動脈硬化の治療に向けた新たな研究戦略
―遺伝子改変ウサギの開発及び応用
範 江 林
山梨大学大学院医学工学総合研究部分子病理学講座 要 旨：動脈硬化とその合併症である心筋梗塞，脳卒中といった生活習慣病は，日本を始めとした 先進工業国における死亡原因の約半数を占め，人口の高齢化が加速される中で，今や医学領域のみ ならず社会経済的にも最も重要な課題となっている。わが国においては自動車の普及による運動不 足や食習慣の欧米化による高カロリー食の摂取に伴い，動脈硬化患者の増加傾向が，近年，社会問 題としてマスコミでもよくクローズアップされるようになっている。この動脈硬化の原因並びに成 立機序に関しては，高脂血症や糖尿病，高血圧，喫煙などの古典的な危険因子が重要な役割を演じ ることは周知の通りであるが，最近では内臓型肥満やそれに起因するメタボリックシンドロームが 新しい危険因子として注目されている。動脈硬化がどのように発生し進展しているかを理解し，そ の治療及び予防法の開発に向けてどのように研究を展開すべきかは，臨床医並びに医学研究者にと って大きな使命である。本稿では病理学の立場から動脈硬化の最新知見を概説すると共に，現在本 研究室で推進している遺伝子改変ウサギモデルによる動脈硬化研究の成果について紹介したい。 キーワード 動脈硬化，遺伝子導入動物，高脂血症，炎症，MMP はじめに 動脈硬化（症）という語は，文字通り，大型 と中型動脈壁の硬化，肥厚，弾力性の消失など の変化によって循環障害をもたらす病気の総称 である。病理学的には三つの異なる形態学的変 化を含む。すなわち，粥状動脈硬化，メンケベ ルグ型中膜硬化（加齢によるもの），そして細 動脈硬化（高血圧によるもの）である。広い意 味では 3 つを含む概念であるが，そのうち，粥 状動脈硬化がもっとも重要であり，日常的に動 脈硬化と呼ぶときには，通常この粥状動脈硬化 を指している。 動脈硬化の合併症としての心筋梗塞や脳梗塞 の発症は，働き盛りの年代で飛躍的に高発とな り，医学的な問題だけでなく経済的，社会的に 影響を及ぼす大きな問題となっている。従って， 動脈硬化の発病機序の究明や治療法の開発など は医学分野においては焦眉の課題である。動脈 硬化の発生におけるメカニズムにはいくつかの 学説が提唱されてきたが，いずれも単一の説だ けでは動脈硬化発生のすべてを説明することが できないのが現状である。表 1 に示すように， その理由はひとえに動脈硬化の成因が multi-factorial であることにある。これらの危険因子 の危険度は，単独で見た場合は軽度であっても， それらが複数集積することにより動脈硬化を飛 躍的に促進させることが注目されており，これ 故，最近ではメタボリックシンドロームという ような代謝異常の集合体を表す新しい概念が提 唱されている。 〒 409-3898 山梨県中央市下河東 1110 受付： 2007 年 4 月 10 日 受理： 2007 年 4 月 13 日総 説
動脈硬化の形成や進展，複合病変の形成過程 において，炎症という概念で総括される生体反 応にきわめて類似した現象がみられることは疑 いのないことである1,2）。動脈硬化の病変を観 察すると，接着因子（VCAM-1，ICAM-1 など） の発現や炎症細胞（T リンパ球，単球・マクロ ファージ）の浸潤とともに様々の炎症因子（サ イトカインや走化因子，増殖因子など）の発現 や平滑筋細胞増殖，細胞外基質の産生などがみ られ，いずれも炎症反応を特徴づける代表的病 態である。傷害反応仮説の提唱者である Ross 教授が彼の最後の総説に「動脈硬化は炎症性疾 患である」と明言しているように1），現在では 動脈硬化は単に加齢に伴う退行性病変ではな く，一連の炎症性変化の過程を経て発生する特 殊な慢性炎症性疾患であるとする考えが広く受 け入れられている。それ故，炎症の立場から動 脈硬化発生の分子機構を解明することは，動脈 硬化の治療薬の開発にも重要な貢献をするもの と期待されている。 