稀釈 には. す べ て Eagle MEM を 用 いた.
Enhanced Multiplication of Influenza Virus (NWS Strain) in Cultured Cell Lines Treated with Polyoma Virus(4B5‑6Strain).NobuakiKimura.Departmentof Virology (Director :Prof.M.Hatano),Cancer Research institute,Kanazawa University.
Ⅲ.NWSの定量
1.培 養液中 の産生 NWSの HA価測定 :Micro titer法6)によ ったが .ニ ワ トリ赤血球 濃度 を0.4%に
した外 は,前報1)2)と同 じく,凝集像 を示 す NW S の 最 高稀釈 を もって HA価 と した .
2.NWS感染 によ る赤血球 吸着 陽性細 胞率 (HA.D
%)の算定 : 既述 の方法7)によ った .即 ち ,NW S を細 胞 に接種 し,370C3時 間吸着 させ た後 , 適 宜 の 時 間 に.感染細胞 を EDTA (Ethylenediaminetetra卜
acetate) お よび trypsinを用 いて分散 させ た . Hanks液 で分散細胞 を 1回洗 液後 ,細 胞 を1.0×106/ ml前後 にEagle MEM に浮 遊 し,これ に等 量 の0.5
%新鮮 モルモ ッ ト赤血球 液 (M/15リン酸 塩 緩 衝 化 食 塩水 (PBS),pH7.2.に浮 遊 )を加 え た .4oC に 1 夜放置後 ,血球 計算板 を用 い鏡検 し,1,000個 以 上 計 数 した細胞 に対 す る赤血球 吸着 (HAD)陽 性 細 胞 の 割合 を HAD% と した .この場合 .鏡 検 で 細 胞 の 全 面 または一 部 に3個以上 の赤血球 が ｢イガ ダ リ｣状 に 付着 した ものを HAD陽性細 胞 と した .
3. Plaque assayによ る感染価 (PFU)測定 : 直径50mmの Petridishに単層培 養 したG 2細 胞 を Hanks液 で′2回洗 催 し,測定材料 (NWS含有 ) を1.Oml接種 した .37oCで3時 間吸着後 ,接種材 料 を 捨 て ,更 に Hanks液 で洗 礁 し,第1次 Overlay medium (OM)を重層後 . 5% CO2･incubatorで 34oCに培養 した .3日後 に NeutralRedを 含 む 第2次 OMを重層 し,翌 日ブ ラ ックを計数 した . 重 層用 の mediumは,前報2)の ブ ラ ック瓶用処方 を 改 良 し,CO 2培 養用 と して次 の処方 の ものを使用 し た .
第1次 重層用medium : Medium‑199 ま た は Eagle MEMの10倍濃縮液10, 0.5M Tris‑buffer (pH7.6) 2,5% Bovine Plasma AlbuminFrac･
tion V (Armour) 2, 1% DEAE Dextran (Pharmacia)1,7.5%炭 酸水素 ナ トリウム液 2,蒸潜 水 (3回)33. 2% SpecialAgarNoble (DIFCO) 50.全 量100を 6ml/dish用 いた .
第2次重層用 medium : Medium‑199ま た は Eagle MEM の10倍濃縮 液 10,7.5%炭 酸水素 ナ トリ ウム液 2,0.2% NeutralRed (DIFCO)5,蒸潜水 33, 2% SPecialAgar Noble 50,全 量100を 2 ml/dish更 に重層 した .
これ ら重層用 mediumは ,何 れ も使 用 時 混 和 し , 42oCに保温 しなが ら用 いた .
Ⅳ.紫外線 (UV)による NWSの半 不活 化 前報2)と同 じ方法 で .種 々の時 間照射 を行 い , 半 不 活化 された NWSを用 いた .
その他必 要 な実験方法 は,各項 目でL れ ること ゝす る.
成 績
I.NWS吸着 に及ぼす PV処理 ま た は 共 存 の 影 響
前報2)で ,PV処理 は細胞 の NWS疲 著 率 を 特 に 上昇 せ しめない ことをみたが ,この点 を更 に鋭敏 な方 法 を用 いて再検討 した .とい うの は ,吸着率 の単 な る 上昇 が増殖増強 の機作 なのか ど うか は.最 も本実験 の 基本的問題 に連 ると考 えたか らで あ る.従 って こ ゝで は,PV処理 また は共存細 胞への実 際 の吸 着 度 , お よび末吸着残存 NWSの plaque assayとい う2 つの面 よ り追求 してみた .
