卒業論文ダイジヱスト 微生物叢解析及びメ夕ボローム解析から探る沢庵漬けの発酵過程の解明 環境情報学部 4 年 梅田栄美 要旨 沢庵漬けは大根を干して米糖と塩で漬け, 乳酸菌や酵母などの微生物による発酵させることによって作

Title 微生物叢解析及びメ夕ボローム解析から探る沢庵漬けの発酵過程の解明 Sub Title Author 梅田, 栄美 Publisher 慶應義塾大学湘南藤沢学会 Publication year 2013 Jtitle 生命と情報 No.20 (2013. ) ,p.158- 165 Abstract 沢庵漬けは大根を干して米糖と塩で漬け, 乳酸菌や酵母などの微生物による発酵させることによっ て作られる日本の伝統的な漬物である。本研究では微生物発酵の仕組みを理解することを目的に, 沢庵漬けの本漬けの過程における糠床中の細菌叢の変化及び沢庵漬け内のメタボライトの変化を, 16S rRNAクローンライブラリー解析, RT-PCRにより細菌数の定量及びCE-TOFMSによるメ夕ボロー ム解析を行った。解析対象は本漬け開始から12ヶ月までのぬか床を1ヶ月おきにサンプリングした ものである。本漬け開始から2-3ヶ月で既に乳酸菌群が優占種となっていたが, その後発酵8ヶ月か ら9ヶ月目までは急激に細菌数も上昇する事が明らかになった。一方で発酵開始直後から3ヶ月目 まではLactobacillus sakeiが増殖しているものの, 8ヶ月では既にLactobacillus

malefermentasやPediococcus inopinatusなどが増殖している事がわかった。乳酸菌の菌種の入れ 替わりによって生じる違いを考察するため, これらの菌を単離し培養を行った。また発酵開11ヶ月以降ではMarinomonas属, Halomonas属など, Oceanospirillales目の細菌がサンプル中20%-70%を占める程に増殖していた。 これらの好塩菌はキムチ漬けからの報告はあるが, 日本の漬物からは分離されておらず, 沢庵漬け の発酵におけるこれらの菌の役割が注目される。近縁の細菌では抗菌作用を持つ例もあるので, 糠からこれらの菌を分離し, 種同定と抗菌活性等についての解析も行ってメタボローム解析の結果と共に議論したい。 Notes 慶應義塾大学湘南藤沢キャンパス先端生命科学研究会 2013年度学生論文集 卒業論文ダイジェスト Genre Technical Report

URL http://koara.lib.keio.ac.jp/xoonips/modules/xoonips/detail.php?koara_id=KO92001004-00000020 -0158

卒業論文ダイジヱスト

微 生 物 叢 解 析 及 び メ 夕 ボ ロ ー ム 解 析 か ら 探 る 沢 庵 漬 け の 発 酵 過 程 の 解 明

環 境 情 報 学 部 4 年 7 1 0 4 1 4 0 6 梅 田 栄 美

[email protected]

要旨

沢庵漬けは 大 根を 干し て米 糖と 塩で 漬け ，乳酸菌や酵母などの微生物による発酵させることによって作 ら れる日本の伝統的な漬物である. 本 研 究 で は 微 生 物 発 酵 の 仕 組 み を 理 解 す る こ と を 目 的 に ，沢庵漬 け の本漬 け の過 程に お け る 槺 床 中 の 細 菌 叢 の 変 化 及 び 沢 庵 漬 け 内 の メ タ ボ ラ イ ト の 変 化 を ，1 6 S r R N A クローンライブラリー解析，R T - P C Rにより細菌数の定量及びC E - T O F M Sによるメ夕ボローム解析を行 った. 解 析 対 象 は 本 漬 け 開 始 か ら1 2ヶ月 まで の ぬ か 床 を1ヶ 月 お き に サ ン プ リ ン グ し た も の で あ る .本 漬 け 開 始 か ら2 - 3ヶ月 で既 に乳 酸菌 群が優占種となっていたが、 その後発酵8ヶ月から9ヶ月目までは急 激 に 細 菌 数 も 上 昇 す る 事 が 明 ら か に な っ た. 一 方 で 発 酵 開 始 直 後 か ら3ヶ月目まではLoctoわadZ/ws•soto'

