Development of a New Diagnostic System for Newcastle Disease Virus Infection

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Title

Development of a New Diagnostic System for Newcastle Disease

_{Virus Infection( 内容と審査の要旨(Summary) )}

Author(s)

Amira Ahmed Hassan Abdelaziz

Report No.(Doctoral

Degree)

博士(獣医学) 甲第382号

Issue Date

2013-03-13

Type

博士論文

Version

none

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/48008

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氏名(本(国)籍) 主指導教員名学位の種類学位記番号学位授与年月日学位授与の要件研究科及び専攻研究指導を受けた大学学位論文魅目審査委員 (19)

Amira Abmed Hassan _{Abdelaziz(エジプト･アラブ共和国)}

岐阜大学教授福士秀人博士(獣医) 獣医博甲第382号平成25年3月13日学位規則第3条第1項該当連合獣医学研究科獣医学専攻岐阜大学

Development _of a New Diagnostic System for

Newcastle Disease VirusInfection

(ニューカッスル病ウイルス感染の新規診断法の開発) 主査岐阜大学教授石黒直隆副査帯広畜産大学教授横山直明副査岩手大学教授原揮亮副査東京農工大学教授竹原一明副査岐阜大学教授福士秀人論文の内容の要旨ニューカッスル病(Ⅶ)はニューカッスル病ウイルス(NDV)により引き起こされ家禽に重大な被書をもたらす伝染性疾患である｡効果的な生および不活化ワクチンが世界中で用いられてい-るにもかかわらず,NDVは養鶏における脅威として存在し続けている｡様々な診断法が家禽における皿Ⅴ抗体検出のために開発された｡赤血球凝集阻止反応 (HI),全ウイルスELISA,サブユニットワクチンと組み合わせた大腸菌発現タンパク質, 憫按ファージELISAなどである｡HI試験は抗NDⅤ抗体検出における標準法であるが, ELISA法の方が高感度であるとされている｡しかし,HI試験および全ウイルスELISAは沌Ⅴ感染家禽と免疫家禽を鑑別することはできない｡理論的に,ウイルス感染鶏は構造タンパク質および非梢造タシバク質に対する免疫応答を示し,NDV不活化ワクチン接種鶏は非構造タンパク質に対する免疫応答を示さない｡そこで,NDVの非構造蛋白質であるⅤタンパク質に対する抗体応答はNDV感染の適切な診断指標になるとの仮説に基づき研究を行った｡本論文では,NDVのⅤタンパク質に対する抗体応答はNDV感染の適切な診断指卿こなるとの仮説に基づき研究を行った｡Ⅴタンパク質抗体を検出するため,組換えVタンパク質を抗原とする酵素抗体法(Ⅴ-ELISA)を朋発した｡本論文は2尊から柵成されている｡

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-158-節1帝ではNDVの診断抗原としてⅤタンパク質のC末端部分を用いた血清診断法 (Ⅴ-ELISA)を開発した｡Pタンパク貿のC末端部分を使ったELISA法(P-ELISA)も合わせ開発した｡Ⅴタンパク質遺伝子の3,末端配列およびPタンパク賀遺伝子の3'末端配列を増幅し,GST発現ベクターにクローニングした｡Ⅴタンパク質およびPタンパク質のC末端部分はGST との融合タンパク拝として発現させた｡融合タンパク質を精製し,GSTを除去した組換えⅤおよびPタンパク質を得た｡組換えタンパク質免疫により得た抗Ⅴおよび抗P血晒の特異性を確認した｡抗P血清は感染細胞可溶化物および精製ウイル粒子と反応した｡抗Ⅴ血泊は感染細胞可溶化物と反応したが,精製ウイルス粒子サンプルと弱い反応を示した｡Ⅴタンパク質をELISA抗原とした場合,抗Ⅴ血晴は Ⅴ-ELISAにおいて特異的に反応した｡同様にPタンパク質を抗原とした場合,抗P血清はP-ELISAにおいて特異的に反応した｡Ⅴ-ELISAおよびP-ELISAにおいて両抗血晴の交差反応はみられなかった｡V-ELISAは不括化ワクチン接種鶏を感染鶏と鑑別する血清学的な方法として用いることができる可能性が示された｡第2章では,新規開発されたⅤ-ELISAおよびP-ELISAを用い,家禽場飼育鳥におけるⅤ およびP抗原に対する抗体応答を評価した｡また,ワクチン鶏由来卵のIgY抗体価を測定した｡生ワクチン接種鶏および不活化ワクチン接種鶏はともにP抗原に対する抗体応答を示した｡生ワクチン接種鶏はⅤ抗原に対する抗体応答を示したが,不活化ワクチン接種鶏はⅤ抗原に対して弱い抗体応答を示した｡生ワクチン接種鶏,不活化ワクチン接種鶏および対象鶏由来卵のIgY抗体価は生ワクチン接種鶏由来卵においてⅤおよびP抗体価は同様に高かった｡不活化ワクチン接種鶏由来卵においてⅤおよびP抗体が検出されたが,Ⅴ抗体価はP抗体価よりも低かった｡生ワクチンおよび不括化ワクチン接種を受けた飼育鶏由来血消検体において,Ⅴ-およびP-ELISAにより,ⅤおよびP抗原に対する抗体応答が認められた｡ダチョウ血暗においてPおよびⅤ抗体が検出された｡これらの結果から,Ⅴ-ELISAがNDV感染家禽における抗体応答検出に用いうることが示唆された｡結論として,Ⅴ一ELISAにより不括化ワクチン接種鶏とNDV感染家禽の鑑別検出が可能であることが示された｡Ⅴ-ELISAは家禽におけるNDの対策および制御に有用であると考えられる｡審査結果の要旨本研究は家禽に重大な被害をもたらす伝染性疾患の一つであるニューカッスル病(ND) の新規診断法の開発を目的としている｡NDはニューカッスル病ウイルス(NDV)により引き起こされる｡赤血球凝集阻止反応(HI)は抗NDV抗体検出における標準法であるが,ⅧⅤ 感染家禽と免疫家禽を鑑別することはできない｡理論的に,ウイルス感染鶏は構造タンパク質および非構造タンパク質に対する免疫応答を示し,NDV不活化ワクチン接種鶏は非構造タンパク質に対する免疫応答を示さない｡そこで,NDVの非構造蛋白質であるⅤタンパク質に対する抗体応答はNDV感染の適切な診断指標になるとの仮説に基づき研究を行った｡Ⅴ タンパク質抗体を検出するため,組換えⅤタンパク質を抗原とする酵素抗体法(V-ELISA) を開発した｡本論文は2牽から構成されている｡