まず ,NWSを moi(multiplicity of infection)
‑1.0で,PV処理 または共存 お よび対 照 の3群 のG 2 細 胞 に接種,37oCで3時 間細 胞 に吸着 さ せ , 各 群 で 感染細 胞 の数 を示 す HAD%の経時的 変 化 を測 定 し た .これ は .実 際 に吸着 した NWSの時 間 的 増 殖 に
Fig.1. Hemadsorption ofG2cellscaused by adsorbed NWS virus, m.o.i.‑0.1
CELL HADi
N芯sトdsIorption｣Mi 5 7 9 HOURS AT 36oC
(○):untreat
edcells(control). (●):cellspretre
ated withPV(10‑I), (△):cellsinoculated withNWS inthe
p
polyomavirusによ る InnuenzaviTuS の増殖 促進 〔H〕
っれ ,吸着感染成立細胞 にはHADが 必 ず 出 現 す る ことに基 ず いてい る.その結果 をFig.1に示 した . これをみ ると,HAD陽性細 胞 は ,各 群 何 れ も接 種後4時間で始 めて出現 し,以後9時 間 まではゞ直線 的 に増加 しなが ら.85‑90%の値 とな り.3群 の問 に 著明 な差 はみ られ なか った .(なお , この条件 で,PV はG2細胞 で増殖 せず ,かつ吸着 して もHADを起 さ ない ことを確 めてあ る).
一方 ,この実験時 の未 吸着 NWS自身 のHA価 お よび感染価 (PFU/ml)を測定 した の が , Table 1 で あ る.吸着 (接種 )前,32HAU/mlお よび4.3×106
PFU/mlを示 したNWSは,3時 間吸着後 , HA 価 は2未満〜4HAU,感染価 は1.8‑2.1×104PFU を示 す未吸着 NWSとな り,各群細 胞 間 に 吸 着 の 有 意 な差 を見出 し得 なか った . 以 上 の Fig.1,Table
lの2っの結果 か ら.PV処理 また は共 存 は ,G2
細 胞 への NWS吸着 に殆 ん ど無影響 といえ る . こ の ことは,前報2)の結 論 を更 に正確 に再確 認 した こ と に な るであろ う.
Ⅰ.PV共存下の NWS増殖 の時間的経過 前報り2)以 来 NWS増殖増 強効果 のみ られ たPV処 理操作 の うち,上 述 の吸着 に無影 幣 で , しか も効果 が 最 も著 しか ったPV,存在下 (NWS接種後 の MM中 にPVを含 ませ る) とい う方法 を主 と して 用 い , 以 下 の実験 が行 われた .
まず .こ ゝでNWS接種 (感染 )後 の 早 期 も含 め て,PV存在下 にお けるNWSの増殖 を 時 間卵 に 観 察 した.そのため,NWSの細 胞内増殖 の反映 であ る 接種細胞 のHAD% と,培 養液中 へ の産生 NWS放 出量 を示す培 養液 のHA価 を測定 した . こ の 実 験 で は,NWSの moiを 1.0.0.1,0.01, 0.001の 4段 階 に変 えて.(NWS粒子 数/細 胞 )の割合 が異 な る感染 を行 った.370C3時 間吸着後,MM (PV(101)
119
に含 む もの と含 まない もの ゝ何 れか ) にか え .以 後 12時 間 まで は3時 間毎.12時 間以 降 は12時 間毎72時 間
まで観察 した .その結果 はFig.2に示 して あ る . moi‑1.0で は.細 胞 HAD%の推移 も,培 養 液 中 への産生 NWSのHA価 の推移 も.NWS吸着 以 降 24時 間 まで は.PVを加 え ない対照 の方 が む しろや ゝ 高 い値 を示 した .この理 由 は明 らかで な いが . 接 種 NWS自身 に関係 す る強 い自家干渉 (moiが 高 い程 強 い) とPV自身 に含 まれ る若干 の interferonの 相乗作用 が,NWS増殖早期 には .PVによ る増 殖 増 強効果 を上 回 るためか も しれない . しか しなが ら,36 時 間以 降 で は,HAD% もHA価 もPV存 在 下 の 方 が若干 高 くな り,従来観察 されて きたPV 効 果 を 示 す に至 った.