動脈硬化の病変 ヒト解剖例から得られた大動脈硬化の病変 は，肉眼的にも観察できる。動脈内膜に黄色の 点状，線状あるいは斑状を呈している平坦な脂 質沈着巣といった早期病変から，石灰化や破綻 による潰瘍化，出血，血栓の形成を伴う複合病 変と呼ばれる 2 次的病変まで，様々な形態を示 す（図 1）。顕微鏡下での動脈硬化の初期病変 の特徴として，細胞内に大量のエステル化コレ 図 1． ヒト大動脈硬化の肉眼所見（A ：脂肪斑，B ：線維化プラーク，C ：複合病変）。 表 1．動脈硬化の危険因子 主要な危険因子 不確定な危険因子 制御不可能 運動不足 加齢 ストレス 男性 閉経後のエストロゲン不足 家族歴 多量の炭水化物の摂取 遺伝的異常 Lp（a） クラミジア肺炎などの感染 制御可能 新規危険因子 高脂血症 肥満 高血圧 メタボリックシンドローム 喫煙 高値の C 反応性蛋白 糖尿病
ステロールを蓄積した泡沫細胞の集簇がみられ る（図 2）。泡沫細胞の起源については一般に 血液単球由来のマクロファージと血管平滑筋細 胞であるとされているが，初期病変においては 定型的形態を示す泡沫細胞のほとんど大部分が 単球・マクロファージ由来であることが動物実 験やヒト動脈硬化病変の観察により証明されて いる3）（図 2）。マクロファージは，過酸化など の修飾を受けた変性 LDL やレムナントリポ蛋 白に代表される，動脈硬化を惹起するリポ蛋白 を，スカベンジャーレセプターによって制限な く取り込み，細胞内に大量のエステル化コレス テロールを蓄えた泡沫細胞となり，脂肪斑（脂 肪線条 fatty streak）と呼ばれる初期病変の主要 な構成細胞となる（図 2）。また，初期病変を 含め，動脈硬化発生のすべての時期にマクロフ ァージと活性化された T リンパ球が“対”を なして共存している4）（図 3）。内膜に進入した マクロファージは泡沫細胞病変を形成するのみ ならず，種々の炎症性 mediators（サイトカイ ン，増殖因子，プロテアーゼ）などを産生・放 出することによって病変の進展を促進させる。 図 2． ヒト動脈硬化の早期病変―脂肪斑（A）。マクロファージ（Mφ）由来の泡沫細胞が内 膜 に 集 簇 （ B）。平滑筋細胞も散在しているが（C），泡沫細胞には過酸化 LDL （oxLDL）の蓄積がみられる（D）。 図 3．ヒト大動脈硬化の免疫染色（A）と電顕像 （B）−泡沫細胞の間に多数の CD8+T リンパ 球が浸潤。 中央の泡沫細胞の周囲に小型のリンパ球が密 着してロゼット状に配列している。泡沫細胞 と泡沫細胞（M1 と M2），リンパ球とリンパ 球（矢印）の接触も観察される。
また，T リンパ球より産生される IFN-γはマク ロファージの泡沫化やマトリックスメタロプロ テアーゼ（MMPs）の産生を調節している。さ らに，血管平滑筋細胞の増殖を抑制することに よっても動脈硬化の進展，特にプラークの破綻 に関与している4）。 動脈硬化の成り立ち 実験動物にコレステロール食を与えると，血 中の単球や T リンパ球が内皮細胞へ接着し， 数日から数週後にはこれら細胞の内膜浸潤・集 積，マクロファージの泡沫化が発生し，早期病 変である脂肪斑が形成される5）（図 4）。これら の一連の病変形成過程を制御している分子機構 については，分子生物学的手法，とくに遺伝子 改変動物（トランスジェニックおよびノックア ウトマウス）を用いた研究が大きく貢献してい る。 単球・ T リンパ球の内膜浸潤の分子機構に ついては，（1）ケモカイン，特に単球とリンパ 球 に 対 し 特 異 的 走 化 性 を 示 す m o n o c y t e chemoattractant protein-1（ MCP-1） 依 存 性 の 機序と，（2）血管内皮細胞表面に発現される接 着因子を介した機序が，その最初の段階を規定 している。Takeya らによると，MCP-1 は早期 病変である脂肪斑に強く発現されており，この 時期では内皮細胞とマクロファージが主たる産 生細胞である6）。更に，変性 LDL にも単球走 化性に加え T リンパ球走化性がある7）。また， 図 4． 走査電顕（A − B）と透過電顕（C）で観察された高コレステロール食投与によるウサギ 大動脈の早期変化。 A-C ：内皮細胞表面に接着した白血球は細胞突起を伸ばし，内皮下へ進入姿勢を示してい る。 D ：内皮下におけるマクロファージの集簇（免疫染色）。
