GeneMapper. Software Version 4.0 AFLP. System Analysis Getting Started Guide (PN )

(1)

GeneMapper

®

ソフトウェア

v4.0

AFLP

®

解析

Getting Started Guide

ご使用になる前に

解析のセットアップ

データの解析と検証

解析済みデータの エクスポートと印刷

(2)

(3)

GeneMapper

®

ソフトウェア

v4.0

AFLP

®

解析

Getting Started Guide

ご使用になる前に

解析のセットアップ

データの解析と検証

解析済みデータの エクスポートと印刷

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Copyright

研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続き上での使用はできません。

このマニュアルに記載されている情報は予告なく変更されることがあります。Applied Biosystems は、このマニュアルのあらゆる誤謬に対して、一切の責任を負わないものとします。本マニュアルの情報は、発行の時点においては、完全かつ正確であるものとみなします。Applied Biosystems は、本マニュアルと関連、もしくは本マニュアルから生じる、偶発的、特別、複合的、派生的損害に対して、いかなる場合も責任を負わないものとします。ご購入者への告知: ライセンス拒否本ソフトウェアの製品のみの購入では、明示されているか否かに関わらず、または禁半言によるか否かに関わらず、Applera Corporation が所有または管理する特許権利に基づくあらゆるプロセス、機器またはその他の装置、システム、混合物、試薬、キットの権利のいかなる権利（ライセンス）の所有も意味しません。 GeneMapper ソフトウェアは、HID（ヒト個人識別）アプリケーションについて特定の検認を受けていません。単一ソースまたは親子サンプルを解析するためのデータ解析に GeneMapper ソフトウェアを使用する HID（ヒト個人識別）研究施設や機関は、開発検認研究を独自に実行する必要があります。 AFLP プロセスに関する特許は Keygene N.V 社が保有しています。商標:

ABI PRISM、Applied Biosystems、GeneMapper、SNaPshot は、登録商標です。AB Design、Applera、FAM、GeneScan、ROX、SNPlex は、米国およびその他の国々おける Applera Corporation またはその子会社の商標です。

AFLP は、Keygene N.V の登録商標です。

本ソフトウェアには、ExoLab Project (http://www. exolab.org/) が開発したソフトウェアが含まれています。Copyright 2000 © Intalio Inc. All rights reserved. JNIRegistry is Copyright © 1997 Timothy Gerard Endres, ICE Engineering, Inc., http://www.trustice.com.

Windows は、Microsoft Corporation の登録商標です。

Oracle は、Oracle Corporation の登録商標です。

その他すべての商標は、それぞれの会社に所有権があります。

Applera Corporation is committed to providing the world’s leading technology and information for life scientists. Applera Corporation consists of the Applied Biosystems and Celera Genomics businesses.

Part Number 4363079 Rev. B 06/2005

(5)

_iii

まえがき

v

このガイドの使い方 . . . v 詳細情報の入手方法 . . . .vi サポートの入手方法 . . . vii

第

1 章

ご使用になる前に

1

サポートされる AFLP 試薬ケミストリについて . . . 2 データ例について . . . 5 AFLP システム解析のワークフロー . . . 6 GeneMapper ソフトウェアの用語 . . . 7 ソフトウェアの起動とログイン . . . 7 ユーザ独自のサンプルファイルを使う場合のこのガイドの使用 . . . 7 GeneMapper ソフトウェア v3.7 を使う場合のこのガイドの使用 . . . 7 このガイドにおける手順のその他の方法 . . . 8

第

2 章

解析のセットアップ

9

概要 . . . 10 プロジェクトの作成 . . . 10 プロジェクトへのサンプルの追加 . . . 11 Analysis Method の作成 . . . 12 「Allele」タブ設定項目の設定 . . . 12 「Peak Detector」タブ設定項目の設定 . . . 17 「Peak Quality」タブ設定項目の設定 . . . 18 「Quality Flags」タブ設定項目の設定 . . . 19 アナリシスパラメータの適用 . . . 21

第

3 章

データの解析と検証

23

概要 . . . 24 プロジェクトの解析 . . . 25 オフスケールデータの検証 . . . 27 Size Quality データの検証 . . . 29 サイジングの解決策 #1: Analysis Method の調整 . . . 30 サイジングの解決策 #2: 誤って読み取られたピークの手動による修正 . . . 32 サイジングの解決策 #3: サイズスタンダード定義の変更 . . . 34 解析済みデータの検証 . . . 38

(6)

目次 Genotypes テーブルでの解析済みデータの閲覧 . . . 38 Samples Plot 内でのピークデータの表示 . . . 39 サイズスタンダードの検証 . . . 42 多型ピークの視覚化 . . . 44 結果の編集 . . . 46 Marker の変更 . . . 46 Bin の変更 . . . 47 ジェノタイプ読み取りの変更 . . . 48

作成した Panel と Bin Set の保存 . . . 51

解析の完了 . . . 55

第

4 章

解析済みデータのエクスポートと印刷

57

概要 . . . 58 結果とオブジェクトのエクスポート . . . 59 「Samples」タブと「Genotypes」タブのエクスポート . . . 60 プロットと図のエクスポート . . . 60 スプレッドシートで使用するためのデータのエクスポート . . . 61 プロジェクトとリファレンスデータのエクスポート . . . 63 プロジェクトデータの印刷 . . . 64

索引

65

(7)

_v

まえがき

このガイドの使い方

このマニュアルの

目的

このガイドでは、GeneMapper®_{ソフトウェアで提供される}_AFLP®_{(Amplified Fragment}

Length Polymorphisms) データを解析する方法について説明します。ソフトウェアを使用して、AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) のバンドパターンをサイジング、ジェノタイピング、波形表示方法を短時間で理解できるよう設計されています。また、演習を通じて、基本的なトラブルシューティング技術に加え、解析済みデータをエクスポートしてさらに解析または表示する方法について説明しています。

対象読者

このガイドは、トレーニングを受けた研究員を対象読者としています。許可されていない、またはトレーニングを受けていない人がこのガイドを使用したことに起因する損害または傷害に対して、Applied Biosystems は責任を負いません。

前提条件

このマニュアルは、対象読者が次の条件を満たしていることを前提としています。

• 『GeneMapper®_{Software Version 4.0 Installation and Administration Guide}_』

(PN 4363080) の説明に従って、GeneMapper®_{ソフトウェア}_v4.0_{がインストールされて} いること。 • Microsoft®_Winows®_{オペレーティング}_{システムに関する実践的な知識を備えていること。}

表記法

このマニュアルでは、次の表記法を使用しています。 • 太字は、ユーザの行う操作を示します。たとえば、次のとおりです。残りの各フィールドについて、0 を入力し、[Enter] キーを押します。 • ゴシック体は、初出または重要な語を示し、強調しています。たとえば、次のとおりです。解析の前に、必ず新しいマトリックスを調製してください。 • 右三角カッコ () は、ドロップダウンメニューまたはショートカットメニューで連続して選択するコマンドを区切って示しています。たとえば、次のとおりです。