moiを0.1に下 げ ると,感染増殖細 胞数 を示 すHAD
% は.12時 間 まで は 両群 とも同 じで あ っ た が.24 時 間以 降 の PV存在 (添加 )群 は,対照 群 よ り常 に 高 い値 を示 し,著 しい差 が見出 された . これ はmoi‑
0.1の対顔群 において は,1段増殖 (約12時 間 )後 .約 36時 間 ,次 の2段増殖 (新 しい感染 成 立 ) が 抑 え ら れ,HAD%の増加 は極 めて鈍 いが,48時 間 目 に よ う や く再感染 によ る増殖 が始 ま り,HAD% の増加 も生 じたのに比 べ.PV添加群 で は ,それが既 に24時 間 目 にお きた ことを意 味 して い る.従 って,PV存 在下 で は,NWSの 1段増殖 が ,対照群 に比 べ約24時 間短 縮 され .結 果的 には以後 の増殖 が増 強 されて きた .
この傾 向 は,moiを更 に0.01,0.001に下 げて も全 く同様 で ,その短縮時 間 は各 々異 な るが,HAD %.
HA価 の差 は,更 に顕著 とな った .
こ ゝで ,対照 .PV添加 両群 と も.細 胞 HAD % が20‑30%以上 にな って ,あ る一定 時 間経過後始 めて 培 養液中 の HA価 が陽性 にな ることか らみ る と,PV
存在 が細 胞内増殖 NWSの細 胞外放 出 を特 に促 進 し
Table1. Assay ofNWS virusbeforeand afteradsorption on G2 cellspre･treated orco･existed with Polyoma virus
G2 cells beforeadsorption NWS viafruSteradso叩tion(3hrs.,36
℃) HAU./ml PFU/ml HAU/ml
PFU/ml untreated(control) 32 4.3×106
< 2 1.8×106
prldaye‑treatedwithPV(10‑1)for 32 4.3×1
06 < 2 2.1×106
inthepresenceofPV(1
て い るとは考 え難 か った .
Ⅲ.UV照 射半 不活 化 NWSの増殖 に及 ぼ す PV
の影響
この よ うに,moiが0.1の場 合,NWS増 殖 の 過 程 に second stageが出現 し.そ こで の増 殖 が PV 添 加 のない対照 群 で 遅 い こ と に つ い て は , 増 殖 の firststageに現 われ る ウイル スの中 に .不 活 化乃 至 不 完全粒子 が一 部 含 まれ . これ に よ る細 胞性 自家干渉 の結 果 で はないか と考 え られ た .既 に前 報2)で 述 べ た よ うに,UV完全不 活化 NWSで細 胞 を 前 処 理 す る と, 細 胞性 自家干渉 が生 じ. その後 で接 種 さ れ た NWSの増殖 は強 く抑制 され たが,PV を 共 存 させる と, この増殖 抑制 (自家干渉 ) は殆 ん ど回復 (減 少 ) され た .そ こで,NWSを人工的 に UVで 一 部 不 活 化 し,活性 と不活性 の mixtureウイル スと して の 増 殖 に.PVが如何 な る影轡 を与 え るか につ いて検討 を 加え た .
1. UV半不活化 NWSの moiとの関係 . 4.0×107PFU/mlの NWSを10‑30秒 UV照射 し て半不活化 し,(101‑10 6)に稀釈 し,moiを か え
てG2細 胞 に接種 感染 させ,PV存 在 の有 無 で , 感 染 4日後 にみ られ る細 胞 HAD%を 比 較 した. (Fig.
3)･その結 果 ,未照射 対照 (0秒 ) も含 め,UV照射 の何 れで も感染細 胞数 を示 す HAD% は .PV (10‑2) 添加 群 の方 が ,接種 NWSの稀釈 (moiの差 ) の 如 何 に抱 らず .常 に無 添加 群 よ り高 い価 を示 した . これ ら両群 の差 は ,接種 NWSの高稀釈 (低moi)で よ り 顕 著 に認 め られ た .一方 ,低 稀釈 (高moi)接種 の と ころで は ,よ り強 い 自家干渉 を受 けて い るため,PV によ るHAD%の増 強 ,即 ち増殖 増 強 (自家 干 渉 回 復 )効 果 は,低 moiに比 べ るとや ゝ少 なか った . 同 じく,よ り強 い 自家干渉 は,UV照 射 が長 くな る程 頗 著 にな り,従 って,UV鼎 射30秒 の NWSの (10‑1)
稀釈 (高 moi)接種 が ,出現 HAD%値 と して は最 も低 い値 (32%)を示 した . これ ら UV 半 不活 化 NWSの低 moi接種程,PV効 果 が 著 明 で あること は,Fig 2に示 した未照射 NWSの場 合 と極 め て 頬 似 して い るといえ よ う.
