博 士 （ 医 学 ） 高 橋 学
学位論文題名
Isolation and Culture of Human Hepatocytes from Resected Liver Tissue asaBioreactor foraHybrid Artificial Liver
（ハイブリッド型人工肝のバイオリアクターとしての ヒト肝細胞の分散および培養法に関する研究）
学位論文内容の要旨
I．緒 言
培養肝細胞を用いた人工肝は肝不全の治療方法として期待されている。教室ではコラーゲン コートしたガラス板上に単層培養した肝細胞を積層したハイブリッド型人工肝を開発し，無肝犬 の生存時間を3倍延長させることに成功し，また，ブ夕肝細胞を用いた人工肝による無肝家兎の 生存時間の延長を認め，この積層型ハイブリッド人工肝は臨床応用に向け期待できる有用なシス テムであることを報告してきた。さらに，培養ブ夕肝細胞は正常ヒト血漿および肝不全ヒト血漿 中でも十分に機能することを証明し，培養異種肝細胞のバイオリアク夕一としての応用の可能性 を報告してきたが，異種動物の肝細胞を使用するには，現在のシステムでは免疫学的問題，未知 のウイルス感染，倫理的問題などの解決しなければならない諸問題がある。これらの諸問題の解 決のためには，ヒト肝細胞をバイオリアクターとして使用することが最善の策と考えられる。今 回われわれは，手術時切除肝より得られた正常肝組織からヒト肝細胞の単離およびその培養方法 にっいて検討した。
u．材料と方法
1．肝組織：ヒト肝組織は肝切除を施行した8例の切除肝の非病変部より得た。原疾患は，肝多 胞虫 症3例， 肝血 管 腫2例，肝膿瘍1例，FNH1例，転移性肝癌1例 であり，全例非病変部は 正常の肝組織であった。患者の年齢は12歳から69歳までであった。実験のために使用した肝組織 の重量は10gから65gであった。また，術中阻血から肝組織採取までの温阻血時間を測定した。
2．肝細胞単離方法：肝細胞の単離は2群に分け検討した。
I群 （n= 3)： 初 め に ，EGTAを 含 む37℃ のCa2十‑free Hanks液 （ 前 灌 流 用 緩 衝 液 ） を 約10分の 間完 全に肝 組織が 脱血さ れる まで灌 流した 。灌流 は18ゲ ージの カテ―テルをっけたシリ ンジ を 用 い ， 肝 組織 切 離面の 挿入可 能な全 ての 脈管に カテー テルを 挿入し て行 なった 。次に ， O． 05％ コラゲ ナーゼ 溶液を 約13分間灌流し肝組織が消化された後にメスにて細切した。その後，
コラゲ ナ―ゼ 溶液 中にて 約18分振 盪し て肝細 胞を分 散した 。
H群 （nー5):初 めにI群 と 同 様に 前 灌 流 用 緩衝 液 に て 肝 組 織を 瀧 流 し た 。次 に ，0．05％ コ ラゲ ナ ー ゼ お よ びlOOOPU/mlディ ス パ ー ゼ を含 む 緩 衝 液 にて 約5分 間 灌流 し た 後 ，O．05％コ ラゲ ナ ― ゼ 溶 液 にて 約7分間 灌流 した。 最後にI群 と同様 に消化 され た肝組 織をメ スにて 細切し て肝細 胞を分 散し た。
I群 お よ びH群 と も ， 分散 さ れ た 肝 細 胞は 濾 過 後 ，soxgの 遠心 操 作 で 分 離し ， 肝 組 織1g当 り の 肝 細 胞 収 量 お よ び ト リ パ ン ブ ル ー を 用 い た viabilityを 測 定 し た 。 3． 肝細胞 培養方 法：単 離さ れた肝 細胞は ，コラ ーゲン コー トした プラス ティッ クデ ィッシ ュ上 に2x l05cells／0. 2ml/cnfの 細 胞 密度 で 播 種 し た 。培 地 はWilliams E（WE)を 使 用 し ，イ ン ス リ ン(10‑8M)， デキ サ メ サ ゾ ン(10‑8M)， 胎 児 牛血 清(10％ ） を 加 え た。3時 間 培 養し 肝 細胞が 十分に 接着 伸展し た後，培地をインスリン（10‑。M），デキサメサゾン（10‑ 8M），グルカ ゴ ン （10‑ M） ，EGF（7ng/ml)を 合 むWEに 交 換 し 培 養 を 続 け た 。24時間 培 養 し た 後， 培 地 をWEとLeibovitzL一15（L―15)培 地 の2種 類 に 分 け て ， 培 養 ヒ ト 肝 細 胞 の 機 能 検 査 を 行なっ た。
4． 検討項 目：
