クローニング DNA アッセンブリー & 合成生物学 be INSPIRED drive DISCOVERY stay GENUINE

(1)

DNA

アッセンブリー

_&

合成生物学

be INSPIRED

drive DISCOVERY

stay GENUINE

(2)

NEBuilder

®

HiFi DNA

アッセンブリー

NEBuilder®_{HiFi DNA Assembly Master Mix}_は_DNA_断片を₁_{ステップ反応で簡単}

に繋ぎ合わすことができるシステムです。末端に相同配列（15-40 bp）がある

DNA断片とマスターミックスを混合し、15-60分間インキュベーションするだ

けの1ステップ反応で複数のDNA断片をアッセンブルすることができます。

長鎖DNA、微量DNA、複数DNA断片を正確かつ高効率でアッセンブルする

ことが可能です。

2-fragment assembly ssOligo & dsDNA assembly

4-fragment assembly

15-bp overlap

High efficiency

25-bp overlap

Annealed-oligo assembly

Sticky end Blunt end

3´- and 5´-end mismatch assembly

Multiple sites Site-directed mutagenesis

NEBuilder

®

_{は様々なアッセンブルが可能}

シンプルなインサートとベクターのアッセンブル（2-fragment assembly）の他、複数インサートの一括アッセンブルや、1本鎖オリゴDNAのアッセンブルができる。また5′/3′末端のミスマッチはエキソヌクレアーゼで除去されるため、アッセンブル面とオーバーラップを揃える必要はなく、自由度が高いアッセンブルができる。さらに部位特異的変異導入も可能である。 15-40 bp のオーバーラップを有する DNA インサート（PCR 産物） 50℃、15-60 分間 形質転換直鎖状ベクター DNA 解析 OR OR コロニーPCR シーケンス制限反応 DNA NEBuilder® アッセンブル

+

1 ステップ反応 • エキソヌクレアーゼが 3’ オーバーハングを産生 • 3’ オーバーハングの相同配列がアニーリング • ポリメラーゼが 3’ 方向に DNA を伸長してギャップ修復 • DNA リガーゼがニックをシール • PCR 産物 • 制限酵素で切断した DNA • 合成 DNA （gBlock など） A B C アッセンブル産物 A B C 特長 • わずか15分間、1ステップ反応でDNA断片を簡単にアッセンブル • 1種類のマスターミックスでシンプルなアッセンブルから複雑なもの（12断片や20 kbなど）まで対応 • アッセンブル産物は精製不要、そのまま形質転換や PCRのテンプレートに使用可能 • アッセンブルだけではなく、部位特異的変異導入も可能 • 高効率、高正確なアッセンブルにより簡単にポジティブクローンを選別 • 5′/3′末端のミスマッチは除去されるため、すべての末端形状をアッセンブル • 1本鎖合成オリゴを使用した2本鎖DNAの架橋（リンカー挿入やgRNAライブラリーの調製） • コンピテント付属キットも提供

プライマー設計には

オンラインツールが便利です。

NEBuilder.neb.com

(3)

NEBuilder®_は_T_{社製品よりも} 多くのコロニーを獲得可能 T社製品に含まれるポジティブコントロール（線状pUC19ベクターと2 kbインサート）を使用してNEBuilder®_あるいは_T_{社製品でアッ} センブルと形質転換を行ったところ、 NEBuilder®_が₃_{倍以上のコロニーを生じた。} 各社推奨反応条件でアッセンブルを行い、反応溶液の2 µlを形質転換に用いた。コンピテントセルは各社製品に付属している株を用いた。形質転換した前培養の1/50量をアンピシリン選択培地にプレートした。 Co lon ie s f rom 1 /5 0 o f tr ansf o rm at ion o ut g ro w th 0 6,000 5,000 4,000 3,000 2,000 1,000 NEBuilder HiFi DNA Assembly T 社キット NEBuilder®_は₁_本鎖_DNA_{もアッセンブル可能} A：7種類のオリゴDNAと直鎖状pUCベクターを各社キットでアッセンブルしたところ、 NEBuilder®_{で多数のコロニーが得られた。オリゴ}_DNA_{はそれぞれオーバーラップする} ように設計されており、反応中にアニールしてニック、3′突出末端、5′突出末端を生じる。これらは反応中に修復、ベクターとアッセンブルして完全な環状DNAが作成される。