図示 は略 したが .感 染4日後 の培 養液 に産 生 されて くるNWSのHA価 の比較 で も.PV効 果 は Fig.3
Fig･2･ Effect of the presence of Polyoma virus on the kinetical multiplication of NWS in G2 ceus infected with a diffetent m.o.i.of NWS
ー3 0 12 24 36 48 6 0 72 / ･/ ･‑ ●/
卜 ●
I二 .' T ･ ‑ ‑･
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2 24 36 48
HOURSAFTERNU
B ADSORPTI O N
(○):maintained with MM alo
ne(control), (●):mZ巾Itained with MM containingP
V(10‑1),
):cellHAD%. ト ー一一一一′‑‑ ):HAU in culturemedia ∫Llq山t]J.1nV山〓コ
U N I LLLL
〇
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C C)
PolyomaviruS によるInnuenzavirusの増殖促進 〔II〕
と極 めて類似 したパ ター ンで認 め られた . ま た この Fig.3に示 した実験で ,感染4日後 の培養液 へ産生 さ れたNWSの感染価 を plaque assayで求 め た の がFig.4である.こ ゝで も.上記 HAD% (Fig.3)
や HA価 と全 く同様 の結果 が ,低 moiの と こ ろ で 更 に大 きな差 とな って得 られた.
2.接種 NWSの UV不活化度 (UV照 射 時 間 ) との関係
次 に,前 項 のmoiによる差 も考 慮 して ,4段 階 (102‑105)に稀釈 したNWSに,Fig.5の ご と く,10‑30秒 UV照射 を行 い,半不活度 と の 関 連 よ り.PV効果 を検討 した.その うち,比較的高 moi (0.1) と低 moi (0.001)の結果 のみをFig.5に示 した.
感染4日後 の感染細胞数 を示す HAD % (Fig.
5,1)は,何 れのmoiで もUV照 射 時 間 が 増 す につれ急激 に低下 し,NWS感染性 の不活化 がみ られ
121
た . しか し,この場合,PV添加群 は,不活化 の進 ん だ (UV照射 の長 い)NWSの何 れの moiに お い て ち,HAD%の10‑100倍 近 い回復 がみ られた .同 様 の 現 象 は,PV存在 または非存在 の感染4日目に培養 液 に産生 され る NWSの plaque assay (PFU測 定 )で も認 め られた(Fig.5,.2).この高 moi(0.1) 接種群 の 産 生 NWS の assayにおいて , 未 照 射
(0秒 ) NWSによる ウイルス産生量 が10秒照射 の も のよ り,PVの有無 に抱 らず ,低 い PFUとな った理 由 は明 らかでない.おそ らく,NWS中 に自家干渉 を よ り強 く起す不活化乃至不完全粒子 が多 か ったためで あ ろ うと考 え られ る.何 れにせ よ,この実験 において も前項 と全 く同一 の結論 ,即 ち半不活化 NWSに よ る自己干渉 のPVによ る 回 復 が ,NWSの高低 両 moiで.不活化 の進む程 (照射時 間の長 い程 ).よ り明 確 に示 された .
Fig.3. Effectof the presence ofPolyoma virus onHADofG2 cells infected with partially UV‑irradiatedNWSvirus.
CELL HAD%
〕〉 :20sec
:; :I :( 'ol ･
○
〕V〕V :30s: 10sec
ec.
5
0 10‑1･ 二‑2 ‑3 丁‑＼4 .‑5 ‑6 10‑1 ‑2
‑3 ‑4 ‑5 DILUTION OF UV‑IRRADIATED NuSーFOR
INFECTION NWS(beforeUV･irradiation):4.0×
107PFU/ml (○):controlcells
withoutPV, (●):cellsinfected inthepresence
ofPV(102)
CellHAD % was determined at4 days afterNWSinf
Ⅳ .NWS増殖増強をもたらす PVサ ン プ ル の 条 件 .