MCP-1 あるいは MCP-1 の受容体である CCR2 受容体のノックアウトマウスにおいて，動脈硬 化の発生が野生型マウスに比較し有意に抑制さ れることが報告されている8,9）。面白いことに， CCR2 ノックアウトマウスでは代表的な慢性炎 症である結核の感染が正常マウスに比べ増強し ている10）。以上のことは動脈硬化が生体の過 剰反応により成り立つ慢性炎症であるとする直 接的な根拠と考えられている11）。 単球・ T リンパ球の血管内皮細胞への接着 には，複数の分子を介した多段階機構が提案さ れている。ヒトや実験動物の泡沫細胞に富んだ 動脈硬化病変部を覆う内皮細胞では，VCAM-1 や ICAM-1, P-セレクチン，E-セレクチンなど の接着分子の強い発現がある12）。さらに高コ レステロール血症ウサギを用いた実験による と，VCAM-1 や P-セレクチンの発現が，単球・ マクロファージや T リンパ球の血管内皮下へ の侵入に先立って発生している13）。著者らは ラットモデルを用いて ICAM-1/LFA-1 経路が初 期病変の形成に関わっていることを報告してい る14）。高脂血症ラットに抗 ICAM-1/LFA-1 抗体 を注入すると大動脈硬化の程度が著しく減少す る。これらの接着分子はいずれも IL-1，TNF などの炎症性サイトカインによりその発現が誘 導され，炎症組織への種々の白血球の局所的な 浸潤に関与している。また，変性 LDL を培養 内皮細胞に作用させると，VCAM-1，ICAM-1 や P-セレクチンの細胞表面での発現が選択的 に増加し，単球の血管内皮細胞への接着が亢進 する15）。さらに ICAM-1 ならびに P-セレクチン ノックアウトマウスとアポ B トランスジェニ ックあるいはアポ E ノックアウトマウスとを 交配させた double ノックアウトマウスでは， 大動脈硬化の程度がコントロールマウスより有 意に抑制されている16,17）。VCAM-1 についても ノックアウトマウスの作製が試みられたが，ホ モマウスが生後間もなく死亡するために動脈硬 化研究への応用はできなかった。ところが， Cybulsky らは VCAM-1 の domain4 のみのノッ クアウトマウス（Vcam14D/4D）を作製し，LDL 受容体ノックアウトマウスと交配させ，dou-ble ノックアウトマウスを作製した。早期の動 脈硬化を検索したところ，Vcam14D/4Dマウスで は動脈硬化病変が著しく抑制されていたが， ICAM-1 ノックアウトマウスでは，コントロー ルと比較し有意な差は認められなかった18）。 このことから，彼らは動脈硬化発生の早期にお いては ICAM-1 よりも VCAM-1 の方が重要では ないかと述べている19）。以上のようなヒトな らびに動物実験より得られた知見を基礎に，動 脈硬化の発生・進展の様式を模式化したものが 図 5 である。 プラークの破綻と炎症反応 進展した典型的な冠状動脈硬化病変である粥 腫（アテロームあるいはプラーク，図 6）では 内膜深部にコレステロールエステルに富む粥状 物（脂質コア）があり，その表面は線維性被膜 で覆われている。線維性被膜は一般に平滑筋細 胞とコラーゲン，エラスチンなどの結合組織成 分を主とするが，マクロファージや T リンパ 球が種々の割合で混在している。脂質コアの周 囲には脂質空胞を充満した泡沫細胞が集まって おり，その間に T 細胞も種々の割合で混在し ている。アテローマの破綻は冠状動脈血栓症の もっとも重要な原因であり，臨床的に急性冠症 候群 acute coronary syndrome へと進展する。 