B：9種類のオリゴDNAと直鎖状pUCベクターをアッセンブルしたところ、NEBuilder®

で多数のコロニーが得られた。オリゴDNAはそれぞれオーバーラップするように設計されており、反応中にアニールしてニックと平滑末端を生じる。ニックは反応中に修復、ベクターとアッセンブルして完全な環状DNAが作成される。

オリゴDNAは前ページ、図2のAnnealed-oligo assemblyを参照。アッセンブル反応は各社推奨反応条件に従った。2 µlの反応溶液を使用してNEB®_{5-alpha Competent E. coli}

（製品番号C2987）に形質転換した。前培養の1/10量をアンピシリン選択培地にプレーティングした。

T 社キット NEBuilder

HiFi

A. 7 oligos & vector

C o lo ni es f ro m 1 /1 0 o f tr ansf o rm at ion o ut g ro w th C o lo ni es f ro m 1 /1 0 o f tr ansf o rm at ion o ut g ro w th 0 2,500 2,000 1,500 1,000 500 T 社キット NEBuilder HiFi

B. 9 oligos & vector

0 1,200 1,000 800 600 400 200

NEBuilder

®

_{HiFi DNA Assembly Master Mix}

• 2Xマスターミックス、コントロール用DNA付属 * アッセンブル効率を最大にする NEB コンピテントセルとの併用を推奨します。製品番号容量希望小売価格 E2621S 10 reactions ¥18,000 E2621L 50 reactions ¥72,000 E2621X 250 reactions ¥288,000

NEBuilder

®

_{HiFi DNA Assembly Cloning Kit}

• 2Xマスターミックス、NEB 5-alphaコンピテントセル、SOC培地、

コントロール用DNA付属

製品番号容量希望小売価格

E5520S 10 reactions ¥21,600

NEBuilder

®

_{HiFi DNA Assembly Bundle for Large Fragments}

• 15 kb以上のアッセンブル産物のクローニングに最適なキット

• 2Xマスターミックス、NEB 10-betaコンピテントセル、SOC培地、

コントロール用DNA付属

(4)

1996年に開発されたGolden Gate法は不要な配列を付加することなく、複数

のDNA断片を高効率でアッセンブルできる方法です。Type IIS制限酵素とT4

DNA Ligaseを使用して複数のDNA断片をベクターに挿入します。Type IIS制

限酵素が認識配列の外側を切断することを利用して、付着末端を自由に設定できます（下記図のNNNNの部分）。さらに4塩基突出末端をライゲーションに使用するために効率が高く、またアニーリングおよびライゲーションしたコンストラクト中には認識配列が残りません。TALEsやTALENsなどの複数の DNA断片のアッセンブリーに良く用いられていますが、1種類のインサートのクローニングも可能です。

