博 士 （ 薬 学 ） 根 岸 洋 一
学 位 論 文 題 名
c ・ myc 遺 伝 子 DNA 複 製 開 始 ／ 転写調節夕ンノくク質の同定と機能解析
学位論文内容の要旨
c‑myc遺伝子は、癌細胞で発現レ ベルが高く、正常細胞においても細胞周期に依 存 した 発現 レベ ル の上昇が認められる。これまでに、mycタンパク質の機能は、細 胞増殖や 分化、アポトーシス（プログラムされた細胞死）、癌化に関与し、核内にお い てDNA複製 や転 写開 始に おけ る様 々な 制御 が 示唆 され てい るが 、詳 細な機能に ついて未 だ明らかにされていない。
当 研 究 室 で は 、 ヒ トc‑myc遺 伝 子 の 第1エ ク ソ ン の 約2キ ロ 塩 基 対 上 流 の Hindlll‑Pstl領 域 内にTCTCTTAT配列 を含 むエ レメ ント がDNA笈製 開始 及び転写調 節 に必 須で あり 、 そのエレメントにc‑mycタンパク質を含む複合体が結合すること を 明 ら か に し て き た 。 又 、SV40‑DNA複 製 開 始 領 域 のDNA塩 基 配 列 を 部 分 的 に TCTCTTAT配 列 に 変 換 し た 場 合 で もSV40のDNA複 製 活性 があ るこ と を示 した 。そ こ でTCTCTTAT配 列 に結 合す るc‑myc タ ンパ ク 質複 合体 の性 状と 機能 を解析する こ と がDNA複 製 或 る い は転 写調 節機 構 の解 明に っな がる と考 え、c‑mycタン パク 質 の 会 合 タ ン パ ク 質 の 同定 及びcDNAクロ ーニ ング を行 ない 、そ の 機能 につ いて 解析した ので以下報告しますd
過 去、 我々 を 含む様々なグループによりc‑mycタンパク質と様々なタンパク質 とが複合 体を形成することが報告されてきた。
特 に、Maxタ ンパ ク質 は、 ロイ シン ジッ パ― を介してc‑mycタンパク質と複合体を 形 成し 、当 研究 室 で報 告し てき た配 列と は、 全ったく異なった塩基配列、即ち、
CACGTGと い う 結 合 配 列 （CM‑1配 列） を認 識し ます 。CM‑1配 列を 有 する 遺伝 子と し てECA39と いう 未分 化細 胞特 異的 な遺 伝子 が見い出され mycにより活性化され ま すが 、Maxタン パク 質と の複 合体 形成 によ る 活性 化は 、認 めら れま せん。又、
myc/m餌の正常細胞での標的遺伝子は まだ，解明されていない。そこで本研究におき ま して 当研 究室 で 報告してきた cImyc夕ンパク質複合体の結合配列，´rTのMTと myc/m餌の結合する配列、CM．1配列を用い、cImycタンパク質複合体の性状を比較検 討した。 その結果、両配列に結合するタンパク質複合体はc．mycタンパク質を含む こ とが 示唆 され た 。又 、myc（H‐P）コ ア配 列には分子量約84kI冫aのタンパク質 が、CM―1配列には84kDaと88kDaのタ ンパク質が結合していることが判明し、この両 者塩基配 列に結合するc‐mycタンパク質複合体に関して以下の説 明が可能となる。
即 ち、 cImyc夕 ンパク質は、複 合体を形成する会合タンパク質によって異なった m弧 塩基 配列 を特 異的に認識し、 少なくともmyc（H‐P）コア 配列にはCM．1配列に 結 合す る複 合体 （omyリM餌 タン パク 質） とは 異なったタンパク質複合体を形威し ていると 考えられた。
一般 にI）NA複製や転写開始には、I）N結合夕ンパク質による二本鎖I）NAの認．
識後、そ の領域が開裂し、I）NAやRNAの伸長反応が行なわれると 考えられている。
そこで更 に、同様の配列に複製や転写調節に関与すると考えられ る塩基配列特異的 な 一本 鎖DN´結 合 タン パク 質の 有無 を調 べる ため、 myc（HIP）21配列の一本鎖 I）NAをプローブとしヒト前骨髄球白 血病由来Hし60細胞の粗核抽 出物を用いてバン ドシフト 法及びサウスウエスタン法により解析を行なった。その結果、 myc（H．P