次 に,このよ うなPV処理 によるNWS増殖 増 強 が ,使用 サ ンプルの差で ,どの程度異 な るか検討 を加
･えた.同一 の PVサ ンプル(128HAU)を(10‑1‑105)
に稀釈 して (PV感染 moiを変えて), 種 々 の 条 件 で細胞 に与 え,NWS感染4日後 の感染 陽性細胞 数 を示 す HAD%をみた(Fig.6, 1).細胞 を1日前 処理 した場合 には (10‑1)稀釈で .維持液 に加 え た場 合 には(102)稀釈で最 も高 いNWS増 殖 増 強 を示 し.それぞれ (102), (103)稀 釈 ま で 有 効 で あ っ た.この効果 は,PV液 をUVで不活化 して も , ウ イルス粒子 の一部 をモルモ ッ ト赤 血 球 で 吸 着 して 除 き,HA価 を32HAUに低下 させて もは ゞ同 様 に残 存 していた.これ ら細胞処理法 に関 して は.前 報 2)で も一部ふれたが,HAD%測定 とい うよ り敏感 な方 法 で も.こ ゝに再確認で きた.
次 に4oCに1‑ 6年保存 のPVサ ンプル を 各 々 稀
釈 して維持液 に加 え ,前実験 と同 じく,生 ず るHAD
%で比較 した (Fig.6,2). これ ら各 サ ンプ ル の HA価 は.何 れ も作製直後 に比Ll/4に減少 して い た が,NWS増殖増強活性 は,6年保存 の もの を 除 き ,
1‑ 3年 間保存 で も充分残存 していた.これよ り,宿 性Eg子 は ウイルス粒子 自身 よ りも低温 でか な り安定 な もの と思 われ る.また,PV感 染 マ ウ ス胎 児 細 胞 を glycin bufferお よび borate bufferで室温30分 処理後抽 出 して得 たPVサ ンプル8)(か な り純粋 なPV 粒 子 と 考 え られ る)を用 いると. glycin buffer 抽 出 液 (8HAU)の (101)稀 釈 は活 性 を示 した が ,borate buffer抽 出液 (32HAU)に は , 活 性 が見出 されなか った.
V. NWS増殖増強活性のPV特異性 . 1.Poxvirusとの比較
このよ うなNWS増殖増強効果 が ,果 してPV 特 異的か ど うかについて .同様 のDNA 型 ウ イ ル ス : Cow pox virus(CPV)をPVと同 じ条件 で マ ウ ス
Fig.4. Effect of the presence ofPolyoma virus on NWS yield in culture media ofG2 cells infected with partially UV･irradiated NWS virus
NHS YIELD
PFU/ml(logl0)
PolyomaviruS によ る Innuenzavirusの増殖 促進 〔ⅠⅠ〕
胎児初代 培養 (ME)細 胞 に感染増殖 させ採 取 した も のについて比較 した .対照 には,同一 条件 の非感 染細 胞 の培養液(CMNE)を用 いた .
まず ,各 サ ンプルを第1次 重 層 medium 中 に . (103)に添加 した .鹿 添加 対照 のNW Sの ブ ラ ッ ク数 を100とす ると,従来用 いて きたPV (4B5‑
6)で は132‑139,新 たに用 いた PV (SE)で も126に 増加 がみ られた. しか し,CPVや CMNEを 加 え て ら,99‑103と全 く変化 はなか った (Table 2. 1).
一方,NWS接種後 .細 胞 の維持液 にPV ,CPV, cMN｡を (10‑3)に加 え . 4日培 養 し. そ の 培 養 液中 に産 生 されて くるNWSのPFU価 を み た の が (Table 2,2)であ る.同様 に,無 添 加 対 照 維 持 培養液 へ出現 す るNWSの PFUを100とす る と .PV (4B5‑6)で は178と増強 されて い るの に .CMNE
Fig.5. Effectof the presence of kineticalinactivation of
CELL HAD%
123 添加 で は79, CPV 添加 の時 は21と.逆 に
NW S 増殖 の抑制 (CPVによ るNWSの増殖干渉 )
が み ら れ た. これ らか ら,NWS増殖増強 は,PVに
特 有 の もの と考 え ら
2.PV中和 のれ る.