が増殖しているものの，8ヶ月では既にLdぬ m a/e/erm entoや尸etftococcws などが増殖し

て い る 事 がわ かった. 乳酸菌 の 菌種 の 入 れ 替 わ り に よ っ て 生 じ る 違 い を 考 察 す る た め ， これらの菌を

単 離 し 培 養 を 行 っ た. ま た 発 酵 開1 1ヶ月以降ではM arinom onos：属 ，//a/omonas属など、

目の細菌がサンプル中2 0 % ~ 7 0 %を 占 め る 程 に 増 殖 し て い た .こ れ ら の 好 塩 菌 は キ ム チ 漬 け か ら の 報 告

はあるが， 日本の漬物からは分離されておらず、沢庵漬 け の発酵 に お け る こ れ ら の 菌 の 役 割 が 注 目 さ れ

る. 近 縁 の 細 菌 で は 抗 菌 作 用 を 持 つ 例 も あ る の で 、糠 か ら こ れ ら の 菌 を 分 離 し ，種同定と抗菌活性等

1 .

背景 1 .1発酵食品と微生物 漬 物 は日 本の伝 統 的 な 発 酵 食 品 で あ り ，米糖に含まれる麹や乳酸菌が主にデンプンやタンパク 質 を分解し，糖 分や 乳酸 が生 成されていると考えられているが，野菜の種類や地域の違いによって様々 な製法が存在し， 味 の 違 いも大 き い. 昔 は 各家庭 で 日常的 に 漬物をっけて食しており， それだけ古くか ら 日 本 人 に 親 し ま れ た 発 酵 食 品 で あ る と 言 え る .し か し 漬 物 に お い て は そ の 発 酵 の 詳 し い 仕 組 み は 明 らかになっていない. J u n gらによって行われたキムチのメタゲノム解析では，発酵が進むにつれてシー クエンスされた配列のコピー数は増え， それとともに乳酸， 酢酸， マニトールの濃度が上昇しているこ とが報告されている[ 1】. こ の 時 優 位 な 細 菌 は ム ^ 〇6〇〇7/奶， 肠 如e//aな ど で あ っ た . こ のことから， 乳 酸 菌 が 漬 物 の 発 酵 に お い て 主 な 働 き を に な っ て い る こ と は 間 違 い な い を 言 え る.漬 物 以 外 の 日 本 の 伝統 的な 発酵 技術 では ， 味噌， 醤油 ， な ど 様々な 発酵食品の研究がなされているが[2]， 日 本 酒 の発 酵 の 研究も多く な されて い る[ 3 ] .味 噌 や 醤 油など は 大豆の 発酵である のに対 し， 日本酒は米 の発酵であるが， その日本酒の発酵過程におい て は乳酸 菌 が製造 の暖気入れ と呼ば れる工程で 増殖 し，発酵 が 進 むと 作ら れた 乳酸 菌に よっ て産 生 が 強くな り ， 乳 酸 の 増 殖 が 弱 り 始 め る .そ こ で 酵 母 を 添 加し， その生成するアルコールによってさらに乳酸菌は減っていく， という発酵のメカニズムが知ら れている. このように発酵が進むに連れて細菌叢が変化しており， その影響で食品の成分も大きく変化 し て い る.こ のこ とから発 酵 食 品 の 味 や 香 り に も 微 生 物 細 菌 叢 が 重 要 な 役 割 を に な っ て い る 事 が わ か る.