）21配 列の プラ ス 又は マイ ナス 一本 鎖DNAに 塩基配列特異的 結合する8種類の異な る 分子 量の タン パ ク質群が同定され、これらのタンパク質をMSSP（c．nlycgene― 血glei缸andbin出g凹teins）と命名した。このうち幾っかの複合 体は抗cーmyc抗体
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に よ り 複 合 体 形 成 が 阻 害さ れ る こ とか ら 、1本 鎖 上 にお い て も2本 鎖 と同 様 に c‑mycタン く ク質 複合体が 結合し ているこ とが判 明した。 そこでMSSPのcDNAを単 離 す る 為 にHI丿160細 胞のcDNAラ イ プ ラリ ― を 用い 、myc (H‑P) 21配 列 の1本 鎖 DNAを プ ロ― プ と して サ ウ スウ エ ス タン 法 に より cDNAク ロ― ニ ン グを 試みた 。 得られ たクロ― ン、MSSP‑1は 、全長1，116 bpのopen reading frameはを持ち372ア ミ丿酸 残基から 成ると推測された。アミノ酸レベルでのコンピュー夕―相同性検索を 行 な っ た と こ ろ 、 部 分 的 にRNA結 合 タ ン パ ク 質 や1本 鎖DNA結 合 タ ン パ ク 質 と 相同 性 を 有し 、RNP‑コ ンセ ン サ スモ チ ― フが見 いだされ た。又 、大腸菌 内で発 現 及 び 精 製 し たMSSP‑1/GSTを用 い た 結果 よ り 、MSSP‑1タ ンパ ク 質 は、myc (H‑P
） 21配 列の2本 鎖及び プラス 又はマイ ナス1本鎖に 塩基配列 特異的 に結合し 、その 認 識 配 列 はAll' CT All'AITTで あ る こ と が 判 明 し た 。 又 、MSSP‑1が 細 胞 周 期 に 依存 し た 発現 を し てい る か をラ ッ ト3Yl細 胞を 無 血 清 培地 内 で 培養 し た同調細 胞 を 用 い 、 丿 一 ザ ン ブ ロ ッ ト 法 に よ り 解 析 し た 。結 果 よ り細 胞 周 期のG1からS 期 に、 ー 過 性の 上 昇 が認 め ら れた 。 又 、臓 器 に おい て は 、c‑mycと の 協調 発現、
即 ち、c‑mycの 発現 し て いる 臓 器 での み 認 めら れcImycと の協調 発現が確 認された O こ れ ま で に 当 研 究 室 に お い てSV40‑DNA複 製 開 始 領域 内 のAT rich配 列 に分 子量約50kDaのタンパク質、SOAP (SV40‑myc origin assocmcdprotein）が結合している こ とを 報 告 した 。 又 、 A．Trich配 列 は、Tの口rAT配列に 機能上 変換可能 なこと か ら、MSSP11とSの廿 は類似 のタンパ ク質であ る可能 性か考え られた 。そこで 、両 者 タ ン パ ク 質 のmn結 合 能 及 び 細 胞 周 期 で の 発 現 に つ い て 比 較 し た 結 果 、 MSSP．1と SOAPは 同 一 か 、 極 め て 類 似 の タ ン パ ク 質 で あ る と 考 え ら れ た 。 前 述 し た 様 にTCTCnAT配 列 、 ． 即 ちMSSP＿1結合 配 列 がDNA複製 開 始 に 必須 である ことを報 告して きた。そ こでMSSP一1タン パク質 が塩基配 列に依存 したDNA複 製 能を 有 す るか を 調 べる 為 、 ．TのIcrrAT配 列 に 依 存し たSV40の 複製 モ デルを用 い て 検 討 し た 。 そ の結 果 、TcrCHAT配 列 を持 っ プ ラス ミ ド に対 す るm弧 複 製 活性 はMSSP．1発現ベ クターの添加量に応じて増強していることが判り、 MSSP．1タンパ ク質は 、DNA複 製促進 因子であ ること が明らか となった 。