高齢化モデルラットにおける自発的クライミング運動と負荷スイミング運動による筋肉および骨減弱化抑制効果の比較-香川大学学術情報リポジトリ

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高齢化モデルラットにおける自発的クライミング運動と負荷スイミング運動による

筋肉および骨減弱化抑制効果の比較

長屋雄大，松尾達博＊

A COMPARISON OF THE RESTRICTIVE EFFECTS OF SARCOPENIA AND OSTEOPENIA

WITH VOLUNTARY CLIMBING OR FORCED SWIMMING ON AGING MODEL RATS

Yudai NAGAYA and Tatsuhiro MATSUO＊

Abstract

We studied the restrictive effects of sarcopenia and osteopenia with voluntary climbing (resistance training) or forced swimming (aerobic training) on rats given glucocorticoid-injections as model of aging. Forty-two male Wi-star rats of 5 weeks age were adapted voluntary climbing exercise for 4 weeks. At 9 weeks age, rats were divided into 5 groups. Four group of them were injected subcutaneously glucocorticoid (2 mg/kg). The other group was injected saline as a control (N). The N and one of the glucocorticoid-injected groups (GR) were sedentary, and the other groups were exercised (GC, GS, GCS) for 8 weeks. The GC and GCS groups were climbed, and the GS and GCS groups were forced swimming for an hour. The climbing groups were restricted sarcopenia and osteopenia by glucocorticoid-injected. The swimming groups were tended to inhibit loss of muscle and bone mass. However, swim-ming groups were decreased weight gain as compared with the other groups. In conclusion, we suggest that moderate resistance exercise would restrict sarcopenia and osteopenia by aging. While aerobic training could decrease body fat accumulation, restrictive effects of sarcopenia and osteopenia were a little.

Key words：resistance training, aerobic training, glucocorticoid.

１．緒言現在，わが国の65歳以上の高齢者人口は過去最高の 2560万人であり，総人口に占める割合は初めて20％を超えた．2050年には３人に１人が高齢者という社会の到来が見込まれている（１）_{．この状況下で，高齢化に伴う} 要介護者の増加は避けることのできない問題となっている．高齢者が要介護となる要因として，転倒・骨折が約 10％を占めている．その背景には，高齢化に伴う体タンパク質合成の低下により引き起こされる筋減弱症（サルコペニア）および骨減弱症（オステオペニア）が存在する（２）_{．これらを防ぐためには，十分なタンパク質を摂} 取するとともに適度な運動をすることが必要と考えられる（３）_．レジスタンストレーニングが，加齢によって低下した筋肉および骨タンパク質合成を刺激することや骨強度を増加させることは知られている（４）_{．軽レジスタン} ストレーニングである自発的クライミング運動が，グルココルチコイドを投与した高齢化モデルラットの骨減弱化を抑制することは，先行研究により明らかにされている（５）_{．その一方で，一般的に高齢者の運動として推奨} されている運動は，安全で負荷の小さいウォーキングやスイミングなどのエアロビックトレーニングである．しかし，エアロビックトレーニングが筋肉および骨減弱化を抑制するか否かを検討した研究は少ない．成長期ラットを用いたレジスタンストレーニングとエアロビックトレーニングによる骨に及ぼす影響の比較は行われている（６）_{が，高齢者あるいは高齢化モデル動物における両ト} レーニングによる筋肉および骨減弱化抑制効果の有無は不明である．本研究では，グルココルチコイドを投与した高齢化モデルラットに軽レジスタンストレーニングである自発的クライミング運動，あるいはエアロビックトレーニングである負荷スイミング運動，またはその両方を日常化させ，筋肉および骨減弱抑制効果の有無を比較・検討した．