1.216S rRNA

クローンライブラリー解析 1 6 S r R N Aクローンライブラリ一法は次世代シーケンサーを用いて行う微生物叢解析において主 流 の 手 法 で あ る .本 手 法 の 最 大 の 利 点 は 培 養 を 介 さ ず に サ ン プ ル に 含 ま れ る 微 生 物 を 推 定 す る こ と が 出来るという点である. この手法により， 非常に多くの難培養性微生物についても解析対象とするこ とができる. 1 6 S r R N Aク ロ ー ン ラ イ ブ ラ リ 一 法 で は サ ン プ ル か らD N A を抽出後，D N A の 1 6 S r R N A 遺 伝 子 （1 6 S r D N A )の 一 部 をP C R によって増幅し， それをクローニングしたあと配列を解読すること でサンプル 中の 微生 物群 衆の 解析 し推 定を 行 う[ 4 ] . 1 6 S s R N Aの配列は非常に保存 性が高 く，難培養 性 の微 生 物 も 含め た広 範囲 の 生 物 に お い て 共 通 の プ ラ イ マ ー の 作 成 が 可 能 で あ る[ 1 0 ] .そ の た め16S r D N Aは生物種の同定や進化系統分析 にも 頻 繁 に使わ れ ている が， こ の16S r D N Aクローンラーブラ リ ー 法 に よ り 難 培 養 性 の 微 生 物 も 含 め た 環 境 サ ン プ ル 中 の 微 生 物 叢 を 正 確 に 知 る 事 が 可 能 に な る.本 研 究では 他 機種 に 比 べ て 長 い リ ー ド を 得 る こ と が 出 来 る と い う 理 由 か らR o c h e社製4 5 4 G S J rを用いて シークエ ンシングが行われている. この 手 法で は サンプル中に含まれる細菌を網羅的に推定することができ， その細菌叢を観察するのに 適している. そ の 一 方 で サ ン プ ル に 含 ま れ る 細 菌 の 絶 対 数 は わ か ら な い と い う 問 題 点 が あ る.し か し 発 酵過程の観察においては細菌数がどのように 変 化 してい る のかとい う点は 非常に重要 であり ，細菌数の 変 化 を 考 慮 し な い で 発 酵 過 程 に っ い て 考 察 す る こ と は 難 し い.そ こ で 本 研 究 で は 沢 庵 漬 け の 発 酵 過 程 において細菌数がどのように変化していくのかをR e a l T i m e P C R ( R T -P C R)を用いて定量的に観察するこ とで，実際 に発 酵が どの よう に進 んで いる の か を考察 し た.

2 .

対象と手法

2.1

対象

山形 県 鶴岡市の月山 パイロットファームでは沢庵など漬物を中心に野菜の発酵食品を製造して いる. 本 研 究 で 発 酵 さ せ る 時 間 ま た は 空 間 的 違 い に よ り 生 じ る 細 菌 叢 の 特 徴 を 探 る こ と を 目 的 に ，野 菜 の 発 酵 食 品 の16 S r R N Aク ロ ー ン ラ イ ブ ラ リ ー 解 析 を 行 っ た .解 析 対 象 と し た の は 大 根 沢 庵 の 本 漬 けから0 , 1，2 , 3 , 8 , 9 , 1 0，1 1，1 2ヶ月間経過した沢庵である. T a b l e 1. 本解析に用いた各サンプルの詳細 ■、 Position I v r m e m a n o n 〇〇：<^1 S i m p l e 0M 純 供 _{0 . 2 5} I M B i » 0 . 2 5 2M 一 2 0 1 1 . 1 2 J2 - 2 0 1 2 . 2 . 2S 0, 25 ハ.1 ^ ^i! !.!.：.；? ■ 0. 2 5 乂 ： 一 2 0 1 U 2J2 » 2 0 1 2 . 6 .25 0J 沾 ！ 9M — 2 0 1 1 , 1 2 . 1 2 ^ 2 0 1 2 , 9 . 1 9 i l i l l：! ^ 2 0 1U 2J2 - 2 0 1 2J0J0 _1 _丨丨!1|1:3丨議議_ _ _ _ _ _ _ 画 ! I M： 一 2 0 1 1 . 1 2J2 - 2 0I2J I.2? 0J 一 2 0 1 1 . 1 2 J2 - 2 0 1 2 J2.21 0J 2 . 3シークェンスデータの系統解析 シ ー ク ェンスデ一夕のクオリティ値の評価などの配列選択や，O T U作 成 ， アラインメント，及 び 配 列 の分 類 には，配 列 解 析 の 統 合 ソ フ ト で あ るQ i i m e ( h t t p ;// q iim _e_，o r g )を用いた[6 ]. F i g 1 に示す の は行っ た 配 列 処 理 の フ ロ ー チ ャ ー ト で あ る• まず始めに， プライマー及び各サンプルごとに付けら れ たタグ 配 列 の 認 識 ， す べ て の シ ー ク ェ ン ス デ ー タ の ク オ リ テ ィチヱック 及び短 い配列を行 う•ク オ リ ティー値は最低スコアを2 5とし， また長さが2 0 0 b p以 下 の 配 列はすべて 取り除 いた. O T U作成におい ては，U C L U S Tのアルゴ リズム を 用いて[7 ]，配 列 類似性 の ス レ ッ シ ュ ホ ー ル ド は0 . 9 7とした.アラ イ ンメントにはアラインメントツールであるP y N A S Tを用いた[8].こ れ は テ ン プ レ ー ト と な る 配 列 を デ 一 夕セットから選び， そのテンプレート配列に対してすベての配列でペアワイズアラインメントをとって い く 手法である. テンプレートの デ一 夕セ ットに はg r e e n g e n e s (h t t p :/ / g r e e n g e n e s .lb l,g o v )を用Vゝ[9]， ペアワイズアラインメント に はu c lu s tのア ル ゴ リ ズ ム を 用 い た. O T Uの系統分 類には ，R D Pの C la s s if ie rを 用い た[ 1 0 ] .なおこの時，配 列 の 類 似 性 が9 7 %以上の も の を 分 類 で き た と し た. F i g 1•バクテリアの系統解析 の フ ロ ー チ ャ ー ト