さら に、MSSP‐1夕ンパク 質がc‐myc遺伝子H‐P領域内 の塩基 配列に依 存した転 写調節 をしてい るか否かを調 べ る た め 、 TCrcHA塩 基 配 列 を含 むmyc（H‐P）21配 列 をhetemなSV40プ ロ モ ― 夕一とルシフェラーゼ遺伝子を持っプラスミドに連結し、 MSSP‐1発現ベクタ―と共 にHch或 い はCHO細 胞 に導 入 し ル シフ ェ ラ ―ゼ ア ッ セイ を 行 なら た 。 その 結 果 、 SV40プ ロモ ー 夕 ―に作 用し、 そのレペ ルが高く 、myc（H．P）21配列への 依存性は 明らか でなかっ た。MSSP．1タン パク質 結合配列と相同性の高い配列を検索したとこ ろSV40プ ロ モ ― 夕 ー 領 域 内 のTATAboxと 重 複 す るATrich配 列 で あ る と 推 測 さ れ 、 そ の 配 列 を 欠 損 さ せ る とMSSP‐1に よ る 活 性 増 強が 見 ら れな い こ とか ら 、 A1丶rich爪虹Aboxに依存して転写活性を促進し、MSSP‐1タンパク質が転写調節因子で あることが判明した。
次にMSSP‐1タ ンパク質 の他の バイオロ ジカルな機能としてトランスフォ―ミン グ 能に つ い て検 討 し た。 そ の 結果 、MSSP‐1は 、ras｀mycに よ る トラ ン スフォ―
ミング 能を促進 したが 、MSSP‐1単独で は活性促進は認められなかった。この結果は
、MSSP‐1がプロ モー夕 ―に作用 した為 でなくcImycとの 何らかの 協調作 用によるた めと考えられた。
以上、 本研究の 結果よりMSSP．1タンパク質は、cImyc、転写開始因子などと相互作 用するm仏複製′転写調節因子であることが明らかとなった。
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学位論文審査の要旨 主査
副査 副査 副査
教 授 教 授 助教授 助教授
有賀寛芳 横沢英良 近藤博之 沢田 均
学 位 論 文 題 名
c ・ myc 遺 伝 子 DNA 複 製 開 始 ／ 転写調節夕ンノくク質の同定と機能解析
cーmyc遺 伝子は 殆ど全て の癌細 胞で発現 高進をし ているばかりでなく、増殖期の 正 常 細胞 で 発 現し て お り、細 胞増殖 、細胞癌 化との 関連で多 くの研究 がなさ れて きた が今だに その分 子機能は 不明の 点が多い 。c−mycタンパク質は核内に存在し、
DNA結 合 能 を有 し 、 正常 細胞 ではGl→S期で 発現す る。当研 究室を含 むいく っかの 研究 室の結果 より、c一myc夕ンバ ク質は 転写とDNA複製 因子とし て、細 胞増殖、細 胞 分 化、 細 胞 死に お い て重要 な機能 を果たす ことが 明かにな ってきた 。この 正常 な 機 能か ら の 何等 か の 逸脱が 細胞癌 化をもた らすと 考えられ る。一般 にこう レた タ ン パク 質 が 機能 す る 際、単 独で働 くという よりも 幾っかの タンパク 質と複 合体 形成 し機能す る。本 研究室に おいて は、cーmyc遺 伝子上 にDNA複 製開始 領域を同定
．し 、そこが 同時に 転写エン ハンサ ーとして 機能する ことを最初に見い出し、その 必須 配列21塩基 対を同 定した。 この21塩 基対にはcーmycタンパク質複合体が結合す る こ とが 次 に 明か に さ れた。 その後 、アメリ カのグ ループが 我々と異 なる塩 基配 列にc−mycタン パク質がMAXと名 づけた タンバク 質と複 合体形成 して機 能すること を発表した。しかしながらc‑‑myc/Maxの夕一ゲット配列は未だに明かて゛ない。 ． そこ で 本 学位 論 文 申請 者 根 岸洋 ー は 我々 のc―myc遺 伝子 上 の ター ゲ ッ ト配 列 TCTCTTA（c−myc core）とc−myc／Max認識配列CACGTG（CM―1）との相互関連より出発し、
次にc−myc夕ン パク質複 合体形成夕ンパク質としてc―myc core配列に結合するタン パク 質群MSSPを 同定し、 そのーつ のcDNA，MSSP―1を クローニ ングし 、その構 造解