Golden Gate

アッセンブリー

Type IIS

制限酵素

非対称配列を認識して、認識配列の外側を切断するType IIS 制限酵素のうち、

Golden Gate法では4塩基突出末端を生成するBsaI-HF®_v2_、_BbsI-HF®_、_Esp3I

が最適です。Golden GateキットにはBsaI-HF®_v2_{を使用しており、高い正確}

性と切断効率によって目的部位を正確に切断します。

DNA

リガーゼ

Golden Gate法ではライゲーションの正確性が鍵となります。NEBが提供する

高品質なT4 DNA LigaseはGolden Gate法に最適です。

Golden Gate

キットは

₂₄

断片でも

₁

反応でアッセンブル可能

Golden Gateキットで1-24個のDNA断片をベクターにアッセンブルしたところ、

獲得コロニーの>90%がポジティブクローンであったことを確認しています。 DNA 断片数（ベクター除く）アッセンブル反応条件* （括弧内はプレーティング量）プレートあたりのポジティブクローン数正確性（ポジティブクローンの割合）コロニー総数アッセンブル反応： 2 µl あたりアッセンブル反応：全量あたり** 1 5 min., 37℃（2.5 µl） 687 100% 274,200 2,742,000 1 60 min., 37℃（2.5 µl） 1,623 100% 649,200 6,492,000 12 （5 min., 37℃ → 5 min. 16℃）x 30（5 µl） 245 99.5% 48,900 489,000 24 （5 min., 37℃ → 5 min. 16℃） x 30（100 µl） 78 90.7% 783 9,792 * 反応後は 60℃で、5 分間のインキュベーションを実施（BsaI-HF®_{v2 による未反応ベクターの完全消化）} ** 反応容量は 20 µl（断片数が 1、12 の場合）、または 25 µl（断片数が 24 の場合） GGTCTCNNNNN CCAGAGNNNNN + Single-tube reaction • BsaI-HFv2 • DNA ligase

BsaI-HFv2-digested vector _{PCR-amplified fragments,}

BsaI-HFv2-digested Assembled DNA product Insert fragment A 5´ 3´ 3´ 5´ Destination vector Insert fragment B PCR amplification of fragments

+

+ P2 P1 A B

Can be used in complex (20+) fragment assemblies 3´ 5´ 5´ 3´ BsaI-HFv2 GGTCTCNNNNN CCAGAGNNNNN NNNNNGAGACC NNNNNCTCTGG 5´ 3´ 3´ 5´ P4 P3 GGTCTCNNNNN CCAGAGNNNNN NNNNNGAGACC NNNNNCTCTGG NNNN NGAGA CC NNNN NCTCT GG GGTCT_CNN NN_N CCAGA_GNN NN_N

Golden Gate法ではタイプIIS制限酵素を使用する。本図ではBsaI認識配列（GGTCTC）をdsDNA

の両末端に使用した例を示す。BsaI-HF®_v2_{で切断後、認識配列は残らずに相同の}₄_{塩基突出末} 端でアッセンブルされる。特長 • 1反応で20断片以上のアッセンブルが可能 • 不要な配列を付加しないシームレス・クローニング • リピート配列やGCリッチ配列もクローニング • 様々なサイズのDNAを連結（＜100 bpから＞15 kb） NEBツールウェブサイト（www.neb.com/GoldenGate）には下記情報が掲載 • プロトコールおよび参考文献 • チュートリアル動画 • プライマー設計ソフト（goldengate.neb.com） • ウェビナー（_{www.neb.com/NEBTVwebinars}）

NEB

®

_{Golden Gate Assembly Kit}

• 酵素ミックス（BsaI-HF®_v2_と_{T4 DNA Ligase}_を含む）

• 反応バッファー、destinationベクター付属製品番号容量希望小売価格 E1601S 20 reactions ¥21,750 E1601L 100 reactions ¥58,000

BsaI-HF

®

_v2

製品番号容量希望小売価格 R3733S 1,000 units ¥11,000 R3733L 5,000 units ¥44,000

BbsI-HF

® 製品番号容量希望小売価格 R3539S 300 units ¥12,000 R3539L 1,500 units ¥48,000

Esp3I

製品番号容量希望小売価格 R0734S 300 units ¥13,500 R0734L 1,500 units ¥60,000

T4 DNA Ligase

製品番号容量希望小売価格 M0202S 20,000 units ¥11,000 M0202L 100,000 units ¥44,000 M0202T* 20,000 units ¥11,000 M0202M* 100,000 units ¥44,000 * 高濃度品

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USER®_Enzyme_は_DNA_{中のウラシルを除去する酵素です。ウラシルを含むプ} ライマーで増幅したPCR産物をUSER®_Enzyme_処理して_6-10_{塩基の突出末} 端を作成することで、リガーゼを使用しないクローニングが可能となります。 1. ベクターとの相補的配列を含むプライマーを設計する。この際、相補的配列の3′側に1塩基のウラシルを挿入する（図中、最上段）。 2. インサートとベクターをそれぞれPCR増幅する（図中、中段）。 3. それぞれのPCR産物を混合して37℃でUSER®_Enzyme_{処理を行い、}₆_〜 10塩基の突出末端を作成する（図中、下段）。 4. 続いて25℃でアニーリングを行い、環状DNAを作成する（図中、最下段）。この際、環状DNAには2か所のニックが含まれるが、形質転換した大腸菌内で修復される。