1） 肝 細 胞収 量 お よ びviability：lgあ た り の 切除 ヒ ト 肝 組 織よ り単 離さ れた肝 細胞の 収量 お よ び 単 離 直 後 の 肝 細 胞 の viabilityをI群 とII群 問 で 比 較 検 討 し た 。 2)温阻 血時間 と単離 肝細胞 ：温 阻血時 間が単 離され たヒ ト肝細 胞の収 量およ びそのviability に与 える影 響を検 討した 。
3)培 養 ヒ ト 肝 細 胞 お よ び そ の 機 能 ： 播 種 後2，5，7，10日 目 に 測 定 し た 。 a) DNA量 ：肝細 胞の量 的な維 持の 指標と してDNA量を 測定し た。
b)糖 新 生 能 ：Hanks液 中 に2mMア ラ ニ ン と2mM乳 酸 を 添 加 し た 溶 液 中 で90分 間 肝 細 胞を 培養し 肝細胞 にて合 成さ れた糖 の濃度 を測定 した 。
c)尿 素 合 成 能 ：5mM塩 化 アン モ ニ ウ ム を 添加 し たHanks液 中 で90分 間 肝 細胞 を 培 養 し ， 肝細 胞にて 合成さ れた尿 素の 濃度を 測定し た。
b)，c)の 結果は 単位DNAあ たりの 量で示 した。
m．結 果
1．単 離ヒト 肝細 胞収量 とそのviability：肝細 胞収 量はI群でO．94土0．74X 106，II群で13. 31 土7． 94 x10°細 胞 ／g肝 臓で あ り ，H群で の 細 胞 収 量はI群 の 約15倍 と有 意に高 かっ た（pく 0． 05)。viabilityでは 両者間 に有 意差を 認めな かった 。
2． 温 阻 血 時間 の 影 響 ： 切 除肝 か ら 得 ら れた 肝 組 織 の 温阻 血 時 間 はO分 から90分（ 平均29.4土 30.6） であ っ た が ， 単離 肝 細胞の 収量，viabilityには 差を認 めなか った。 しかし ，I群の肝 細 胞 は す べ て 温 阻 血 時 間 が 短 か っ た に も か か わ ら ず 収 量 は 低 い 傾 向 に あ っ た 。 3．・ 培養肝 細胞 および その機 能
a）DNA量 ：WEで 培 養 し た 肝 細 胞 のDNA量 は2日 目 でO．616土O，338，10日目 で0．637土 O． 373朗g／ 甜 で あ り ， ま たL―15で 培 養 し た 肝 細 胞 のDNA量 は ，2日 目 でO．607土 O． 376，10日 目 でO．752土O．289〃g／ 面 で あ り， こ の2種 の培 地 間 で 有 意 差を 認 め ず DNA量 は10日間 維 持 さ れ た。 ま た 形 態 学 的に も 線 維 芽 細胞 な ど の 混 入は な く 期 間 中培 養 肝細胞 は密 な単層 を形成 してい た。
b） 糖 新生 能 ：WEで培 養 し た 肝 細胞 は2日 目 で38. 94土32. 93，10日目 で33. 36土18. 10ng/
ヰg DNA/minで あ り ， ま たL―15で 培 養 し た 肝 細 胞 は ，2日 目 で39. 21土45. 18，10日 目 で21. 09土15. 62ng/〃gDNA／minで あ り ， い ず れ の 培 地 で も 有 意 差 は な く， 高 水 準で10日間は 維持さ れた。
c）尿 素合成 能： WEで培 養し た肝細 胞は，2日 目で2．84土1．19，10日 目で1．44土O．38ng／ 〃g DNA7minで あ り ， ま た ，L―15で 培 養 し た 肝 細 胞 は，2日 目 で2．38土1．31，10日 目 で2． 18土0．79ng／ 〃gDNA/minで あ り ， 使用 し た2種 の培 地 間 で 有 意差 を 認 め ず ， 尿素合 成能 も測定 を行な った10日間は 高水準 で維持 されて いた 。
IV.考 察
ヒトの 肝組織 はラッ トに比 べ硬 く分散 が困難 であり ，肝 細胞分 散のた めに，これまでいくっか の 方法が 試み られて きた。 今回わ れわ れは， ラット などの 肝細胞 分散 に最も一般的に使用されて い るコラ ゲナ ーゼ灌 流法と ，コラ ゲナ ーゼと ディス パーゼ 混合液 の灌 流法の2通 りの方 法を試 み た 。後者 の収 量は前 者の約15倍で あルヒ ト肝細 胞の分 散に はコラ ゲナー ゼとディスパ―ゼの混合 液 の灌流 法が 優れて いるこ とが判明した。本研究でヒト肝細胞の分散に対し，コラゲナーゼとディ ス パ ー ゼ 混 合液 の 灌 流法 がコラ ゲナー ゼ単 独より 優れて いるこ とか 初めて 証明さ れたこ とにな る 。