影背 .
そ こで次 に.このよ うな PVサ ンプル に特 有 と患 われ るNWS増殖増強能 が ,抗 PV血 清 で P
V 粒 子 を中和 した場合 ど うな るか につ いて検討 した
. これ は前 報2)ぉ よびFig.6,1)の実験 で,UV不 活
化 PV も有効 であ ることが示 されて , そのPVサ ン
プル の もつ活性 は,少 な くと も活性 PV粒子 自 身 で
は な さ そ うであ ることが予想 され たか らで あ る｡そ こで .
PV′ (256HAU)1容 に.1/10容 の非働化抗PV家 兎
免疫 血 清(20.480HAl unit/ml)を加 え,37oCl時
間 中 和 した(HA価 か らみ ると充分 中和 が成立 す る条
件 で あ Polyoma virus on the assay
of NWS by UV‑irradiati
NHSYI on
ELD
0 10 20 30 0 10
20
uv̲iRRADIAT IONT川 E(sec onds)OF NuSINFEC
1) cellHAD % at 4 days afte TED
r NWS infection 2) PFU ofNWS produced
る).その後,PV一抗 血清 浪 合液 中 の PVが (102) に な るよ うに重層 medium に加 え る とい う条 件 で . 中和 PVサ ンプルのNWS増殖 増 強活 性 を み た .対 照 には,PV (10‑2).また は抗 PV血清 (103) 蘇 加 重層 mediumを用 いた .
異 な るNWSサ ンプルを用 いて行 った3回 の 実 験 結 果 が･Table 3に示 されて い る.無 琴 加 の も の に 見 出 され るブ ラ ックを100とす る と,抗 PV血清 添 加 で87‑115(平均98),PV (10‑2) 添 加 で141‑170
(平均160),PV中和 サ ンプ ル添 加 で140‑153(平 均 148)とな り,PV粒子 中和後 もなお NWS増 殖 増 強 活性 は充分残存 す ることが確 認 され た . こ の 結 果 か
ら.PVサ ンプル中 の活性 因子 は,PV粒子 その も の よ りも,む しろPVが ME細 胞 に感 染 した ことに よ って生 じた細 胞側 のあ るproductで あ る ことが 強 く 示唆 され た .
Ⅵ.pVサ ンプ ルにおけ るNWS増 殖 増 強 能 の 差 異‑ME細 胞 の.PV感染 初期 と後期 サ ンプ ル の 比較 .
上 述 の ごと く,PVサ ンプ ル中 の NW S増 殖 増 強 活性 因子 は,PV特 有 で,PV粒 子 を中和 して も な お 残存 し,かつ Fig.6にみ られ る ごと く低 温 で す こ ぶ る安定 で あ った .従 って,PV粒子以 外 の PV感 染 ME細 胞 の by･productの可 能 性 が 考 え られ た の
Fig.6. Characteristics ofPolyoma virus required for the enhancement ofNWS virus multiplication.NWS (inoculum):m.o.i.‑0.01
CELL HAD%
l) METHODS OF TREAT卜TENT
●
CELL HAD%
9〔)
7〔
untreated control
10‑1 ‑2 ‑3 ′4 ‑5
㌔ ‑』ntreated control 2) COMPARISOH ArliCHG VARIOUS SAMPLES
∴ . ̲ ̲
10‑1 ‑2 ‑3
DIL〕TI ONOF PVSAMPLESFORCELLT REAT ト1E N T e t c.
1) various methods oftreatmentofG2 cells with PV samples (○):pretreatedwithPV(128HAU),for1day
(●):maintained with戸Ⅴ (128HAU)
(△):maintainedwithPVゝirradiatedbyUV(128HAU),
(A ):maintainedwithPV partiallyremovedbyadsorptiononGRC :32HAU) 2) ComparlSLon among various samples added to maintenancemedium (0):PV‑67(1.024HAU(at harvestedtime)‑‑‑‑256HAU (attesttime)). (● ):PV‑69(128HAU一一‑一一一32HAU),
(□):PV‑64(64HAU一･一‑I‑16HAU),
(△)‥PV extracted withglycinbuffer(8HAU), (▲):PV extracted withboratebuffer(32HAU)
CellHAD%wasmeasuredat4daysafterNWSinfection.