USER

®

Enzyme

U A U A 5´ 3´ 3´ 5´ Primer Primer Target DNA U A A T U A A T 3´ 5´ 5´ 3´ A T A T 3´ 5´ 5´ 3´ PCR with dU-compatible DNA polymerase PCR with dU-compatible DNA polymerase USER®_or USER II USER or USER II Assembled DNA product A T T A T A A T T 5´ 3´ 5´ 3´ A T _A A T U A T A AU 3´ 5´ 3´5´ A A 5´ 3´ 3´ 5´ Primer Primer AT T A U U Prepared vector Linear vector Vector

USER

®

_Enzyme

_（

_{Thermolabile USER}

®

_{II Enzyme}

_{）を用いた}

DNA

アッセンブル

BioBrick®_{Assembly Kit}_は_BioBrick®_{と呼ばれる遺伝子パーツをベクターに組み}

込むための試薬キットです。BioBrick®_{パーツは簡単に他のパーツに置き換え} たり連結したりすることが可能です。

BioBrick

®

アッセンブリー

特長 • Ginkgo BioWorks™_{との協力の下で開発} • 新しい生物的機能の構築に使用

BioBrick

®

_{Assembly Kit}

製品番号容量希望小売価格 E0546S 50 reactions ¥55,000 特長 • 不要な配列を付加しないシームレス・クローニングおよび定方向性クローニング • 複数断片の一括クローニング • 37℃/25℃で反応、サーマルサイクラーは不要 • ＜100 bpの小さい断片や2本鎖オリゴDNAのアッセンブル

USER

®

_Enzyme

製品番号容量希望小売価格 M5505S 50 units ¥13,000 M5505L 250 units ¥52,000

Thermolabile USER

®

_{II Enzyme}

M5508S 50 units ¥17,500

(6)

Gibson®_Assembly_は_{J. Craig Venter Institute}_の_Gibson_{博士らによって開発され}

た方法であり、DNA断片のサイズや末端形状に関わらず、複数のDNA断片

を繋ぎ合せることができます。末端に15塩基の相同配列があるDNA断片と

Gibson®_{Assembly Master Mix}_{を混合し、}_15-60_{分間インキュベーションするだ}

けの１ステップ反応で複数のDNA断片を繋ぎ合せることが可能です。

Gibson

アッセンブリー

Gibson Assembly

®

_{Master Mix}

E2611L 50 reactions ¥72,000

Gibson Assembly

®

_{Cloning Kit}

• NEB®_5-alpha_{コンピテントセル付属} 製品番号容量希望小売価格 E5510S 10 reactions ¥21,600

PURExpress

®

In Vitro

タンパク質合成キット

様々な遺伝子について、反応溶液25 µl、250 ngのテンプレートDNA

を用いて37℃、2時間反応した（RNase Inhibitor, Murine（製品番号

M0314）20 units存在下）。各反応産物2.5 µlをSDS-PAGE（10-20%

Tris-glycineゲルを使用）後CBB染色した。図中の赤丸は合成されたタン

パク質のバンドを示す。レーンM：Unstained Protein Ladder, Broad Range

（10-250 kDa）（製品番号P7703）

PURExpress

®_{による無細胞タンパク質合成} kDa 100 — 80 — 60 — 50 — 40 — 30 — 25 — 20 — 15 — 10 —

M no DNA DHFR crp GFP Rluc ompA bglA T4L Fluc Vent β-gal

特長 • 2時間でタンパク質合成が完了 • 環状DNAと直鎖状DNA（PCR産物）をテンプレートに使用可能 • CBB染色で確認可能な合成レベル • カラムとレジンで合成因子を除去、タグなしタンパク質を精製