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２．方法実験動物および飼育条件実験動物には，５週齢のWistar系雄ラット（日本SLC 株式会社）48匹を用いた．飼育室については，室温を25 ±１℃，湿度を50∼60％，12時間の明暗サイクル（明期，９:00∼21:00）に設定した．また，自由に飲水させた．飼育期間については，３日間の予備飼育期間後，適応期間４週間，本飼育期間８週間の12週間を実験期間とした．食餌については，全飼育期間中，粉末飼料（CE-2，日本クレア株式会社）を10:00∼22:00に，自由摂取させた．適応期間中，すべてのラットを１日おきに上部に飲水ビンを取り付けたクライミングケージに 22:00∼10:00まで入れ，自発的クライミング運動を適応させた．本飼育期間開始時にラットを５群に分けた．４群を高齢化モデルとして，毎日12:00にプレドニゾロンを体重１kgあたり２mg皮下投与した．残りの１群をコントロールとして，毎日12:00に生理食塩水を等量投与した．ラットの群分けは以下の通りである．①N群：生理食塩水投与＋安静（コントロール）②GR群：グルココルチコイド投与＋安静 ③GC群：グルココルチコイド投与＋クライミング運動 ④GS群：グルココルチコイド投与＋スイミング運動 ⑤GCS群：グルココルチコイド投与＋クライミング運動･スイミング運動併用．N 群とGR群は常時ステンレスケージで安静のままとした． GC群とGCS群には，毎日クライミング運動を22:00から開始させ，GCS群は９:00まで，GC群は10:00まで運動を継続した．GS群とGCS群には，毎日９:00∼10:00までの１時間，150Lの水（35℃）を張ったプールで錘による負荷スイミング運動を実施させた．スイミング運動の負荷量については，最初の２週間は負荷なし，その後２週ごとに体重あたり１％ずつ負荷を上げ，体重あたり２％の負荷に達した時点で増量を止めた．適応飼育期間中および本飼育期間中，体重および食餌摂取量を毎日測定した．飼育最終日，12時間絶食後に断頭屠殺し，血液を採取後，3000rpmで15分間遠心分離し，得られた血清を分析まで−20℃で保存した．また，各組織を摘出･秤量し， −80℃で保存した．屠体については，体組成分析まで− ４℃で保存した．骨格筋のタンパク質分析足底筋および前脛骨筋の粗タンパク質の定量には，ケルダール法を用いた．サンプルをケルダール分解フラスコへ入れ，分解促進剤（硫酸カリウム：硫酸銅＝9：1）2.0g と濃硫酸５mlを加えた．ケルダール分解装置（Tecater ™ Digestor Auto，フォス･ジャパン株式会社）で分解し，その後ケルダール分析装置（Kjeltic™ 2400，フォス･ジャパン株式会社）で粗タンパク質を測定した．骨強度分析大腿骨および脛骨の長さは，ノギスマイクロメーターを用いて測定した．破断強度分析には，デルタフォースゲージ（株式会社イマダ）を用いた．骨を折る土台を各群における平均骨長の80％に設定し，骨の中点の骨強度を測定した．骨カルシウム分析粉砕した大腿骨および脛骨の約0.1gを乾式灰化し，原子吸光法（Z-5000シリーズ偏光ゼーマン原子吸光分光光度計，株式会社日立製作所）を用いて，骨カルシウムを定量した．乾式灰化は以下のように実施した．精秤した粉末のサンプルを磁性るつぼに入れ，マッフル炉（MUFFLE FURNACE MODEL FP-41，ヤマト科学株式会社）を用いて，300℃で５時間炭化させ，さらに550℃で36時間加熱した．放冷後，濃硫酸を数滴加えて100℃で加熱し，塩酸を揮発させた．再度，550℃で５時間の加熱し，放冷後に５N塩酸を1.5ml加えて溶解させ，イオン交換水で 25mlに定容した．それを0.5mlとり，0.3N塩酸で10mlに定容し（200倍希釈），さらに1.0％塩化ランタン溶液で２倍希釈して測定に用いた．標準液には，カルシウム標準液(和光純薬工業株式会社)を0.3N塩酸で20ppmに希釈し，塩化ランタン溶液で２倍希釈したものを用いた．骨タンパク質分析粉砕した大腿骨および脛骨を精秤し，骨格筋タンパク質分析と同様に行った．統計分析すべての値を平均値±標準偏差で表した．クライミング運動とスイミング運動の効果の検定には，グルココルチコイドを投与した高齢化モデル４群間で二元分散分析を行った．また，各群間の差の検定にはFisherのPLSD法を用いて行った．いずれもp<0.05を有意差があるものと認めた．３．結果体重増加およびエネルギー摂取量（表１）最終体重は，生理食塩水投与群であるN群に比べてグルココルチコイド投与群であるG群すべてで有意に小さく，GR群およびクライミング運動のみを実施したGC群