3•結果と考察 3 . 1バクテリアの系統

_

F ig 2は作成したO T Uを 門 レ ベ ル で 分 類 し た 結 果 示 している .既存 のデー タベースと の類似 性 が 9 7 % 以上のも の のみを分類で き たとみ な し， それ未満のものは” O t h e r」’の後に門以上のレベルで分類 できて い る結 果を示した. 分 類 で き た も の の 内 ，割 合 の 多 い1 5門を色分けし， その他の全体に占める 割 合 が 少 ない ものはO T H E Rとしてまとめた. バクテリアの系統解 析にお いて，0 - 3ヶ月のサンプルで 没 の 存 在 が 多 く 確 認 さ れ た . これはバクテリアではなく，広 義 の緑色 植物の分類 群であ る. バクテリアのシークェンスをしているにも関わらず； 植物のD N Aが検出された理由としては，発酵初期 段階においてはまだバクテリアが増殖しておらず； そのD N A量 が 少ない ために，米ぬかのD N Aが混入

し

X L

ま っ ナ こ の で は な い か

h

考 え ら れ る

.

まナこ

Cyanobacteria, Chlorvplast

，

Chroococcales

も 少 量 で は あ

るが分類されている. これらに関しても同様に米ぬかD N Aの混入により観察されたのではないかと考

えられる• そのためこの図から，

Straptophyta

，

Cyanobacteria

，

Chloroplast， Chroococcales <0

べ つ の 分 摄 卷

を 取り除 い て同様に積み上げグラフを作成した. グラフから， すべてのサンプルにおいて全体の9 0% 以 上 を分 類 で き てい る事 がわ かる. この結果から0 Mか ら1 2 Mまでの最初の1年 間 の 発 酵 で は ，細菌叢の 変 化が 多 く 見 ら れ ，2年 や3年 の長 期発 酵で は あ まり大 き な細菌 叢の変化が 見られ ないという 結果を 得 た. ム妨〇んぬ7/a/が は0 M時点ではほ とんど 存 在して い ないが ，1ヶ月たった1 Mのサンプルでは急激に そ の割 合 が 増 えて おり 既に 優占 して いる .こ の こ と か ら 乳 酸 菌 は 沢 庵 漬 け の 発 酵 に お い て 重 要 な 役 割 を 担っ て いることが予想される. 発 酵 の 後 半 段 階 で あ る1 1 M以降ではまたその割合は減少しており，逆 に が の 割 合 が 増 加 し て い る . は海洋性の好塩菌であり， 通常食品から 検 出 は さ れ な い .以 上 の こ と か ら

Lactobacilkdes

と

OseanosDirillales

の

2

点 に注百

'L X

解 析 を 行 っ ナこ

.