安定したプラークに対照して，破綻しやすい不 安定なプラーク（脆弱プラーク： vulnerable plaque）では，コレステロールエステルを主要 な内容とする大きな脂質コアを薄い線維性被膜 が覆っている（図 7）。また，破綻しやすいプ ラーク辺縁の肩の部分は平滑筋細胞やコラーゲ ンに乏しく，多数の泡沫化したマクロファージ や T リンパ球の浸潤を特徴とする炎症反応が 目立つ20）。プラークの不安定化に至る分子機 構については，いまだ詳細は不明であるが，こ のような部位に集まったマクロファージや T リンパ球が MHC クラス II 抗原を発現した活性 化細胞であることから，炎症反応が深く関与し
図 6． ヒト動脈硬化の進展した粥状腫（アテローム）の模式図。 図 5． 炎症を基にした動脈硬化の発生・進展の模式図。
ていると考えられている。とくに活性化された T リンパ球から産生される IFN-γは平滑筋細胞 の増殖を抑制するとともにコラーゲンやエラス チンの産生を抑える。また，IFN-γとプラーク に存在する他のサイトカインである TNF や M-CSF，MCP-1 はマクロファージを活性化し，こ れらの活性化されたマクロファージが産生する MMPs が被膜を構成する細胞外基質の分解を促 進することとなる21）。さらに，T リンパ球表面 に発現している CD40 リガンドとマクロファー ジの CD40 受容体との結合によりマクロファー ジからの MMPs の産生・分泌がさらに促進し， プラークの脆弱化や破綻が助長される22）。プ ラークが一旦破綻すると放出された tissue fac-tor が血液と接触することにより動脈硬化の最 も危険な合併症である血栓形成を惹起し，内腔 閉塞へ進展する。 遺伝子改変ウサギモデルを用いた動脈硬化進展 における MMP-12 機能の解明 ポストゲノム時代を迎えた現在，生活習慣病 を代表する疾患である動脈硬化の発生及び進展 に関連する遺伝子が多く同定されつつあるが， 最終的には個々の遺伝子の体内での生理機能な らびに病理学的意義が解明されなければならな いことは言うまでもない。そのために，より人 間の病態に近い適切な遺伝子改変実験動物モデ ルの使用が病因関連遺伝子の解析には不可欠な 手段である。我々は世界に先駆けて，ヒト遺伝 子の導入によるユニークなウサギ病態モデルの 開発に成功している23）。マウスではなくウサ 図 7． ヒト冠状動脈の安定プラーク（A）と不安定プラーク（B）とその 特徴の模式図（C）。
ギを使う大きな理由は，表 2 に示す。まず，ウ サギの脂質代謝系はヒトに類似しており，特に 血中のリポ蛋白はヒトと同様，LDL である。 それに対して，汎用されているマウスのリポ蛋 白のほとんどが抗動脈硬化作用のある“善玉” HDL である。さらに，ウサギは高脂肪食に対 する反応が敏感であり，動脈硬化になりやすく， 餌の脂肪の量と負荷した期間の調整によって， ヒト動脈硬化病変（早期病変から複合病変まで） の再現ができる。しかし，マウスでは高脂肪食 を投与しても動脈硬化が起こりにくく，サイズ の小さい血管で観察される病変もヒトの動脈硬 化の早期病変に過ぎない。 我々は炎症を基盤とした動脈硬化病態を解明 するために，プラーク破綻と大動脈瘤の形成に 強く関係している MMP の発現に注目し研究を 行ってきた。しかし，動脈硬化病変に多くの MMP が存在している中，どの MMP が動脈硬 化の発生に直接的に関与しているかは不明であ った。そこで我々は，ヒト並びにウサギ動脈硬 化病変を用いて網羅的に検討を行い，病変に特 異的に過剰発現する複数の MMP 候補遺伝子を 見出した。その中でエラスターゼとも呼ばれる MMP-12 において特に顕著な高発現が認められ たことから，MMP-12 の生理機能および動脈硬 化形成との関連について検討した。MMP-12 は， 病変に多く存在しているマクロファージから特 異的に分泌されることから，動脈硬化の進展に おける MMP-12 の役割が大きいと考えられる。 