「File」「Open」「Spot Set」を選択します。

サンプル列を右クリックし、「View Filter」「View All」を選択します。

ユーザへの注意事項

Applied Biosystems のユーザマニュアルには、2 種類の注意事項が記載されています。各注意事項は、次のような特定のレベルの注意と対応が必要なことを示しています。

注：製品を使用する上で役に立ちますが、必須ではない情報を記述しています。

重要！装置の適切な操作、ケミストリキットの正しい使用法、化学物質の安全な使用法に関

(8)

まえがき詳細情報の入手方法ユーザへの注意事項の例を次に示します。注：カラムのサイズは、ランタイムに影響します。注：キャリブレーション機能は、Control Console でも使用できます。重要！クライアントがデータベースに接続していることを確認するには、有効な Oracle ユーザ ID とパスワードが必要です。重要！ 1 枚の 96 ウェルプレートに対して、それぞれ 1 つの Sample Entry スプレッドシートを作成する必要があります。

詳細情報の入手方法

安全に関する情報

安全に関する情報の詳細については、『GeneMapper®_{Software Version4.0 Installation and}

Administration Guide』(PN 4363080) を参照してください。

ソフトウェアの保証

とライセンス

保証とライセンスに関する情報の詳細については、『GeneMapper® Software Version 4.0 Installation and Administration Guide』(PN 4363080) を参照してください。

_vii

連絡先

Applied Biosystems では、ユーザマニュアルをより使いやすいものにするため、お客様からのご意見、ご要望をお待ちしております。次の電子メールアドレス宛にお送りください。 jptechsupport@appliedbiosystems.com

オンライン

ヘルプ

からの情報の入手

GeneMapper®_{ソフトウェアは、ユーザ}_{インタフェースの各機能を使用する方法について説明} したオンラインヘルプシステムを備えています。オンラインヘルプにアクセスするには、任意のウィンドウまたはダイアログボックスでをクリックします（使用可能な場合は

「Help」「Contents and Index」）。

サポートの入手方法

すべての地域における最新サービスおよびサポート情報を入手するには、

http://www.appliedbiosystems.co.jp にアクセスし、「Customer Support」のリンクをクリックしてください。

「カスタマーサポート」ページでは、次のことが可能です。

• よくある質問（FAQ）を検索する

• テクニカルサポートに質問を直接送信する

• Applied Biosystems ユーザマニュアル、MSDS、分析証明書（Certification of Analysis）、およびその他の関連資料を注文する • PDF 文書をダウンロードする • カスタマートレーニングに関する情報を入手する • ソフトウェアアップデートおよびパッチをダウンロードするさらに、「テクニカルサポート」ページには、世界各地の Applied Biosystems テクニカルサービスおよびサポート機関の連絡先の電話番号やファックス番号も掲載されています。

(10)

まえがき

(11)

第

1 章

第 1 章 ご使用になる前に第 4 章解析済みデータのエクスポートと印刷第 2 章解析のセットアップ第 3 章データの解析と検証

₁

ご使用になる前に

この章では、次の項目について説明します。 ■ サポートされる AFLP 試薬ケミストリについて. . . 2 ■ データ例について. . . 5 ■ AFLP システム解析のワークフロー . . . 6 ■ GeneMapper ソフトウェアの用語. . . 7 ■ ソフトウェアの起動とログイン. . . 7 ■ ユーザ独自のサンプルファイルを使う場合のこのガイドの使用. . . 7 ■ GeneMapper ソフトウェア v3.7 を使う場合のこのガイドの使用 . . . 7 ■ このガイドにおける手順のその他の方法. . . 8

(12)

第1章ご使用になる前に

サポートされる AFLP 試薬ケミストリについて

サポートされる

AFLP

試薬ケミストリについて

AFLP

システムに

ついて

AFLP®_{(Amplified Fragment Length Polymorphism)}_{は、ゲノム}_DNA_{の多型（ポリモルフィ}

ズム）の客観的判定に使用されるマッピング技術です。AFLP システムは、よく知られている

RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism; 制限酵素断片長多型）技術と、PCR

（Polymerase Chain Reaction; ポリメラーゼ連鎖反応）を組み合わせることにより、調製されたゲノム DNA から制限酵素フラグメントを選択的増幅するものです。サンプルを電気泳動で分離すると、独自のバンドパターンが生じます。このパターンを、サザンブロット法や蛍光色素標識のフラグメント解析によって波形として表示され、高解像度のジェノタイピング、多型検出、分岐学に利用することができます。‡ このガイドのワークフローを適用可能なアプリケーション AFLP システムは柔軟かつ堅牢であるため、科学技術的手法の多くのアプリケーションをサポートします。このガイドでは、サンプル/系統の同定、およびバッククロス解析によるマッピングという最も一般的な 2 つのアプリケーションを紹介し、一般的な解析ワークフローを記載しています。手順では、サンプルの同定解析を中心にしていますが、その多くは、他のアプリケーションにも適用可能です。

互換性のある

AFLP

解析

GeneMapper ソフトウェアでは、次のようなサンプルを解析することができます。

• Applied Biosystems の蛍光色素標識および検出技術が組み込まれた AFLP ケミストリを使用して調製されたサンプル

• 互換性のある Applied Biosystems 社製シーケンサでランされたサンプル

Applied Biosystems は、AFLP 技術に手を加えて、蛍光色素標識して検出できるよう、適合さ

せています。変更後のシステムでは、増幅の最終手順で使用されるセレクティブプライマー

の 1 つを、5′蛍光色素標識プライマーに置き換えます。次の節では、Applied Biosystems ケミストリについて説明します。

テンプレートの調製とアダプタのライゲーション

単離されたゲノム DNA は、2 つの制限酵素（例中の EcoRI と MseI）で消化され、制限酵素フラグメントを生成します。次に、このサンプルに、消化されたフラグメントの末端を補完す

るシーケンスを含む 2 本鎖のオリゴヌクレオチドアダプタをライゲーションします（図 1-1

を参照）。

図1-1 テンプレートの調製とアダプタのライゲーションの例

‡Savelkoul, P. H. M., Aarts, H. J. M., de Haas, J., Dijkshoorn, L., Duim, B., Otsen, M., Rademaker, J. L. W., Schouls, L., and Lenstra, J. A., J Clin Microbio, 1999, 37(10), 3083–3091.