30% 20% I f I I I* f l f ^ I ■ ■ ■ l l l l 10% "和 0%私 2 3 8 9 XQ ax 12 月数 A 100% 90%

i

' . W to% tx% 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 0 1 2 3 8 9 10 u 12 月数 欲 OTHER ::

SjMinlsj^aerates

¥ BuHdK>ldef1a!es ^ Pseudomonadaies ^ Acttnomycetates ^ Flavobaderiates ：s Rhfeoblales ^ Sphingomonada)e$ ^ Atterom<mddates ^ Ent*M*obacleriales ^ Other^Sacterta 嫌 BaciHales ^Oceanospirilbles 嫌 Uctobadliates 雠 Other-Unclassified B

Fig 2 .

各サンプルごとにバクテリアの

OTU

を門レ ベ ル で分類した推定結果から

Straptophyta

，

Cyanobacteria

，

Chloroplaist， Chroococcales

を 取 ^)餘 い ナ こ も の

3 . 2発酵過程 に おける乳酸 菌の変 化 F i g 2か ら わかるよ う に， 乳 酸 菌(ム妨0みa d / t o Mは 発 酵 開 始 か ら1ヶ月で既に優占種となってい る が実際にその細菌数が増加しているかは確かめられない. そのためR T - P C Rを用いて細菌数の定量を 行 い ， さらにム妨〇6奶7ゎ/がを属レベルで分類した( F i g 3 ) .グラフから乳酸菌の細 菌数は発酵 開始か ら8 ヶ，9月目まで に 急激に増えて お り，逆 に そ れ 以降は 減 少して い ること がわかる. また発酵開始から3ヶ 月目まではZewcowo伽cge/zWwwや な ど が 優 占 種 と な っ て い る の に 対 し ，8ヶ月目以降で

は

JPediococcus inopinatus

や

Lactobacillus melefermentans

が 優 占 種 と な り ， 細 菌 種 の 入 れ 替 わ り が 起 き

X

い

る. ma/が r m e n t o r aは へ テ ロ発 酵 を 行 う 乳 酸 菌 で あ り ， ビールのから単離されている [ 1 3 ] .ム 加 ftadZ/ws伯たd も へ テ ロ発 酵 を行 う乳酸菌であり， ヨーロッパでは古くからソーセージの製 造 や 精 肉 の 保 存 に 利 用 さ れ て い る[ 1 4】. Je/f t r wecた/z•はヨーグルトなどの発酵に頻繁に使わ れ る 乳 酸 菌 で あ り ， ホ モ 乳 酸 発 酵 を 行 う[ 1