そこで，我々はヒトスカベンジャー受容体プロ モーターによりマクロファージに特異的に過剰 発現する MMP-12 遺伝子改変（Tg）ウサギの 作製を試み，これに成功した24）。この MMP-12 Tg ウサギの特徴は，炎症性肉芽腫の形成や炎 症性関節炎が促進されることであり，慢性炎症 モデルとしての応用が可能なことを示した25）。 Tg ウサギ並びに正常ウサギに高脂肪食を負 荷し，動脈硬化の形成及び進展程度を比較した。 興味深いことに，正常ウサギに比し，Tg ウサ ギの大動脈硬化及び冠動脈硬化の広がりが高度 であり，また，病変へのマクロファージの浸潤 も著明で，動脈中膜弾性線維の破壊や断裂など が著しく増加した。病変内の各 MMPs の発現 様式を検討したところ，MMP-12 以外の MMP も up-regulated されており，MMP-12 の増加が 他の MMP の活性化を誘導させる可能性が示唆 された26）。現在，この MMP-12 を過剰発現す る Tg ウサギを用いて，MMP-12 拮抗剤の抗動 脈硬化作用を検討している。 今後の展望について 動脈硬化の発生・進展や複合病変の形成に， 炎症反応が重要な役割を果たしている。動脈壁 を舞台にしたこの特殊な炎症は，脂質代謝の異 常により生ずる atherogenic リポ蛋白（変性 表 2．ウサギ脂質代謝の特徴とヒト，マウスとの比較 ヒト ウサギ マウス・ラット 血中の主なリポ蛋白 LDL LDL HDL CETP あり あり なし アポ B 編集酵素の発現 小腸 小腸 小腸と肝臓 肝リパーゼ 肝細胞膜に結合 肝細胞膜に結合 血中に遊離 肝臓 LDL 受容体活性 コレステロールに コレステロール コレステロールに より制御 により制御 制御されず 高脂肪食 敏感 敏感 鈍い 動脈硬化発生 しやすい しやすい しにくい 心筋梗塞の発生 する する しない スタチンによる血中脂質の低下作用 あり あり なし
LDL や Lp（a）など）の血管壁への沈着を契機 とし，さらに内皮細胞における接着因子の発現 や単球・ T リンパ球の内膜への浸潤，泡沫細 胞の形成などを介して病変形成が進行する。ま た，これらの atherogenic リポ蛋白は内膜に存 在する炎症細胞あるいは炎症性メディエータと の相互作用により病変の進展やプラークの破綻 にも深く関与している。これら一連の炎症過程 に関わる分子機構を解明することは，動脈硬化 の分子病態の究明に大きく貢献できるものと考 えられる。今後は，分子生物学的手法並びに有 効な動物モデルを用いて，動脈硬化の標的とな る遺伝子を探索するだけでなく，新たな治療法 と診断法の開発につながるようなトランスレー ショナルリサーチを展開していくことが，もっ とも重要な課題である。我々は，新しい遺伝子 改変ウサギモデルを駆使した，動脈硬化の分子 病態の解明に向けて，すでに 10 数種類のモデ ルの作製に成功している23）。さらに現在，臨 床現場で直面している動脈硬化の合併症である 心筋梗塞の治療法の開発のために，神戸大学と の共同研究により心筋梗塞を自然発症するウサ ギモデルを作製した27）（図 8）。また，心筋梗塞 のもっとも危険度の高い危険因子である CRP を研究できるウサギモデルを作製し，世界から の注目を浴びている28,29）。今後は，本学の臨床 並びに基礎の各分野の先生と連携しながら，こ れらのウサギモデルを生かして更なる研究を進 図 8． ウサギ心筋梗塞モデル。 A. 内膜下心筋梗塞（濃染部：心筋壊死層） B. 冠状動脈硬化による狭窄 C. ウサギの心電図の異常 D. 不安定プラークの形成，マクロファージの浸潤が著明である
めていきたいと考えている。これらの研究成果 は，図 9 に示したように生活習慣病の早期診断， 治療，予防や新薬の開発，将来のテーラーメイ ド医療の実現にも貢献できるものと確信してい る。 文 献
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