(13)

サポートされる AFLP 試薬ケミストリについて

₃

Preselective Amplification（オプション）

ライゲーションに続いて、フォワードおよびリバースプライマーのセットを使用して、アダプタと制限酵素サイトのシーケンスを組合せたフラグメントを増幅します。この Preselective PCR の一次産物は、両方の末端でアダプタをライゲーションした制限酵素フラグメントから生成された産物です（図1-2を参照）。図1-2 プレ増幅

Selective Amplification

Preselective Amplification の次に、数種類の「セレクティブ」プライマー（5′蛍光色素色で標識したプライマーを含む）を使用してフラグメントを再び増幅します。図1-3は、EcoRI および MseI 制限酵素で消化されたフラグメントの Selective Amplification を図解して示しています。PCR の一次産物は、EcoRI/MseI で末端したフラグメントから作成されたものです。この

ように、セレクティブプライマーを組み合わせることで、サンプルのバンドパターンがより

単純になります。

注：ランの際、互換性のある Applied Biosystems 社製のシーケンサは、EcoRI で処理したフ

ラグメントの産物のみを検出します。MseI-MseI フラグメントは、蛍光標識されていないた

め、波形として検出されません。

(14)

第1章ご使用になる前にサポートされる AFLP 試薬ケミストリについて電気泳動と Data Collection 増幅したサンプルにサイズスタンダードを追加すると、これらは、互換性のある Applied Biosystems 社製のシーケンサにロードされ、電気泳動分離および蛍光検出が行われます。電気泳動中に、装置は、フラグメントがレーザー光線を通過して移動する際に出す光の変動を検出することで、ポリマー中の 5′蛍光色素標識フラグメントをモニタリングします。完了後、装置は、各サンプルに対するスペクトルデータを組み合わせて（図1-4を参照）、サンプルファイルとして保存するか、アプリケーションデータベースに保存します。図1-4 このガイドで提供されるサンプルファイルのシグナルデータ（エレクトロフェログラム）（5 ページの「データ例について」を参照）

互換性のある装置

互換性のあるApplied Biosystems 社製のシーケンサおよびケミストリのリストは、

『GeneMapper®_{Software Version4.0 Quick Reference Guide}_』_{(PN 4362816)}_{を参照してくだ}

さい。

使用可能な

AFLP

ケミストリ

キット

GeneMapper ソフトウェアは、数種類の AFLP フラグメント解析ケミストリキットを使用して作成されたデータを解析できます。Applied Biosystems から入手可能な AFLP ケミストリキットの完全なリストは、Applied Biosystems の Web サイト(www.appliedbiosystems.co.jp)

(15)

データ例について

₅

データ例について

サンプル

ファイル

の場所と機能

このガイドでは、AFLP 実験におけるデータセット例の解析を段階的に示すことで、AFLP サンプルデータの解析方法を説明します。このガイドの演習で参照されるサンプルファイル例は、GeneMapper ソフトウェアと共に自動的にインストールされ、次の場所に配置されます。

<drive>:\AppliedBiosystems\GeneMapper\Example Data\AFLP Data

注：上記の場所は、ソフトウェアがインストールされているドライブによって異なります。

実験について

GeneMapper ソフトウェアで提供される AFLP サンプルファイル例は、サンプル同定演習の

一環として作成されています。サンプルは、5′ FAM™_{標識セレクティブ}_{プライマーを含む}

Applied Biosystems AFLP® Plat Mapping Kit を使用して調製されています。サンプルは、

Applied Biosystems が提供する GeneScan™_{-500 (ROX}™₎_サイズ_{スタンダードを使用して、}

Applied Biosystems 3100 ジェネティックアナライザでランされています。

Panel

と

Bin Set

の例

AFLP データセット例の解析に使用される Panel と Bin Set は、GeneMapper ソフトウェアで自動的に作成されます。詳細については、14 ページの「Automatic Panel Generation」を参照してください。

(16)

第1章ご使用になる前に AFLP システム解析のワークフロー

AFLP

システム解析のワークフロー

解析ワークフロー

図 1-5は、AFLP サンプルで同時に示されるバンドパターンを研究するためのプロセスを要約したものです。図1-5 AFLP システムデータの解析第 2 章 AFLP 解析の設定 1. プロジェクト用の Panel を作成します。 2. 新規プロジェクトを作成し、サンプルを追加します。 3.「Samples」タブで、アナリシスパラメータを設定します。 4. Table Settings を設定します。 5. 基準となるサンプルデータの解析を実行します。 6. BinSetを作成し、Binを作成します。第 3 章データの解析と検証 1. プロジェクトを解析します。 2. 結果を検証します。第 4 章結果の印刷とエクスポート（オプション）必要に応じて実行します。 • 目的のビュー、プロット、テーブルを印刷またはエクスポートして、レポートや発表に使用します。 • サードパーティ製ソフトウェアを使ってさらに解析できるよう、目的のビュー、プロット、テーブルをエクスポートします。

(17)

第1章ご使用になる前に GeneMapper ソフトウェアの用語

₇

GeneMapper

ソフトウェアの用語

ソフトウェアの起動とログイン

GeneMapper

ソフ

トウェアの起動

1. デスクトップで、 GeneMapper v4.0 をダブルクリックします（「Start」

「Programs」「Applied Biosystems」「GeneMapper」「 GeneMapper v4.0」）。

2.「Login to GeneMapper」ダイアログボックスで User Name と Password にシステム管理者によって割り当てられたユーザ名とパスワードを入力します。 3.「OK」をクリックします。

ユーザ独自のサンプル

ファイルを使う場合のこのガイドの使用

このガイドを使用して、ソフトウェアで供給されるデータ例を解析するだけでなく、ユーザ独自のサンプルファイルを解析する際に、一般的な AFLP 解析のワークフロー全体を実行することができます。ソフトウェアの高度な機能に関する詳細については、GeneMapper®_Sofware Online Help を参照してください。

GeneMapper

ソフトウェア

v3.7

を使う場合のこのガイド

の使用

このガイドに記載されているワークフローおよび手順は、GeneMapper ソフトウェア v3.7 でも有効です。重要！ GeneMapper ソフトウェア v3.7 には、このガイドの演習で使用する正確なデータ例が含まれていません。このため、GeneMapper ソフトウェア v3.7 を使用する場合、参照されるデータ例の解析に、このガイドを使用しないでください。ただし、独自のサンプルファイルを解析する際の AFLP 解析ワークフローに、このガイドを使用することは可能です。表1-1 このガイドで使用される一般的用語用語定義アナリシスパラメータユーザが定義する設定の集合（Analysis Method など）。プロジェクトに含まれるすべてのサンプルを解析するために GeneMapper ソフトウェアで使用されるサイジングアルゴリズムとジェノタイピングアルゴリズムを決定します。 Bin/ビンアレルを定義するためのフラグメントサイズと蛍光色素の色。Bin は、通常、Marker と関連付けられる可能性のある各アレルに対して作成します。

Bin Set/ビンセット Bin の集合（すなわちアレル定義)。通常は、一連の実験条件に対して固有です。

Kit/キット Panel のグループ。

Marker / マーカ 2 つ以上のアレル形態を有する既知の DNA セグメント。Marker は既知の染色体の遺伝子座に存在し、遺伝子と非遺伝子があります。Marker は、名前、フラグメントサイズレンジ（bp）、蛍光色素、反復長によって定義されます。 AFLP 解析の場合は、各セレクティブプライマーに対する名前、蛍光色素、解析対象のフラグメントサイズレンジ（bp）を定義します。

Panel/パネル Marker のグループ。通常は、一連の実験条件に対して固有です。

(18)