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析と転写、複製における機能を解明した。
1、 c― myc coreと CM1配 列 に 宙 け る cーmyc夕 ン パ ク 質 複 合 体 の 相 関 本研究室では抗c−myc抗体を利用してc―rfiyc遺伝子上流のHindIII−PstI（（H−P）領 域 ）にc−myc夕ンパク質複合体が結合 し、転写とDNA複製開始調節 に機能することを 報告した。この結合及 び機能に必須な配列はTCTCTTA配列（cーmyc core）であること を 次に 明か にし てき た。 アメ リカ のグ ルー プ はc―myc夕ンパク質はhelix−loop− helix，basic region，leucine zipper構造 を有 する ため、この 種のタンパク質は CA‑―TG配 列 を 認 識 す る 筈 で あ る と の 仮 定 の も と 、 内 部2箇所 を機 械的 に 変換 し CACGTG配列 （CM1）を 同定 し、そのタ ンパク質複合体形成夕ンパク質としてMaxをク 口ーニングした。そこ で申請者は両者の結合配歹fJを相互にコンペテイターに用い る バン ドシ フト 及 びuVクロ スリ ンキ ング 法に より 解析 し、 両組 合せ で相 互 に阻 害 さ れる こと 、即 ち共 通の タン パク質c−myc夕ンパク質を介して異 なるパー卜ナーが 存 在し 、異 なっ た組 み合 わせ にお いて は異 な った 配列 、即ちCM1にはcーmyc/Max、 c−myc core配列には後述のc−myc／MSSPが結合することを証明 した。現時点では 一 般にcーmycタ ンパ ク質 のパ ー卜ナーとして10種類以上のタンパ ク質を想定してい るが、この結果はこうした概念の発端となった。
2、MSSPの同定とcDNAクローニング
c―myc core配 列は 転写 工ン ハン サー であ り 、同 時にDNA複製 開始 領域 で ある 。 DNA複 製開 始を 考 えた 時、 ある 特定 の配 列が 認識 され 、次に鎖が 開裂する。開裂し た 一本 鎖DNAを2本 鎖と 同様 認識 する タン パク 質が 存在 して も良 い。 そこ でcーmyc core配歹『Jのプラス鎖をプローブとしてそこに結合するタンパク 質を解析した。い く っか のタ ンパ ク質 が存 在し 、そ れら をMSSPと命 名し た。抗c‑myc抗体の添加によ り 、DNA一夕 ンパ ク質 複合 体形 成が 阻害 され る こと より 、2本鎖DNAの 場合 と同 様1 本 鎖c−myc coreにもc−mycタンパク質複合体が結合することが判 明した。分子量が 異 なる 少な くて も7種 類の タン パク 質がMSSPファ ミリ ーとして存 在することが次に 明 かに なっ た。 ヒトHL60cDNAライ ブラ リー よ り一 本鎖c―myc coreをプローブとし た サウスウェスターン法によりcDNAク ローニングを次に行い、MSSP−1を単離した。
MSSP―1はSDS―PAGE上 で分子量50，000のタンパク 質であり、内部にRNA結合夕ンパク 質 と知られる一群のタンパク質が保持 するRNP―1ドメインを2箇所 有してしヽた。こ の 領域 はDNA結 合 能に 必須 であ り、1本 鎖核 酸 結合 配歹Uと呼んだ 方が良いかもしれ ない。次にgulutachionてS−ヒransferaseとの融合夕ンパク質として大腸菌内で発現 後 、 精 製 し た タ ン パ ク 質 を 用 い てDNA塩 基 配 列 結 合 特 異 性 を 解 析 し た と こ ろ 、 TCTCTTA配歹fJを中心とした塩基を認識した。更にこのMSSP―1は2本鎖cーrfiyc coreに
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も同 様に 結合 し、1で述 べた タン バク 質はMSSPであ る こと が判 明し た。MSSPー1の 発現 はc―mycと連動 、即ち細胞周期のGl→S、c‑myc夕ンパク質の発現してい る臓器 のみで発現しておりその機能を考える上 で重要である。