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に比べてスイミング運動を実施したGS群およびGCS群で有意に小さかった．体重増加量，食餌効率ともに最終体重と同様の結果となった．平均摂取エネルギー量には，各群間で有意差を認めなかった．組織重量すべての組織重量において，N群とGR群との間で有意差を認めなかった．副睾丸脂肪組織，腎周囲脂肪組織および腸間膜脂肪組織の総和である腹腔内脂肪組織重量は，スイミング運動実施群で他の群に比べて有意に小さくなった（図１）．骨格筋重量について，グルココルチコイド投与群間で比較すると，腓腹筋重量はスイミング運動実施群に比べて他の群で有意に大きかった．ヒラメ筋重量は，GC群に比べて他の群で有意に小さかった．足底筋重量および前脛骨筋重量は，GR群に比べてGS群で有意に小さく，GC群に比べてGS群およびGCS群で有意に小さかった．長指伸筋重量は，GC群に比べてGS群で有意に小さかった（表２）．足底筋および前脛骨筋タンパク質組成（表３）足底筋タンパク質率および前脛骨筋タンパク質率には，N群とGR群との間で有意差を認めなかった．グルココルチコイド投与群間で比較すると，足底筋タンパク質率はGR群に比べてGC群およびGS群で有意に大きかった．前脛骨筋タンパク質率は，GR群に比べてGS群で有意に大きかった．

Table １ Final body mass, weight gain, food efﬁciency and energy intake of each group of rats

Final body mass Weight gain Diet efﬁciency Energy intake group (g) (g) (mg/kcal) (kcal/day)

N 267 ± 23a _{101 ± 11}a _{35.6 ± 4.4}a _{49.9 ± 6.2}b GR 250 ± 20ab _{84 ± 9}b _{28.9 ± 3.1}b _{50.7 ± 4.5}ab GC 248 ± 19b 82 ± 14b _{28.2 ± 4.3}b _{50.5 ± 4.1}ab GS 220 ± 15c _{55 ± 10}c _{17.4 ± 4.1}b _{55.2 ± 5.6}a GCS 222 ± 15c _{56 ± 8}c _{18.6 ± 2.3}c _{52.4 ± 4.5}ab

ANOVA Climbing (A) ns ns ns ns

Swimming (B) P<0.05 P<0.05 P<0.05 ns

A×B ns ns ns ns

Values are means ± SD for 8-9 rats.

Means with different supercripts within a column are signiﬁcantly different (P<0.05, ANOVA and Fisher s PLSD tests). N, saline-injected sedentary; GR, glucocorticoid-injected sedentary; GC, glucocorticoid-injected climbing exercise; GS, glucocorticoid-injected swimming exercise; GCS, glucocorticoid-injected climbing and swimming exercise. ns, not signiﬁcant.

Table ２ Hindlimb muscle weights in each group of rats

Gastrocnemius Soleus Plantaris EDL Tibiaslis anterior

group (g) (mg) (mg) (mg) (mg)

N 2.41 ± 0.10a _{166 ± 12}ab _{499 ± 29}a _{220 ± 11}ab _{884 ± 30}ab

GR 2.32 ± 0.25ab _{157 ± 18}bc _{461 ± 52}ab _{214 ± 19}ab _{855 ± 95}ab

GC 2.32 ± 0.23ab _{176 ± 16}a _{471 ± 37}a _{221 ± 19}a _{906 ± 52}a

GS 2.02 ± 0.14c _{149 ± 12}c _{410 ± 32}c _{194 ± 13}b _{786 ± 55}c

GCS 2.14 ± 0.28b _{158 ± 12}bc _{429 ± 52}bc _{207 ± 21}ab _{828 ± 86}bc

ANOVA Climbing (A) ns P<0.05 ns ns ns Swimming (B) P<0.05 P<0.05 P<0.05 P<0.05 P<0.05