第1章ご使用になる前にこのガイドにおける手順のその他の方法

このガイドにおける手順のその他の方法

概要

このガイドでは、GeneMapper ソフトウェアを使用して AFLP データを解析できるいくつかの解決策を記載しています。このガイドの演習を完了後、ご自身の研究室の要件に特化してプロセスをカスタマイズする場合に備え、この節では、いくつかの代替方法の要約と詳細情報の参照先を提供します。

自動解析を使用した

プロジェクトの設定

GeneMapper ソフトウェアには自動解析機能が備わっており、これを利用すれば AFLP 解析プロジェクトに関連するタスクの大部分を排除できます。第 2 章「解析のセットアップ」の大部分は、プロジェクトを手動で作成し、サンプルを追加し、解析する方法の説明です。自動解析を設定すると、GeneMapper ソフトウェアは、Data Collection ソフトウェアと連携して、

自動的に該当のタスクを実行します。自動解析機能を使用して AFLP プロジェクトを設定す

る方法の詳細については、『GeneMapper® Software Version 4.0 Installation and Administration Guide』(PN 4363080) を参照してください。

コマンド

ライン

イ

ンタフェースを使用

したプロジェクトの

設定

GeneMapper ソフトウェアでは、コマンドラインインタフェースを介して、ソフトウェアの主要機能を大部分実行することができます。コマンドラインインタフェースは、第2章「解析のセットアップ」で説明されている多くのタスクを自動化できるため、AFLP プロジェクトを解析する際非常に便利なツールです。コマンドラインインタフェース、およびこれを使用して GeneMapper ソフトウェアの機能を自動化する方法の詳細については、『GeneMapper®

(19)

第

2 章

第 2 章 解析のセットアップ第 4 章解析済みデータのエクスポートと印刷第 3 章データの解析と検証第 1 章ご使用になる前に

₉

解析のセットアップ

この章では、次の項目について説明します。 ■ 概要. . . 10 ■ プロジェクトの作成. . . 10 ■ プロジェクトへのサンプルの追加 . . . 11 ■ Analysis Method の作成. . . 12 ■ アナリシスパラメータの適用 . . . 21

(20)

第2章解析のセットアップ概要

概要

章の構成

この章では、次の項目について説明します。 • プロジェクトの作成 • サンプルファイルからプロジェクトへのサンプルの追加 • Analysis Method の作成と、解析のためのカスタマイズ • 解析の準備におけるプロジェクト用アナリシスパラメータの設定

詳細情報

この章では、AFLP ®システムのデータセットの解析に関するソフトウェア機能の一部を説明します。ユーザインタフェースの全機能に関する詳細については、GeneMapper®_Sofware

Online Help を参照してください。オンラインヘルプへのアクセス方法については、vii ページの「オンラインヘルプからの情報の入手」を参照してください。

プロジェクトの作成

概要

GeneMapper ソフトウェアで提供される AFLP データセット例の解析に使用するプロジェクトの作成方法を説明します。ソフトウェアでは、解析用のサンプルデータとアナリシスパラメータを編成するためにプロジェクトを使用しますが、これらのプロジェクトをロックまたは変更するわけではありません。従って、同じサンプルデータ、Analysis Method、サイズスタンダード定義、Panel および Bin Set を、複数のプロジェクトで共有できます。

注：GeneMapper ソフトウェアの自動解析機能をインストールすると、プロジェクトを自動的に作成するよう設定できます。自動解析機能の詳細については、『GeneMapper®_Software

Installation and Administration Guide』(PN 4363080) を参照してください。

プロジェクトの作成

1. GeneMapper ソフトウェアを起動してログインします（7 ページの「ソフトウェアの起動とログイン」を参照）。

2.「GeneMapper」ウィンドウで、をクリックします（「File」「New Project」）。

3.「New Project」ダイアログボックスで、AFLP を選択し、「OK」をクリックします。

GeneMapper v3.7 ではこのダイアログボックスは表示されません。そのままステップ 4

へ進みます。

4. 11 ページの説明に従って、サンプルファイルをプロジェクトに追加します。

AFLP プロジェクト設定

(21)

第2章解析のセットアップ

プロジェクトへのサンプルの追加

₁₁

プロジェクトへのサンプルの追加

概要

この手順では、GeneMapper ソフトウェアで提供される AFLP データセット例を、サンプルファイル (*.fsa) からプロジェクトに追加します。サンプルファイルをプロジェクトに追加すると、ソフトウェアは、データベースにデータを保存し、「GeneMapper」ウィンドウの「Samples」タブに関連するサンプル情報を表示します。注：GeneMapper ソフトウェアの自動解析機能をインストールすると、プロジェクトにサンプルデータが自動的に追加されます。自動解析機能の詳細については、『GeneMapper®

Software Installation and Administration Guide』(PN 4363080) を参照してください。

サンプルの追加

1. をクリックします（「File」「Add Samples to Project」）。

2.「Add Samples to Project」ダイアログボックスで、「Files」タブを選択します。

3. Example Data フォルダに次のとおり移動します。 <drive>:\AppliedBiosystems\GeneMapper\Example Data\ 4. AFLP フォルダを選択します。 5.「Add to List >>」をクリックします。 6. 選択したフォルダ内のすべてのファイルをプロジェクトに追加するには、「Add」をクリックします。 7. 12 ページの説明に従って、Analysis Method を作成します。 AFLP Tutorial 用サンプルファイルプロジェクトに追加するサンプル

(22)

第2章解析のセットアップ Analysis Method の作成

Analysis Method

の作成

概要

この手順では、データセット例をサイジングし、プロジェクト用の Panel と Bin Set を自動的

に作成する Analysis Method を作成します。

Analysis Method

について

Analysis Method は、GeneMapper ソフトウェアが実行する解析方法を多くの側面（ピーク検出、アレルコーリング、Peak Quality 評価、Process Quality 決定）で制御する設定の集合です。Analysis Method の設定は、アプリケーション固有です。たとえば、この節で説明されている Panel および Bin の自動作成機能は、AFLP Analysis Method でのみ使用することができます。また、Analysis Method は、プロジェクトやサンプルデータに依存していないため、複数のプロジェクトに同時に適用して使用することができます。

Analysis Method

の作成

1.「GeneMapper」ウィンドウで、をクリックします（「Tools」「GeneMapper Manager」）。

2. GeneMapper Manager で、「Analysis Methods」タブを選択します。

3.「Analysis Methods」タブで、「New」をクリックします。

4.「New Analysis Method」ダイアログボックスで、AFLP を選択し、「OK」をクリックします。

5.「Analysis Method Editor」ダイアログボックスの「General」タブで、Analysis Method

の名前として AFLP Tutorial と入力します。

注：「Analysis Method」カラムの最初のセルをクリックし、「New Analysis Method」を選択することで、Analysis Method を作成することもできます。