3、MSSPー1とSOAP
当 研究 室のIvo Galliによ り動 物ウ イル スSV40のDNA複 製開 始必 須領域に 存在す るAT rich配歹 『jを 認識するタンパク質としてSOAPが同定された。SOAPは1、2本鎖 DNAを認識す る複製タンバク質である。MSSP−1同様分子量50，000ダ ルトンであり、
夕ン パク 質の 発現と してはS期でピークを迎える 。従ってMSSPー1とSOAPは類 似のタ ンパ ク質 と考 えら れた 。 両者 のDNA結 合配 列の特異性を両者のプローブ、タ ンパク 質の いく っか の組合 せで検討したところ、結合特異性は全く同一であった。 更に、
夕ン パク 質分 解酵 素で 限 定分 解し たタ ンパ ク質 を用 いた バン ドシ フ卜実験 より両 者が 同一 のぺ プチ ドを 有 する こと から 、MSSP−1とSOAPは同一または極めて 類縁の ファミリータンパク質であることが明か となった。現実に既・にIvo Galliの実験に より 、SOAPの 認識 配歹UをTCTCTTAに変 換したSV40DNAが複製能を有している ことが 判明しているのでこの関係の重要性が浮 かび上がった。
4、MSSPー1の転写と‑DNA複製における機 能
上 述の よう にMSSP−1とSOAPと は同 一ま たは極めて類縁のタンパク質であ る。そ こでSV40DNA内 のSOAP認 識配 列（TATA boxと重複したAT rich配列）をMSSP―1認識 配列TCTCTTAに 変換 した レポ 一夕 ー遺 伝子 を用いてMSSPー1のDNA複製におけ る効果 を培 養細 胞を 使用 して の 卜ラ ンス フiクシ ョン 実験 で 検討 した 。MSSP−1添 加によ りSV40DNAは濃 度依 存的 に複 製活 性上 昇が 観察され、MSSPー1の塩基配列特異的DNA 複製への，関与が示された。次に同様な 配歹Uの下流にルシフウラー ゼ遺伝子を連結 した レポ ータ ー遺 伝子 を 用い て転 写へ の効 果を 検討 した 。同 様に 塩基配列 特異的 に転 写活 性が 促進 され 、MSSP―1の転 写因 子としての機能が明かとなった。 しかし ながら、MSSP一1は他の種々の転写プロモー夕一活性を抑制するこ とが判明した。
c−myc遺伝ヂ上のc−myc core配列はc一myc，MSSP一1の絶対量が少ない時は転写活性 に必 須で ある 。し かし な がらMSSP―1の絶 対量は多い時は抑制に回る。この 事実は 細胞周期との関わりを考えると考え安い 。即ちcーmyc／MSSP―1量が 少ないGl期では 転写 促進 に機 能し、 量が増加するS期に入ると転 写を抑制しDNA複製を活性化 する。
この時、MSSPー1／c一mycのターゲットはGl期ではcーmyc core配列であり、S期におい てはTATA Boxを合 む転 写 開始 複合 体と 考え る。 細胞 周期 調節 と転 写と複製 の連動 を考 える 際、 極め て重 要 と考 えら れる 。次 にMSSP‑1の細 胞癌 化能 、即ち細 胞卜ラ ンス フオ ーメ ーシ ョン 能 をラ ット3Y1細胞 を用 いて 検 討し た。MSSPー1は単 独或は
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c−myc、rasとの組合せでは 何等効果を示さなかったがras／c‑myc/MSSp−1の組合せ で卜 ランスフオーメーション活性を増強した。従ってMSSPー1過剰発現における細 胞癌化への関与が示された。′
以上のように 、申請者はc‑m)rc複合体形成タンパク質MSSPでの研究に より、DNA 複 製、 転写 の連 動、 細胞 周期 調節、細胞癌 化機構を分子レベルで詳細に解析し多 大 の新 知見 を得 た。 これ ら主 論文 は既 に国 際的 科学 雑 誌2報に掲載され、関連論 文 も数 報に 及ぶ 。従 って 、申 請者、根岸洋 一は博士（薬学）を授与するに充分で あ ると 判断 され た。