5

】. ま た

i^cto6ac///w1s

か

/

以

/vonm s

ヘ テ ロ発 酵 を 行 い ， アル コール強いことで知られている.そのため日本酒などに入り込むと酸イ匕を起こし濁りや臭みを生じさせ る[1 6】. ま た味 噌や ケチ ャッ プに もコ ン夕 ミするこ と で腐敗 を起こすと されて いる[1 7】. また と同様に尸汉 /iococcw sも8ヶ月経過以降のサンプルでは安定して多く観察されされている. Peぷ0⑶ は グ ラ ム 陽 性 の 四 連 球 菌 で あ り ， 乳 酸 の 他にC 0 2， アルコール，酢酸などの副産物を多量 に つ く る へ テ ロ 発酵を行 う細菌 属 である. ま た 複 数 の 属 の 細 菌 種 が 乳 酸 の ラ セ ミ 体 （D L体) を発酵することでも 知ら れて いる[ 1 8 ] [ 1 9 ] .乳 酸 菌 の ラ セ ミ 体 は 融 点 が 低 く ，常温でも粘り気があるの が 特 徴 で あ る. 今 回 発 見 さ れ た/ W/OCOCCMS /«0/W>2<3加 は ビ ー ル か ら 単 離 さ れ て お り[2 0】， この細菌が発 酵途中のビールにコンタ ミす ると ジア セチ ルの 濃 度が高 く なり，香りが損なわれることが知られている [ 2 1 ] .ジアセルはバターやチーズの匂い の 元にな っ ている 物 質であり ， これがキユウリの漬物では感じ ないような沢 庵独特の香 り を作っ て いると 考 えられ る. さらに8ヶ月以降のサンプルで次に多く観察さ れ て い る の が^ で あ る . は 海 洋 中 や 夕 イ 料 涅 の カ ピ と 呼 ば れ る 小 ェ ビ の 塩 漬 け か ら 見 つ か っ て い る 耐 塩 性 の 乳 酸 菌 で あ る .こ の よ う に 乳 酸 菌 の 種 類 や 増 減 が 沢 庵 漬 け の 発 酵 過 程 ，及 び 味 を 決 定 づ け る の に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る 可 能 性 が 高 い こ と が 示 さ れ た.

月数

A

350

300 250 200 150

100

50 1 1 1 1 0 1 2 3 8 9 1 0 1 1 1 2

月数

は

obadHaceae

Leuconostocaceae lactococcos WeisseHd Leuconostoc ' f_leuconostocaceae 凝 Pediococcus ■ Lactobacillus 纖 _Otheし_Lactobacil 丨 _aceae ^Tetragenococcus 雜 _Enterococcus ^ Other^Enterocoaaceae Carnobacteiium arinitactibaciltus ^Alkaiibaaerium ■ o— laaobaciilales ^ Other_laa〇bacillales B F ig 3. 各サ ン プ ルごとにムactofeaczY/a/esのO T Uを属レ ベ ル で分類した推定結果に R T - P C Rによって得られた細菌数を反映させた. 3 . 3

Oseanospinllales

先 程 も 述 べ た よ う に ， O從 門 の 細 菌 は 海 洋 性 の 好 塩 菌 で あ り ，通 常 は 食 品からは検 出されない. そ こ で 啊 >/此/烈門の細菌がサンプル中で増えている生物学的意味を探るため， 乳 酸菌と同様に1 0 ^ € 1 1を 用 い て 細 菌 数 の 定 量 を 行 っ た 奶8 4 ) .その結果， ひ^ « 〇^ > 7 7仏/以門の細菌は11 ヶ月目， もしくは1 2ヶ 月目以降に急激にその細菌数を増やしていることがわかった. （91sea«〇1s'/?z>///a/e1s 門の細菌のほとんどがMaWwomowos属 で あ る こ と が わ か っ た. M aW wom om s属 の 細 菌 に は ，抗菌作用を 持 つもの も 知られており[2 0]，沢庵漬けの後期の発酵において他の細菌の増殖を抑える役割を果たして いる可能性がある. 1 .0 0 E + 0 9 8 .0 0 E + 0 8 ^ 6 .0 0 E + 0 8 観 P 4 .0 0 E + 0 8 2 .0 0 E + 0 8 0.00E+00 y g-JViarinwnonas ^ Other g— Kushneria Halomonas ^ gHaererehalobacter ^g«jCc^>etia 級 g一Chromohalobacter 鑛 級 Other 纖 g一 和 canivorax 鑛 Other 月数 月数 F ig 3. 各サ ン プ ルご と にCream s/?か

///

a fe sのO T Uを属レ ベ ル で分類した推定結果に R T - P C Rによって得られた細菌数を反映させた.

Acknowledgements

本 研 究 に お い てデ一 夕 を取る た めの実 験 を行っ て くださ り、 また解析においても多くの適切な アドバイスを下さった中東憲治氏に厚く御礼申し上げます。 またこのような研究の場を与えてくださつ た冨田勝教授に深く感謝いたします。 あ り が と う ご ざ いまし た。

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