A×B ns ns ns ns ns

Means with different supercripts within a column are signiﬁcantly different (P<0.05, ANOVA and Fisher s PLSD tests). N, saline-injected sedentary; GR, glucocorticoid-injected sedentary; GC, glucocorticoid-injected climbing exercise; GS, glucocorticoid-injected swimming exercise; GCS, glucocorticoid-injected climbing and swimming exercise. EDL, extensor digitorum longs

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骨パラメーター大腿骨乾燥重量および大腿骨の長さには，N群とGR 群との間で有意差を認めなかった．大腿骨破断強度は， N群に比べてGR群で有意に小さかった．グルココルチコイド投与群間で比較すると，大腿骨乾燥重量および大腿骨の長さは，GS群に比べてGC群で有意に大きかった．大腿骨破断強度は，GC群に比べてGCS群で有意に小さかった（表４）．脛骨乾燥重量，脛骨の長さおよび脛骨破断強度には， N群とGR群との間で有意差を認めなかった．グルココルチコイド投与群間で比較すると，脛骨乾燥重量に各群間の有意差はなかった．脛骨の長さは，GC群に比べて GS群およびGCS群で有意に小さかった．脛骨破断強度は，GR群に比べてGC群およびGS群で有意に大きかった（表５）．大腿骨カルシウム濃度および脛骨カルシウム濃度に Fig. 1 Intra-abdominal fat mass. Values are means ±

SD for 8-9 rats.Means with different supercripts within a column are signiﬁcantly different (P<0.05, ANOVA and Fisher s PLSD tests).N, saline-injected sedentary; GR, glucocorticoid-injected sedentary; GC, glucocorticoid-injected climbing exercise; GS, glucocorticoid-injected swimming exercise; GCS, glucocorticoid-injected climbing and swimming ex-ercise. ns, not signiﬁcant.

Table ３ Percentage of protein of plantaris and tibialis ante-rior muscles in each group of rats

Plantaris Tibialis anterior group (%) (%) N 24.9 ± 0.9ab _{24.3 ± 0.8}b GR 24.7 ± 0.5b _{24.3 ± 0.7}b GC 25.5 ± 0.5a _{24.8 ± 0.7}ab GS 25.3 ± 0.6a _{25.0 ± 0.7}a GCS 25.1 ± 0.4ab _{24.6 ± 0.7}ab

ANOVA Climbing (A) P<0.05 ns Swimming (B) ns ns A×B P<0.05 ns Values are means ± SD for 8-9 rats.

Means with different supercripts within a column are signiﬁcantly different (P<0.05, ANOVA and Fisher s PLSD tests).

N, saline-injected sedentary; GR, glucocorticoid-injected sedentary; GC, glucocorticoid-injected climbing exercise;

GS, glucocorticoid-injected swimming exercise;

GCS, glucocorticoid-injected climbing and swimming exercise. ns, not signiﬁcant.

Table ４ Femoral bone dry weight, length and mechanical parameter in each group of rats

Dry weight Length Maximum load group (mg) (cm) (N)

N 389.3 ± 32.3a _{3.33 ± 0.07}a _{103 ± 7.8}a

GR 381.3 ± 25.7ab _{3.29 ± 0.08}ab _{95 ± 8.5}bc

GC 394.4 ± 31.2a _{3.33 ± 0.09}a _{101 ± 7.1}ab

GS 352.9 ± 33.6b _{3.24 ± 0.08}b _{93 ± 9.4}bc

GCS 378.5 ± 23.4ab _{3.30 ± 0.06}ab _{92 ± 7.5}c

ANOVA Climbing (A) ns ns ns Swimming (B) P<0.05 ns ns

A×B ns ns ns

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は，N群とGR群との間で有意差を認めなかった．グルココルチコイド投与群間で比較すると，大腿骨カルシウム率は，GR群に比べてGC群およびGCS群で有意に小さく，GC群およびGS群に比べてGCS群で有意に小さかった．脛骨カルシウム率は，GR群に比べてGCS群で有意に大きかった（表６）．大腿骨タンパク質率は，N群に比べてGR群で有意に大きかった．脛骨タンパク質率に，N群とGR群との有意差は見られなかった．グルココルチコイド投与群間で比較すると，大腿骨タンパク質率は，GR群に比べてGS 群で有意に小さかった．脛骨タンパク質率は，GR群お