肝組 織に 対する 温阻血 時間と ヒト肝 細胞 培養に 関する 報告は これ まであ まりなされていない。
心 停 止後約1時 間の剖 検例か ら得 られた 肝臓か らの肝 細胞の 分散 培養法 に関す る報告 があ るが，
収量 は3 x10°細 胞／g肝臓 であり ，われ われの90分温 阻血肝 組織か ら得 られた肝細胞収量（12． sxio° 細 胞 ／g肝 臓 ） の 約4分 の1で あっ た 。 こ れ は，そ の肝細 胞分 散にコ ラゲナ ーゼ単 独で 灌 流を 行なっ ており ，そ の上剖 検例よ り得ら れた 肝臓は 単純に 温阻血 だけの 影響を受けているわけ でな く，そ の経過 中死 戦期が あり， 肝に対 して 損傷が 加わっ ている ものと 考えられ，その結果収 量が 低かっ たもの と考 えられ る。， ヒトの肝臓は手術中の温阻血に90分までは耐え得るとの報告が ある が，今 回のわ れわ れの結 果から も肝細 胞は90分の温 阻血の 上に 酵素消 化という負荷にも十分 耐え 得ると 考えら れた 。
ヒ ト 肝 細 胞 の 培 養 で は ， わ れ わ れはWEとLー15の2種類 の 培 養 液 を使 用 し ， ま た ，ブ タ ， ラシ トなど の肝細 胞培 養にお いて機 能発現 に適 してい るとさ れてい るホル モン類を添加した。肝 細胞 の機能 の指標 とし て糖新 生能と 尿素合 成能 を検討 したが ，いず れの培 地を用いても肝細胞機 能 は10日 間 高 水 準に 維 持 さ れ た。 ま た ，DNA量 も この 期間中 良好に 維持 され， 顕微鏡 におけ る 観察 におい ても密 な単 眉を維 持し， 培養肝細胞の機能評価を裏付ける結果であった。すナょわち，
培養 ヒト肝 細胞の 機能 発現に は，他 の肝細 胞と 同様に ホルモ ン類の 添加が 必要であると考えられ た。
V.結 語
手 術によ る切除 肝より 得ら れた肝 組織か らのヒ ト肝 細胞の 分散法 と培養 肝細胞機能を検討し，
以下 の成 績を得 た。
1．肝 細胞の 分散に は，コ ラゲナ ーゼ 単独よ りもコ ラゲナ ーゼ とディ スパー ゼの混 合液に よる 濯 流法が 優れ ており ，約15倍 の収 量を得 た。
2． 温 阻 血 時 間 が90分 ま で で は ，単 離 肝 細 胞 の収 量 お よ びviabilityに 影響 は な か っ た 。 3，ヒ ト 肝 細 胞 の培 養 で は ，WEお よ びLー15培 地 にイ ン ス リ ン ， デキサ メサゾ ン，グ ルカゴ ン ，EGFを 添 加 し た も の で 培 養 す る と ，10日 間 は 培 養 肝 細 胞 機 能 を 維 持 で き た 。 以 上より ，今回 報告し た方 法によ って分 散培養 され たヒト 肝細胞 は，ハ イプリッド型人工肝の バ イ オ リ ア ク タ ー と し て 十 分 機 能 が 期 待 で き る も の で あ る と 考 え ら れ た 。
学位論文審査の要旨 主 査 教 授 内 野 純 一 副 査 教 授 安 田 慶 秀 副 査 教授 宮 m 竒 保
肝不全に対する肝機能の補助を目的に培養肝細胞をバイオリアクターとして用いるハイブリッ ド型人工肝は有効な冶療方法として期待されている。教室ではガラス板上に単層培養した肝細胞 を積層したハイブリッド型人工肝を開発し，無肝動物の生存時間を延長させることに成功し，さ らに培養ブ夕肝細胞は肝不全ヒト血漿中でも十分に機能することを証明し，培養異種肝細胞のバ イオリアクターとしての応用の可能性を報告してきた。しかし，異種動物の肝細胞を使用するに は，現在のシステムでは免疫学的問題，未知のウイルス感染，倫理的問題などの解決しなければ ならない諸問題がある。これらの諸問題の解決のためには，ヒト肝細胞をバイオリアク夕一とし て使用することが最善の策と考えられる。今回申請者は，手術時切除肝より得られた正常肝組織 からヒト肝細胞の単離およびその培養方法にっいて検討した。
材料と方法：ヒト肝組織は肝切除を施行した8例の切除肝の非病変部より得た。全例非病変部 は組織学的に正常の肝組織であった。実験のために使用した肝組織の重量は10gから65gであつ た 。 ま た ， 術 中 温 阻 血 か ら 肝 組 織 採 取 ま で の 温 阻 血 時 間 を 測 定 し た 。 ヒト肝細胞の単離方法は2群に分け検討した。