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-159-第1章ではNDVの診断抗原としてVタンパク質のC末端部分を用いた血清診断法(トELISA) を開発した｡Pタンパク質のC末端部分を使ったELISA法(P-ELISA)も合わせ開発した｡ Vタンパク質遺伝子の3,末端配列およびPタンパク質遺伝子の3,末端配列を増幅し,GST発現ベクターにクローニングした｡Vタンパク質およびPタンパク質のC末端部分はGSTとの融合タンパク質として発現させた｡融合タンパク質を精製し,GSTを除去した組換えⅤおよびPタンパク質を得た｡組換えタンパク質免疫により得た抗Ⅴおよび抗P血清の特異性を確認した｡抗P血清は感染細胞可溶化物および精製ウイル粒子と反応した｡抗Ⅴ血清は感染細胞可溶化物と反応したが,精製ウイルス粒子サンプルと弱い反応を示した｡Ⅴタンパク質をELISA抗原とした場合,抗Ⅴ血清はⅤ-ELISAにおいて特異的に反応した｡同様にPタンパク質を抗原とした場合,抗P血清はP-ELISAにおいて特異的に反応した｡V-ELISAおよびP-ELISAにおいて両抗血清の交差反応はみられなかった｡Ⅴ-ELISAは不括化ワクチン接種鶏を感染鶏と鑑別する血清学的な方法として用いることができる可能性が示された｡第2章では,新規開発されたⅤ-ELISAおよびP-ELISAを用い,家禽場飼育鳥におけるⅤおよびP抗原に対する抗体応答を評価した｡また,ワクチン鶏由来卵のIgY抗体価を測定した｡生ワクチン接種鶏および不活化ワクチン接種鶏はともにP抗原に対する抗体応答を示した｡生ワクチン接種鶏はⅤ抗原に対する抗体応答を示したが,不活化ワクチン接種鶏はⅤ抗原に対して弱い抗体応答を示した｡生ワクチン接種鶏,不活化ワクチン接種鶏および対象鶏由来卵のIgY抗体価は生ワクチン接種鶏由来卵においてⅤおよびP抗体価は同様に高かった｡不活化ワクチン接種鶏由来卵においてⅤおよびP抗体が検出されたが,Ⅴ抗体価はP抗体価よりも低かった｡生ワクチンおよび不括化ワクチン接種を受けた飼育鶏由来血清検体において,Ⅴ-およびP-ELISAにより,ⅤおよびP抗原に対する抗体応答が認められた｡ダチョウ血清においてPおよびⅤ抗体が検出された｡これらの結呆から,Ⅴ-ELISAがNDⅤ感染家禽における抗体応答検出に用いうることが示唆された｡結論として,本論文の研究成果からⅤ-ELISAによりNDV感染家禽を検出することができることが示された｡Ⅴ-ELISAは家禽におけるNDの対策および制御に有用であると考えられた｡以上について,審査委員全員一敦で本論文が岐阜大学大学院連合獣医学研究科の学位論文として十分価値があると認めた｡基礎となる学術論文 1)題目:Establishmentofnon-StruCturalV&structuralPprotein-BasedELISAs for detection _of Newcastle disease _{virusinfection}

著者名:Abdelaziz,A.,Guo,X.,Hashimoto,W.,Ohya,K.and Fukushi,H.

学術雑誌名:TheJournalof Animaland Veterinary Advances

巻･号･貫･発行年:印刷中