Table ５ Tibial bone dry weight, length and mechanical parameter in each group of rats

Dry weight Length Maximum load group (mg) (cm) (N) N 293.3 ± 25.1 3.79 ± 0.06a _{51.9 ± 6.9}b GR 277.8 ± 18.8 3.74 ± 0.08ab _{53.6 ± 4.0}b GC 295.2 ± 19.5 3.77 ± 0.07a _{60.4 ± 6.1}a GS 285.2 ± 19.8 3.68 ± 0.07b _{59.9 ± 5.4}a GCS 291.5 ± 21.9 3.70 ± 0.07b _{56.7 ± 7.2}ab

ANOVA Climbing (A) ns ns ns Swimming (B) ns P<0.05 ns

A×B ns ns P<0.05 Values are means ± SD for 8-9 rats.

Table ６ Percentage of bone calcium and protein in each group of rats

Femur Tibia

Carucium percent Protein percent Carucium percent Protein percent group (mg/g) (%) (mg/g) (%) N 343 ± 11a _{24.6 ± 0.7}b _{320 ± 15}ab _{23.4 ± 1.2}b GR 336 ± 10ab _{25.8 ± 0.7}a _{309 ± 14}b _{23.0 ± 0.6}b GC 322 ± 11c _{25.4 ± 1.3}ab _{311 ± 11}ab _{22.6 ± 1.1}b GS 328 ± 19bc _{24.4 ± 1.0}b _{312 ± 20}ab _{24.3 ± 0.8}a GCS 277 ± 10d _{25.0 ± 1.7}ab _{327 ± 21}a _{24.3 ± 0.5}a

ANOVA Climbing (A) P<0.05 ns ns ns Swimming (B) P<0.05 P<0.05 ns P<0.05

A×B P<0.05 ns ns ns

Means with different supercripts within a column are signiﬁcantly different (P<0.05, ANOVA and Fisher s PLSD tests). N, saline-injected sedentary; GR, glucocorticoid-injected sedentary; GC, glucocorticoid-injected climbing exercise; GS, glucocorticoid-injected swimming exercise; GCS, glucocorticoid-injected climbing and swimming exercise. ns, not signiﬁcant. よびGC群に比べてGS群およびGCS群で有意に大きかった（表６）． 4．考察グルココルチコイドにより，体重あたりの内臓組織重量が増加したが，体重増加量および骨格筋重量の減少は確認できなかった．このことは，食餌摂取方法が12時間自由摂食であったことから，摂取エネルギー量およびタンパク質量が多くなったためと考えられる．本研究で，スイミング運動を実施したGS群およびGCS群では，他の群に比べて有意な体重減少が生じた．GS群では，脂