PURExpress

®

_{In Vitro Protein}

Synthesis Kit

E6800L 100 reactions ¥344,500

PURExpress

®

_{∆ Ribosome Kit}

PURExpress

®

_{∆ (aa, tRNA) Kit}

PURExpress

®

_{∆ RF123 Kit}

PURExpress

®

_{Disulfide Bond Enhancer}

PURExpress®_{In Vitro Protein Synthesis Kit}_{は短時間で遺伝子発現が可能な無細}

胞タンパク質合成キットです。大腸菌由来の転写/翻訳因子を個別に調製・精製したものを再構成した_{In vitro}転写/翻訳システムであり、含まれる酵素はすべてHisタグ融合酵素です。これらの酵素以外に精製70Sリボソーム、アミノ酸、rNTP、tRNAが含まれているが、エキソヌクレアーゼ、RNase、プロテアーゼなどのコンタミネーションを含まないため、テンプレートDNAや合成タンパク質が分解されることはほとんどなく、高い収量の合成が可能です。またタンパク質修飾因子も含まれていないため、合成タンパク質が翻訳後修飾されることはありません。

(7)

CRISPR/Casはゲノム編集に主流として使用されるツールです。わずか2つの材料、すなわちCasヌクレアーゼとガイドRNAだけを必要とするシンプルなツールです。生体内でCasヌクレアーゼとガイドRNAにより特異的に切断されたDNAは非相同性末端結合（NHEJ）か相同組換え（HDR）で修復され、この際、対象領域に相同性を持つドナーテンプレートを使用することにより、 HDRの過程で部位特異的変異が導入されます。一方、ドナーテンプレートを入れない場合、NHEJにより挿入あるいは欠失が導入され、その遺伝子座が欠損します。 NEBはCRISPR/Cas9ゲノム編集に必要な一連の試薬を提供しています。 sgRNA合成キット、Cas9タンパク質、ゲノム編集効率（変異）検証キットのラインナップです。

CRISPR/Cas

ゲノム編集

Cas9 Nuclease, S.pyogenes

（

A

）と

Lba Cas12a,

Lachnospiraceae bacterium N2006

（

B

）の認識配列と

DNA

切断

sgRNA Target DNA DNA 5´ 3´ Cas9 Nuclease, S. pyogenes 3´ GAGAACGGCGAAAACUA ACU 5´ 3´ GAGAACGGCGAAAACTA ACT PAM (NGG) CTCTTGCCGCTTTTGAT TGA AC C TGG Cleavage

A

Cas12a Nuclease, Lachnospiraceae bacterium N2006 gRNA Target DNA DNA 3´ 5´ 5´ 3´ 5´ PAM (TTTN) Cleavage GAGAAGUCAUCUAAUAAGGC CTCTTCAGTAGATTATTCCGGTGA TTTC AAAG GAGAAGTCATCTAATAAGGCCACT

B

EnGen

®

_{Cas9 NLS, S. pyogenes}

• in vivoゲノム編集のためのCas9ヌクレアーゼ

• in vitro実験にも使用可能

M0646T 400 pmol ¥18,600

M0646M 2,000 pmol ¥73,000

EnGen

®

_{Spy Cas9 Nickase}

• ターゲットDNAの片鎖のみ切断するCas9ニッカーゼ

• オフターゲット切断を低減

M0650S 70 pmol ¥8,000

M0650T 400 pmol ¥18,600

EnGen

®

_{Spy dCas9 (SNAP-tag}

®

₎

• 様々なアプリケーションに応用可能なDNA鎖切断活性欠損型Cas9タンパク質 • N末端のSNAP-tagに融合した基質や酵素をDNAにデリバリー可能製品番号容量希望小売価格 M0652S 70 pmol ¥10,800 M0652T 400 pmol ¥27,000

EnGen

®

_{Lba Cas12a (Cpf1)}

• ATリッチ、イントロン領域のゲノム編集に有用なCas12a ヌクレアーゼ • Cas9とは異なるPAM（TTTN）を認識 • 16〜48℃で活性を示す製品番号容量希望小売価格 M0653S 70 pmol ¥9,000 M0653T 2,000 pmol ¥31,200

EnGen

®

_{sgRNA Synthesis Kit, S. pyogenes}

• ゲノム編集用のsgRNA合成

• 1チューブ、わずか30分の反応でガイドRNAを合成

EnGen

®

_{Mutation Detection Kit}

• ゲノム編集効率（変異）を検証

• PCRとT7 Endonuclease Iの切断により効率を検証

(8)

ニュー・イングランド・バイオラボ・ジャパン株式会社

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