「

Allele

」タブ設定項目の設定

設定について

「Allele」タブでの設定は、GeneMapper ソフトウェアが、解析のピーク検出段階の後でサンプルデータからアレルコールする方法を定義します。この設定には、Automatic Panel Generation（14 ページを参照）と、アレルコーリングの標準化（16 ページを参照）という AFLP データの解析に固有の 2 つの機能が含まれます。

設定項目の設定

注：14 ページの図2-6に、この手順において「Allele」タブで行う変更を示します。

1.「Analysis Method Editor」ダイアログボックスで、「Allele」タブを選択します。

2. Analyze Dyes 設定で、Blue を選択します。

Analyze Dyes 設定は、アレルコールに使用される蛍光シグナルデータを定義します。この手順で Blue を選択する理由は、データセット例のサンプルが、FAM™で標識されたセレクティブプライマーを使用して増幅されているためです。 Analysis Method の名前 Analysis Method の種類 Analysis Method を新規作成

(23)

₁₃

3. Analysis Range 設定で、ソフトウェアが指定するデフォルトの塩基対の範囲が 50 ∼ 500 bp であることを確認します。 Analysis Range 設定では、アレルコーリング解析の実行に使用される範囲の制限を指定します。この手順ではデフォルトの範囲を使用するため、50 bp 未満または 500 bp を上回るピークは読み取られません。重要！ Analysis Range 設定では、ピークサイジングおよびピーク検出機能の範囲は制限されません。

4. Panel 設定で、Generate panel using samples を選択し、Panel の自動作成を設定します。詳細については、14 ページの「Automatic Panel Generation」を参照してください。

5. Allele Calling 設定では、AFLP アレルのバイナリスコアリングを実行するようソフトウェアを設定します。

a.「Edit Labels」をクリックします。

b.「Thresholds and Labels Details」ダイアログボックスの「Thresholds」カラムで、最初の列に 50、2 番目の列に 100 と入力します。

c.「Labels」カラムで、最初の列に 0、2 番目の列に Check、3 番目の列に 1 と入力します（下の図を参照）。

d.「OK」をクリックしてダイアログボックスを閉じます。

注：または、Name alleles using bin names を選択することにより、関連付けられた

Bin のおおよその位置（単位: bp）を使用して各アレルをラベルするようソフトウェアを

設定できます。

次の図は、「Thresholds and Labels Details」ダイアログボックスの設定がどのように適用されるかを示しています。

6. Allele Calling 設定で Delete common alleles を選択すると、プロジェクト内のすべて

のサンプルに存在するピークのジェノタイプコーリングが、解析済みデータセットから

削除されます。機能の詳細については、15 ページの「Delete Common Alleles 機能につ

いて」を参照してください。

注：Delete common alleles オプションを選択したが、特定の Peak Height Ratio を上回るピークを読み取らせたい場合、Do not delete if Peak Height Ratio exceeds を選択し、閾値とする値を入力します。

ピーク高（h） 例 コール

h < 50 RFU

50 RFU≤h < 100 RFU

(24)

7. Normalization（標準化）設定を次のとおり設定します。

a. Normalization Scope 設定で、Project を選択します（オプション）。

b. Normalization Method 設定で、Sum of Signal を選択します（オプション）。

標準化機能の詳細については、16 ページの「アレルコーリングの標準化」を参照してください。注：Normalization 設定をよく理解するには、手順 7aと7bのオプションを変更しながら、このガイドで説明されている解析を繰り返してください。異なる Normalization Method 設定の結果は、作成される Genotypes テーブルのアレルコールを比較すると、明確になります。 8. 17 ページの説明に従って、Peak Detector 設定を設定します。

図2-6 AFLP Analysis Method の Allele Calling 設定

Automatic Panel

Generation

Automatic Panel Generation 機能では、AFLP プロジェクトのサンプル内に存在するピークに基づいて、Panel と Bin を自動的に作成できます。通常、AFLP 実験にはゲノムのシーケンス

情報を使用できないため、多くの場合、作成されるフラグメントサイズと分布は予測できま

せん。AFLP データは数百ものピークから構成される場合があるため、Panel および Bin Set

を手動により作成すると非常に時間がかかり、非現実的です。Automatic Panel Generation 機能では、「Allele」タブで定義したルールセットに基づき、プロジェクト用にPanel と Bin Set

を自動的に作成するよう設定して、この問題を解決します。

注：各 AFLP 解析について、Panel および Bin Set の再作成を繰り返す必要はありません。このガイドで説明するとおり、作成した Panel と Bin Set は保存し、必要に応じて他のプロジェクトで使用したり、編集したりすることができます。バッククロス解析のための Panel Generation 設定の変更 AFLP データのバッククロス比較を実行している場合、Panel 設定により、プロジェクトの親サンプルのみを使用して Panel が作成されるようにソフトウェアを設定できます。ただし、プロジェクトデータの一部から Panel を作成するには、他のサンプルと区別可能な表記法に従って親サンプルを命名する必要があります。たとえば、15 ページの図 2-7ののように Panel を設定すると、すべての親サンプルの接頭辞に P が付く（例: P1-Dermis20051105）プロジェクトから Panel を作成できます。 Panel 設定（Panel の作成を設定） Analyze Dyes 設定 Allele Calling 設定 Normalization 設定「Bin Set」メニュー（非アクティブ） A

(25)

₁₅

または、「Samples」タブ（テーブル右側）の「user defined (UD)」カラムの１つにラベルを

入力することにより、親サンプルを特定して Panel を作成することができます。たとえば、15

ページの図2-7ののように Panel を設定すると、「Samples」タブの「UD1」カラムで、親

サンプルの列にラベル「P1」または「P2」が含まれるプロジェクト用のパネルを作成できます。注：親サンプルの名前がプロジェクトの他のサンプルと区別できないものである場合、親サンプルのみの基礎解析を実行することにより、Panel を作成できます。親サンプルを基準とした解析から作成された Panel は、サンプルセット全体の解析に使用することができます。図2-7 バッククロス解析用の Panel 設定の例。は接頭辞「P」を含む親サンプル、は「UD」カラムのラベルが「P1」または「P2」の親サンプル

Delete Common

Alleles

機能に

ついて

Allele Calling 設定（15 ページの図 2-8を参照）の Delete common alleles 機能を使用して、

AFLP プロジェクト用に作成されたアレルコールを単純化することができます。サンプルが示すバンドパターンの複雑さによっては、AFLP プロジェクトの Bin Set を構成するアレルの数が 100 を超えることもあります。Delete common alleles オプションを使用すると、サンプ