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肪量および筋重量の減少が見られたが，GCS群では脂肪量が大きく減少し，筋重量の減少は小さかった．このことは，筋減弱化に対して自発的クライミング運動の効果が大きく，負荷スイミング運動の効果が小さいことを示している．一方，加齢とエアロビックトレーニングの関係を検討したKevinら（７）_{によれば，筋タンパク質合成は年齢に関} 係なくエアロビックトレーニングによって促進されることが立証されている．本研究においても，筋タンパク質率がGR群に比べてGS群で高くなっていたことから，負荷スイミング運動によってタンパク質合成が促進されていたことが考えられる．スイミング運動群でみられた有意な筋減弱化は，体重増加量の有意な減少が導いたものであり，エアロビックトレーニングによる筋減弱症予防効果がないとは言いきれない．本研究で得られた骨分析の結果では，脛骨において，クライミング運動だけでなくスイミング運動による骨減弱化抑制が見られた．しかし，大腿骨ではクライミング運動で骨減弱化を抑制する傾向が見られたが，スイミング運動による抑制は見られなかった．この結果は，本研究で実施したスイミング運動の運動負荷が脛骨に大きくかかっていたことを示している．このことは，Notomi ら（６）_{のエアロビックトレーニングによる骨に対する効} 果がなかった結果と異なるが，彼らの実験系が成長期ラットを用いていたことが本研究との差異の原因であると考えられる．これらのことから，骨減弱化抑制に負荷スイミング運動が有効である可能性も否定できない．一方で，クライミング運動とスイミング運動の両方を実施したラットの骨に減弱化抑制効果は見られなかった．過剰な強度の運動負荷が骨へ悪影響を及ぼすのかもしれない．以上より，レジスタンストレーニングが高齢化に伴う筋肉および骨減弱化抑制効果の大きい運動であることが再確認された．また，エアロビックトレーニングでは，大きな体脂肪蓄積抑制効果や心臓重量の増加も見られたことから，筋肉および骨減弱化抑制効果は小さいものの生活習慣病などの肥満に伴う疾病を防ぐことや循環器系機能を高めるということには効果的であると考えられる．５．引用文献 ⑴ 内閣府：高齢社会白書（平成18年度版），2006 ⑵ Dardevet D., Sornet C. M., Gizard J.：Stimulation of in

vitro rat muscle protein synthesis by leucine decrease with age. J. Nutr., 130, 2630-2635, 2000.

⑶ Phillip F. G., Bonnie H., D. R. Simpson, Roland R.：Ef-fect of a Mild Weight-Lifting Program on the Progress of Glucocorticoid-Induced Atrophy in Rat Hindlimb Muscles. Pﬂuger archi., 385, 147-153, 1980.

⑷ Vincent K., Braith R. W.：Resistance exercise and bone turnover in elderly men and women. Med. Sci. Sports.

Exerc., 34, 17-23, 2002.

⑸ Matsuo T., Nozaki T., Okamura K., Matsumoto K., Doi T., Gohtani S., Suzuki M.：Effects of Voluntary

Resis-tance Exercise and High-protein Snack on Bone Mass, Composition, and Strength in Rats Given Glucocorticoid Injections. Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 2518-2523, 2003.

⑹ Notomi T., Okazaki Y., Okimoto N., Saitoh S., Nakamura T., Suzuki M.：A comparison of resistance and aerobic training for mass, strength and turnover of bone in grow-ing rats Eur. J. Appl. Physiol., 83, 469-474, 2000. ⑺ Kevin R. S., Janet L. V., Maureen L. B., David N. P., K. S.

Nair：Age and aerobic exercise training effects on whole body and muscle protein metabolism. AJP-Endo., 286, 92-101, 2004. 要旨本研究の目的は，グルココルチコイド投与により作製した高齢化モデルラットについて，自発的クライミング運動（レジスタンストレーニング）あるいは負荷スイミング運動（エアロビックトレーニング）による筋肉および骨減弱化抑制効果を比較することである．５週齢のWistar系雄ラット42匹に自発的クライミング運動を４週間適応させた後，ラットを５群に分けた．そのうちの４群を高齢化モデル群としてグルココルチコイド（２ mg/kg体重）を毎日皮下投与し，残りを対照群（N）として生理食塩水を同量投与し，８週間飼育した．飼育期間中，N群および高齢化モデル群の１つ（GR）を非運動群，残りを運動群として以下の運動を日常化させた（GC，GS，GCS）．GCおよびGCS群には適応期間と同様の自発的クライミング運動，GSおよびGCS群には１時間の負荷スイミング運動を実施させた．その結果，自発的クライミング運動は，グルココルチコイドによる

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筋肉および骨減弱化を有意に抑制した．また，スイミング運動により，筋肉および骨減弱化が抑制される傾向もみられた．しかし，スイミング運動群の体重増加量は他の群と比べて有意に小さかった．以上より，高齢化に伴う筋肉および骨減弱化の抑制には，適度なレジスタンストレーニングが効果的であることが明らかとなった．一方，エアロビックトレーニングには大きな体脂肪蓄積抑制効果は期待できるが，筋肉および骨減弱化抑制効果はレジスタンストレーニングに比べて小さいことが示唆された．（2008年10月31日受理）