I群：初め に，EGTAを合む37℃のCa2十 ーfree Hanks液（前灌流用緩衝液）を肝組織切離 面の挿入可能な全ての脈管にカテーテルを挿入してシリンジを用いて灌流し，次に，コラゲナし ゼ溶液を灌流し消化された肝組織をメスにて細切した。その後，コラゲナーゼ溶液中にて振盪し て肝細胞を分散した。
II群：初めに，I群と同様に前灌流用緩衝液にて肝組織を灌流した。次に，コラゲナーゼおよ びディスパーゼを含む緩衝液にて灌流した後，さらにコラゲナーゼ溶液にて灌流し，最後にI群 と同様に消化された肝組織をメスにて細切して肝細胞を分散した。
I群およびu群とも，分散された肝細胞は濾過後，遠心操作で肝細胞を分離し，肝組織lg当 たりの肝細胞収量およびトリパンブルーを用いたviabilityを損lJ定し，比較検討した。また，温 阻 血 時 間 が 細 胞 収 量 お よ び viabilityに 与 え る 影 響 に っ い て 検 討 し た 。 単離された肝細胞は，プラスティックディッシュ上で培養した。培地は Williams E（WE）
を使 用 し，イ ンスリ ン， デキサ メサゾ ン，胎 児牛 血清を 加えた 。3時間培 養し肝 細胞が 十分 に接 着 伸 展 した の ち ， 培 地 をイ ン ス リ ン ，デ キ サ メ サ ゾン ， グ ル カ ゴン ，EGFを含 むWEに 交換 し 培 養 を 続 け た 。24時 間 培 養 し た の ち ， 培 地 をWEとLeibovitzL−15（L一15)培 地 の2種 類 に 分 け て ， 培 養 ヒ ト 肝 細 胞 機 能 と し てDNA量 ， 糖 新 生 能 ， 尿 素 合 成 能 を2，5，7，10日 目 に測定 した。
結果： 肝細 胞収量はI群で0． 94土0．74 xlo°，H群で13. 31土7．94 x10゜細胞／g肝臓であり，
1I群 での 細胞 収量はI群 の約15倍 と有意 に高 かぅた （pくO，05)。viabilityでは 両者間 に有意 差 を認 め なかっ た。温 阻血 時間は0か ら90（平 均29.4土30.6）分 であっ たが， 単離 肝細胞 の収量 ， viabilityには差 を認め なか った。
培 養 肝 細 胞 のDNA量 ， 糖 新 生 能 ， 尿 素 合成 能 は 測 定 した10日 間 は使 用 し た2種の 培 地 間 で 有意差 なく， 高水 準で維 持され た。
以上よ り， 肝細胞 の分散 には， コラ ゲナー ゼ単独 よりも コラゲ ナー ゼとデ ィスパーゼの混合液 によ る 灌流法 が優れ てお り，90分 までの 温阻 血時間 では， 単離肝 細胞 の収量 およびviabilityに 影 響 を 与え な い こ と が 明ら か に な っ た。 ま た ヒ ト 肝細 胞 の 培 養 ではWEお よ びL―15培 地に イ ンス リ ン ， デ キ サメ サ ゾ ン ， グル カ ゴ ン ，EGFを 添加 したも ので培 養する と， 培養肝 細胞機 能 を10日間 維持 するこ とが判 明した 。
以上よ り今 回の方 法によ り分散 培養 された ヒト肝 細胞は ，ハイ ブリ ッド型 人工肝のバイオリア クター として 十分 機能が 期待で きるも のであ ると 考えら れた。
審 査 に 当 たっ て ， 宮 崎 教授 よ ル ト ラ ン スフ ェ リ ンとHGFの培 養肝細 胞に およば す影響 にっい て，安 田教授 より ，培養 肝細胞 を用い たハイ ブリ ッド型 人工肝 の臨床 応用 に向けての問題点など に関し て，ま た， 武市教 授より 培養肝 細胞の 長期 機能維 持に関 してな どの 質疑があったが，申請 者はお おむね 妥当 な回答 を行な った。
ヒト肝 細胞 の分散 方法に っいて ディ スパー ゼとコ ラゲナ ーゼ混 合液 の灌流 が優れていること，
また ，90分ま での肝 組織の 温阻血 ではヒ ト肝 細胞の 収量お よびviabilityに 影響 がなく ，ヒト 肝 細胞の 機能を10日間 維持す ること を示 した報 告はな く，培 養ヒト 肝細 胞のハ イブリッド型人工肝 のバイ オリア クタ ーとし ての応 用の可 能性が ある ことを 示した 点で意 義が あり，学位授与に値す るもの と考え る。