ルを区別するピークのみを読み取るようにソフトウェアを設定することにより、Bin の数を管

理しやすい数にまで減らすことができます。

Delete common alleles 機能は、次の Scope 設定に基づいて適用されます。

• Within run −同じランフォルダ内の他のサンプルと共通のアレルを削除します。

• Project −プロジェクトのすべてのサンプルに共通のアレルを削除します。

Peak Height Ratio 設定の使用

Peak Height Ratio 設定により、共通のピークの Peak Height Ratio により定義されるしきい値

（最大/最小）に基づいて、共通アレルの削除を制限します。たとえば、特定の Bin に対して

共通のピークを持つ 10 個のサンプルを含むプロジェクトは、15 ページの図 2-8に示される

Allele Calling 設定を備えた Analysis Method を使用して解析されます。解析中、10 個のピー

クの最小ピーク高に対する最大ピーク高の比率が算出されます。算出された比率が 1.8

（Analysis Method での設定）を上回る場合、すべてのピークは潜在的多型（ポリモルフィズ

ム）として保持されます。1.8 以下の場合、共通のピークは解析から削除されます。

図2-8 Allele Calling 設定の Peak Height Ratio 機能

B

「User defined (UD)」カラム

A B

ランフォルダ（選択中）ランフォルダ内のサンプル

Peak Height Ratio 設定

(26)

アレル

コーリング

の標準化

AFLP Analysis Method の標準化機能により、解析でアレルコーリングを行う前に、AFLP サンプル間のシグナル強度の差による影響を最小化します。ケミストリの違い（最初のテンプレート濃度や増幅効果の違いなど）および泳動状況により、AFLP サンプルから取り込まれる蛍光シグナルの強度に影響が出る場合があります。解析中に生じるサンプル間のピーク高の差は、ソフトウェアでこれらを法則性をもって補正しない限り、アレルコーリングに影響を与える場合があります。標準化を設定すると、GeneMapper ソフトウェアは、解析におけるピーク検出の後、アレルコーリングの直前に、各蛍光シグナルについて次の操作を独立して実行します。

1. Normalization Method 設定（Sum of Signal または Maximum Signal）に基づいて、

Normalization Scope 設定（Within Run または Within Project）で定義した集合の各サンプルについて、標準化因子を算出します。 2. Normalization Scope 設定で定義されたサンプル集合について、平均した標準化因子を作成します。 3. ソフトウェアは、各サンプルについて次を行います。 a. 集合内の平均標準化因子に対するサンプルの標準化因子の比率を算出します。 b. サンプルのシグナルに、算出された標準化因子の比率を乗じます。注：GeneMapper ソフトウェア v4.0 では、個々の、または平均した標準化因子を表示することはできません。

Normalization Scope

Normalization Scope 設定では、標準化操作に含まれるサンプルの母集合を定義します。 • None −データの標準化は行われません。 • Within Run −同じランフォルダ内に存在する他のサンプルに対して、各サンプルの蛍光シグナルを標準化します。 • Project −プロジェクトにあるすべてのサンプルの集合に対して、各サンプルの蛍光シグナルを標準化します。

Normalization Method

Normalization Method 設定では、Normalization Scope 設定で定義されるサンプルの母集合に対する標準化因子を算出する方法を定義します。

• Sum of Signal −各サンプルの解析範囲内のシグナルを合計し、Normalization Scope 設定で定義されたすべてのサンプルの平均を算出します。次に、各サンプルの標準化因子を、平均に対するサンプルの合計の比率として算出します。

ランフォルダ（選択中）ランフォルダ内のサンプル

(27)

₁₇

• Maximum Signal − 各サンプルの解析範囲内の最大シグナルを特定し、Normalization Scope 設定で定義されたすべてのサンプルの平均を算出します。次に、各サンプルの標準化因子を、平均に対するサンプルの最大シグナルの比率として算出します。

図2-9 アレルコーリングの標準化設定

「

Peak Detector

」タブ設定項目の設定

設定について

「Peak Detector」タブの設定では、ピークデータの検出およびサイジングに GeneMapper ソフトウェアが使用する方式を定義します。

設定項目の設定

1.「Peak Detector」タブを選択します。

2.「Peak Detector」タブの最上部で、「Peak Detection Algorithm」「Advanced」を選択します。

3. デフォルトのピーク検出設定を確認して、そのまま受け入れます。

Peak Detection Algorithm のデフォルト設定である Advanced は、データセット例の解析に適しています（このガイドの後半では変更します）。ユーザ独自のプロジェクトにあわせて設定を編集するための参照情報を下記に示します。

注：Peak Detection 設定の詳細については、GeneMapper® Software Online Help を参照してください。 4. 18 ページの説明に従って、Peak Quality 設定を設定します。 Normalization Scope 設定 Normalization Method 設定解析範囲とサイジング範囲の設定ピーク検出アルゴリズムピーク検出閾値

(28)

AFLP

解析に重要

な設定

Peak Detection 設定は、GeneMapper ソフトウェアによって実行されるすべての解析に共通ですが、Range および Peak Amplitude の設定は、AFLP 解析にとって特に重要です。

Ranges 設定

Ranges 設定では、プロジェクト用サンプルファイルの Raw Data のピークを検出する際に使

用されるデータポイント範囲を定義します。この設定は、2 組の制限値で構成されており、

ピーク検出解析のまったく異なる 2 つの側面で範囲を制御します。

• Analysis Range −ソフトウェアが Raw Data 内のピークを検出するデータポイント範囲を定義します。Partial Range オプションを選択すると、「Start Pt」および「Stop Pt」

フィールドで指定した範囲内のデータポイントのみを解析します。

• Sizing Range −処理データ内でソフトウェアがピークを検出するフラグメントサイズの範囲を定義します。Partial Range オプションを選択すると、「Start Size」および「Stop

Size」フィールドで指定した範囲内のピークのみを解析します。

重要！サイズスタンダードピークを解析から除外しないよう、Analysis Range の限度を設定してください。「Peak Detector」タブの Sizing Range 設定は、サイズスタンダード定義で

指定される範囲と一致している必要があります。一致していないと、1 つまたは複数のスタン

ダードピークが解析から除外され、関連するサンプルが正確にサイジングされません。

Peak Amplitude Thresholds

Peak Amplitude Threshold 設定では、Raw Data 内の各蛍光色素色のピークを特定するために使用される最小のシグナル強度を定義します。ピーク検出過程として、ソフトウェアは、各サ

ンプルのシグナルデータを、関連付けられた蛍光色素色の閾値設定と比較します。シグナル

強度が閾値以上になると、そのシグナルは、ピークである可能性があるとして、その位置で評価されます。

AFLP データのピーク高には大幅な変動があるため、Peak Amplitude Threshold 設定は AFLP

サンプルの解析において特に重要です。AFLP フラグメントの作成に使用されるケミストリに

よっては、AFLP サンプルデータのピーク高は大きく変動します。ソフトウェアは、シグナ

ル変動をある程度修正しますが、最適なパフォーマンスを得るには Peak Amplitude Threshold

設定を調整する必要があります。それぞれの色に対する閾値設定は、最も弱いピークでも検出できるよう十分低く、かつノイズを排除するためバックグラウンドを上回る十分な高さが必要です。

「

Peak Quality

」タブ設定項目の設定

設定について

「Peak Quality」タブでは、「Genotypes」タブに表示されるそれぞれの PQV テストをどのように実行するかを制御する設定を行います。

設定項目の設定

1.「Peak Quality」タブを選択します。 2. デフォルトの Peak Quality 設定を確認して、そのまま受け入れます。デフォルト設定は、データセット例の解析に適しています。下記に示すのは、ユーザ独自のプロジェクトの設定を編集するための参照情報です。 3. 19 ページの説明に従って、Quality Flags 設定を設定します。

Peak Morphology 設定

Max Peak Width 設定では、Broad Peak PQV テストの実行に使用される上限を定義します。

ピーク基底部の領域が指定した値よりも広い場合、関連するサンプルに対して (Check) が

(29)

₁₉

ピーク設定

Pull-Up Ratio 設定では、プルアップピークの検出に使用される比率の閾値を定義します。それぞれのピークの位置において、解析された蛍光シグナルの比率が算出されます。あるピークにおいて蛍光シグナルの比率が Pull-Up Ratio 値を上回る場合、関連するサンプルに対して、「Genotypes」タブの「SPU PQV」カラムに (Check) が表示され、プルアップピークの可

能性を示します。 Pull-Up Scan 設定では、隣接する蛍光色素によるプルアップピークが検出されたピークからの距離をデータポイントで定義します。たとえば、データポイント 3760 で特定のピークが発生し、Pull-Up Scan 設定が 1 の場合、ソフトウェアは、隣接する蛍光シグナルでデータポイント 3759 ∼ 3761 をテストし、プルアップピークをスキャンします。

「

Quality Flags

」タブ設定項目の設定

設定について

「Quality Settings」タブでは、PQV の加重および閾値を設定します。

設定項目の設定

1.「Quality Flags」タブを選択します。 2. デフォルトの Quality Flags 設定を確認して、そのまま受け入れます。デフォルトの Quality 設定は、データセット例の解析に適しています。下記に示すのは、ユーザ独自のプロジェクトの設定を編集するための参照情報です。

3. 設定の確認が完了したら、「OK」をクリックして、AFLP Tutorial Analysis Method を保存します。

4.「Done」をクリックして GeneMapper Manager を閉じます。

5. 21 ページの説明に従って、アナリシスパラメータをプロジェクトに適用します。

Quality Flag Settings

Quality Flag Settings では、関連付けられた PQV がプロジェクトの Genotype Quality (GQ)

値に影響する範囲を定義します。各設定は、0 と 1 の間の値（加重）で構成され、次の数式に

基づいて、関連付けられた PQV の影響を定義します。

GQ = MQ×( 1−SPU)×(1−BD)×(1−OS) )

ここで、

• BD − Broad Peak PQV テストの Quality Flag Setting • GQ −設定のジェノタイプの Genotype Quality PQV • MQ −設定のジェノタイプの Marker Quality 値

• OS − Off-Scale PQV テストの Quality Flag Setting

• SPU − Spectral Pull-Up PQV テストの Quality Flag Setting

注：BD、GQ、MQ、OS、SPU の各 PQV に関する詳細については、『GeneMapper®_Software

(30)

たとえば、Max Peak Width 閾値を上回るピークが含まれるためにサンプルが BD (Broad Peak) テストに失敗すると、GQ 値の作成に使用される数式には BD Quality Flag 設定が適用

されます。次の表は、BD PQV の加重として割り当てられる各値が与える影響を要約して示

しています。

PQV Thresholds

PQV Thresholds では、「SQ (Sizing Quality)」カラムおよび「GQ (Genotype Quality)」カラムで、 (Pass)、 (Check)、 (Low Quality) が表示されるかを決定する範囲を定義します。ソフトウェアが実行する SQ および GQ 評価によって、0 ∼ 1 の値が算出されます。Analysis Method の「Peak Quality」タブの PQV Threshold 設定に基づいて、各値が適切なアイコンに変換されて表示されます。

上の図に示すデフォルトの PQV Threshold 設定に基づいて、SQ および GQ の各アイコンは次のように適用されます。

BD Quality Flag Setting GQ PQV への影響

0 影響なし 0.5 GQ 値を 2 分の 1 に削減 1 GQ 値を 0 に削減 SQ/GQ 値（v） 「SQ」および「GQ」カラムに表示されるアイコン 0.75≤v (Pass) 0.25 < v < 0.75 (Check) v≤0.5 (Low Quality)

(31)

アナリシスパラメータの適用

₂₁

アナリシス

パラメータの適用

概要

この手順では、AFLP Tutorial プロジェクトのサンプルに、Analysis Method とサイズスタン

ダードを適用します。

注：GeneMapper ソフトウェアの自動解析機能を使用して電気泳動すると、アナリシスパラメータを自動的に適用するよう設定できます。自動解析機能の詳細については、

『GeneMapper®_{Software Installation and Administration Guide}_』_{(PN 4363080)}_{を参照してく}

ださい。

Table Setting

の

適用

AFLP Default の Table Setting は、「Samples」タブと「Genotypes」タブを設定して、AFLP

データの解析に関連するカラムのみを表示するようにします。カスタムの Table Settings の作成に関する詳細については、vi ページの「関連資料」の説明に従って、GeneMapper® Software Online Help を参照してください。

AFLP Default の Table Setting を適用するには、次の手順を実行します。

ツールバーで、「Table Setting」「AFLP Default 」の順に選択して、デフォルトの AFLP Table Setting を新規プロジェクトに適用します。

アナリシス

パラメータの適用

1.「GeneMapper」ウィンドウの「Samples」タブで、プロジェクトの最初のサンプルに対する設定を次のとおり設定します。

a.「Analysis Method」カラムで最初のセルをクリックし、AFLP Tutorial（12 ページ

で作成）を選択します。

b.「Size Standard」カラムで最初のセルをクリックし、GS500(-250) を選択します。重要！ AFLP Tutorial の Analysis Method が Panel を自動的に作成するように設定されているため、「Panel」カラムのセルは None に設定されている必要があります。

2. [Ctrl] キーを押しながら、「Analysis Method」、「Panel」、「Size Standard」カラムのヘッダを選択します。

AFLP Default の

(32)

アナリシスパラメータの適用

3.「Edit」「Fill Down」を選択し（[Ctrl] + [D] キー）、最初のサンプル（列）の設定を残りのサンプルに適用します。

重要！ Analysis Method、Panel、Size Standard の設定は、すべてのサンプルについて同一である必要があります。 4. 第3章の説明に従って解析を実行します。

アナリシス

パラメー

タの一致の検証

アナリシスパラメータの矛盾は、プロジェクト解析の際に発生する問題の多くの原因です。設定が一致していない場合、ソフトウェアはサンプルのサイジングやジェノタイピングができず、解析を開始することさえできない場合があります。従って、何らかの解析を開始する前に、問題を発生させる可能性のある次の領域で、矛盾がないかチェックしてください。

• アナリシスパラメータの一致− Analysis Method、Panel、Size Standard の設定は、すべてのサンプルについて同一である必要があります。

• 解析範囲/サイジング範囲の一致−プロジェクト内のサンプルに適用される Analysis Method

の Analysis Range および Sizing Range で、最大値と最小値が一致している必要があります。

• Analysis Method/Size Standard の一致−プロジェクト内のサンプルに適用されるサイズスタンダード定義には、Analysis Method の Analysis Ranges または Sizing Ranges

の範囲を逸脱するフラグメントサイズが含まれてはなりません。

• Panel および Bin Set の一致−Analysis Method で指定された、サンプルで使用される

Bin Set は、「Samples」タブの「Panel」カラムに表示される Panel でも使用する必要があります。注：アナリシスパラメータまたは Panel/Bin Set の矛盾が発見されると、図2-10に示すようなメッセージが表示されます。解析範囲またはサイジング範囲の矛盾が発見された場合、警告メッセージは表示されませんが、他の現象（プロジェクト全体での PQV の失敗など）により問題の発生が明らかとなります。図2-10 データ入力のエラーに対して表示される「Alert」ダイアログボックス特定のサンプルのエラーメッセージ情報を表示するには、次の手順を実行します。 1.「GeneMapper」ウィンドウで、「Samples」タブを選択します。 2.「GeneMapper」ウィンドウのナビゲーションペインで、をクリックし、プロジェクトフォルダを展開して、目的のサンプルを選択します。 3.「Info」タブを選択して、関連するサンプルファイルに関するすべての情報の要約を表示します。

4.「Info」タブで、テキストをスクロールして「Error Message」ヘッダを表示し、問題の原因を確認します。

5.「Info」タブの表示を確認したら、プロジェクトフォルダを選択し、「Samples/Genotypes」タブを表示します。

設定が記入されますカラムヘッダ

(33)

第

3 章

第 3 章 データの解析と検証解析のセットアップ第 2 章第 1 章ご使用になる前に第 4 章解析済みデータのエクスポートと印刷

₂₃

データの解析と検証

この章では、次の項目について説明します。 ■ 概要. . . 24 ■ プロジェクトの解析. . . 25 ■ オフスケールデータの検証. . . 27 ■ Size Quality データの検証. . . 29 ■ 解析済みデータの検証 . . . 38 ■ 結果の編集 . . . 46

■ 作成した Panel と Bin Set の保存 . . . 51

(34)

第3章データの解析と検証概要

概要

章の構成

この章では、次の項目について説明します。 • プロジェクトの解析 • サイズスタンダード定義のカスタマイズ • 結果の編集

– Samples Plot または Genotypes Plot を使用した、Bin とアレルの追加、移動、削除

– Panel Manager を使用した、Bin の追加、移動、削除

• 解析済みデータの検証

–「Samples」および「Genotypes」テーブルで PQV を閲覧

– Raw Data Plot を使用して、個々のサンプルのオフスケールピークを検証

– Size Match Editor を使用して、個々のサンプルのサイジングデータを検証

– Samples Plot を使用して、サイズスタンダードデータ（およびレプリケート）のサイズ値を検証

– Genotypes テーブルで、解析済みデータを閲覧

• 作成した Panel と Bin Set の保存と適用

• よくあるサイジングエラーのトラブルシューティングおよび修正

このステップでは

前の章で、AFLP®_{プロジェクト解析の準備に必要なタスクはすべて実行しました。データ例}

用に構築したプロジェクトは解析の準備が整っており、この章で実行します。

詳細情報

この章では、AFLP データセットの解析に関するソフトウェア機能の一部を説明します。ユー

ザインタフェースの全機能に関する詳細については、GeneMapper®_{Software Online Help}_を

参照してください。オンラインヘルプへのアクセス方法については、vii ページの「オンライ

(35)

第3章データの解析と検証

プロジェクトの解析

₂₅

プロジェクトの解析

概要

プロジェクトを解析し、「Samples」および「Genotypes」タブで PQV を暫定的に閲覧する手順を説明します。

Automatic Panel

Generation

に

ついて

Analysis Method は、Panel を自動的に作成するよう設定されているため（13 ページの手順 4

を参照）、ソフトウェアは、ピークの読み取りおよびサイジングに続いて、サンプルから Panel

と Bin Set を作成します。データセットのフィルタリング後、Analysis Method の「Alleles」タブで定義した解析範囲にある 1 つの Marker を含む Panel が作成されます。次に、フィルタ

リングされたデータセット内の各ピークについて、関連付けられたピークの頂点を中心とす

る 0.8-bp 幅の Bin が作成されます。解析後、作成された Panel と関連付けられた Bin Set をエクスポートして、他のプロジェクトで使用することもできます。

重要！ AFLP データの Bin 作成には、Panel Manager の AutoBin 機能を使用しないでください。AutoBin 機能の使用目的は、マイクロサテライトデータの解析であり、AFLP プロジェクト用の Bin は作成できません。注：Analysis Method は、共通のアレルを削除するよう設定されているため（13 ページの手順 6を参照）、すべてのサンプルに共通のピークの Bin は作成されません。

プロジェクトの解析

1. をクリックして（「Analyze」「Analyze」）、解析を開始します。 2. 保存について尋ねるメッセージが表示されたら、AFLP Tutorial と入力し、「OK」をクリックします。解析中は、現在解析されているサンプルの列が緑色にハイライト表示されます。サンプルの解析に失敗すると、失敗したサンプルの列が赤にハイライト表示されます。 3. 解析が完了したら、次の項目を確認します。 • ステータスバー− 「Analysis Completed」が表示されていること。これは、プロジェクトの解析が完了したことを示します。 • 「Status」カラムのセル−空白であること。これは、各サンプルの処理が成功したことを示します。 • 「Genotypes」タブ−使用可能状態であること。これは、解析が完了したことを示します。

4. をクリックして（「Analysis」「Low Quality to Top」）データをソートすると、「Samples」タブのテーブルの一番上から順に、PQV スコアの低いサンプルが表示されます。

GeneMapper. Software Version 4.0 AFLP. System Analysis Getting Started Guide (PN )

GeneMapper

ソフトウェア

v4.0

AFLP

®

解析

Getting Started Guide

GeneMapper

ソフトウェア

v4.0

AFLP

®

解析

Getting Started Guide

目 次

iii

まえがき

v

第

1

章

ご使用になる前に

1

第

2

章

解析のセットアップ

9

第

3

章

データの解析と検証

23

第

4

章

解析済みデータのエクスポートと印刷

57

索 引

65

v

まえがき

このガイドの使い方

このマニュアルの

目的

対象読者

前提条件

表記法

ユーザへの注意事項

詳細情報の入手方法

安全に関する情報

ソフトウェアの保証

とライセンス

関連資料

vii

連絡先

オンライン

ヘルプ

からの情報の入手

サポートの入手方法

第

1

章

1

ご使用になる前に

サポートされる

AFLP

試薬ケミストリについて

AFLP

システムに

ついて

互換性のある

AFLP

解析

3

Preselective Amplification（オプション）

Selective Amplification

互換性のある装置

使用可能な

目次

_iii

索引

_v

_vii

₁

₃

₅

₇

₉

₁₁

₁₃