魚貝類の薬物代謝酵素活性を指標とする水域汚染の判定

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九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

魚貝類の薬物代謝酵素活性を指標とする水域汚染の判定

大嶋, 雄治

https://doi.org/10.11501/3088203

出版情報：Kyushu University, 1991, 博士（農学）, 論文博士バージョン：

権利関係：

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魚貝類の薬物代謝酵素活性を指標とする水域汚染の判定

大嶋雄治

199 1

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一一百本自44H，一ーーー一一一一一一一一一ー一一一一一一一一一一一一ーーー一ーーーーーーー一一一一一一一一一一一一ーーーーー一一一ー

第1章ヒブナ，クルマエビ，アサリおよびラットの各肝臓における薬物代謝酵素活性

第1節各供試動物肝臓の細胞分画一一一一一一一一一一一一一一一一一 4

第2節各(共試動物の肝細胞内における薬物代謝酵素の分布 _一--- 23

第2章コイ，ヒブナ，ニジマス，ティラピア，マダイおよびブリの肝臓，

腎臓および偲における薬物代謝酵素活性の比較

第1節酸化酵素の活性一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 35 第2節加水分解酵素の活性一一一一一一一一一一一一一一一一一一 ⁴⁵ 第3節抱合酵素の活性一ー一一一ー一一ーー一一一一一一一一一一ー一一 ⁴⁸

、、‘.. ，，，， .，BA r'『も、

(5)

第3章アサリ中腸腺の硫酸抱合酵素活性とフェノール化合物によるその誘導

第1節数種フェノール化合物による硫酸抱合酵素活性の誘導一一-- 53

第2節 PCP長期曝露による硫酸抱合酵素活性の誘導一一一一一一-- 56

第4章コイ肝勝臓薬物代謝酵素活性と環境汚染物質によるその誘導

第1節数種環境汚染物質の経口投与による薬物代謝酵素活性の変動一一 60

第2節 PCB長期投与による薬物代謝酵素活性の誘導 66

第5章魚貝類の薬物代謝酵素活性を指標とする水域汚染の判定法

第1節急速凍結による肝臓の各種薬物代謝酵素活性の変動一一一一ー 78

第2節魚類および貝類の薬物代謝酵素活性を指標とする汚染判定法一ー 80

公心叫別+市川叶ラ「門跡手白衣サ・+寸41内H

一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 102

一一一ー一一一ー一一一一一一ーー一ーーー一ー一一ー一一一一- 106

一一一ー一一一ー一一一一一一一 107 参考文献

、、，，J・1A・噌E&〆'a‘、

(6)

緒日

今世紀初頭から始まった近代化政策，特に第二次世界大戦後の工業立国政策の推進によって. 我が国は今や世界の工業先進国に成長した。しかしその繁栄の裏で，深刻な環境破壊による水質悪化・生物の異常艶死・生体汚染・公害病などが起こり大きな社会問題となった。これらに対し行政は，毒性・蓄積性の高い化学物質の使用禁止，

水質規制などの対策を行っている。しかし今なお生体，底泥，水中から有機塩素化合物，重金属などの環境汚染物質が検出され続けており1)，低レベルでの汚染は依然として継続している。さらに最近，有機スズ化合物による生体と屋野尼の汚染が報告され1)，

改めて環境汚染の深刻さを認識させられた。これら環境汚染物質の高レベル汚染はもちろんのこと，低レベルの汚染においても，汚染水域に生息する生物の生殖力や免疫力の低下なと慢性的影響が危慎されており，動物性タンパク質の約50 %を魚貝類に依存している我が固にとって深刻な問題である。

一般に，生物に取り込まれた汚染化学物質は主に肝臓で酸化・還元・加水分解および抱合の4反応系のうちーっか，あるいは幾つかの複合により代謝された後，体外へ排出される。最初の3反応系は薬物に最初に作用するものであり，第I相の反応、と呼ばれる。これに対して，抱合反応は通常第I相の反応生成物に作用することから第1¹ 相反応系と呼ばれている。よって汚染物質の毒性と残留性は，化学的特性もさるととながら生体の代謝能が大きく左右すると考えられる。しかし，スミチオンなど有機燐殺虫剤の毒性発現機構2)のように体内で代謝されて逆に毒性が高まる物質もある。よって魚員類の薬物代謝能を明らかにすることは，緊急かつ重要な問題で、ある。

水生動物における薬物代謝の研究が開始された1960年代初期には，魚類は薬物代謝能を持たないと報告3)されていた。しかし，農薬をはじめとする各種の化学物質による環境汚染が次第に進行し， 1967年に ADAMSONがその総説4)で海産脊椎動物における薬物代謝の研究を紹介するに及んで，乙の分野に対する研究者の関心が急速に高まっ

(7)

てきた。水生生物における薬物代謝酵素活性に関する研究の大部分は，魚類肝ミクロソームのシトクロム P-450 (P-450)酵素系を中心とするものであり. B四LER5)，

CREAVENら6)， BUHLERら7)およびDEWAIDEら8) �ζよって開始され，多数の研究が報告されている。しかし. AHOKAS9) の報文にも引用されているように，魚種聞にかなり大きな差が認められるものの，一般に魚類肝ミクロソームのP-450含量およびその電子伝達糸酵素の活性は晴乳類のそれらに比べ低く，それを反映して薬物酸化酵素

(monooxygenase; MO)の活性が低いことが明らかになった。

しかしながら，魚類が3-メチルコラントレン10) などの薬物やPCB11). 石油12)，ダイオキシン13)など様々の環境汚染物質に曝露されると，そのMO活性，特に芳香族炭化水素水酸化酵素が強く誘導され. 0南乳類のレベルに達することが明らかにされた。それらの多くは1982年にLECHらが総説14)で詳しく紹介している。

このように，これまでの研究のほとんどはP-450 �とより触媒されるMO活性を中心に研究されており. 抱合系については小林ら1 5)の魚貝類におけるフェノール類の代謝に関する研究など数少ない。また，肝臓以外の臓器および魚類以外の水生生物について一貫した研究はなされていないのが現状である。よって，本研究では魚類の肝臓および貝類の中腸腺について，まず再現性のある細胞分画法を確立し，各種薬物代謝酵素の存在する画分を明らかにした。次に6種魚類について，それらの肝臓，腎臓および偲における酵素活性を比較した。さらにアサリおよびコイを用い，数種の化学物質を投与して薬物代謝酵素活性の誘導とその限界，ならびに誘導された酵素活性の持炉し性を調べた。

以上の研究成果，特に環境汚染物質による魚貝類の薬物代謝酵素活性の誘導性を踏まえ，野外で採取したアサリとムラサキイガイの中腸腺およびマコガレイの肝臓における薬物代謝酵素活性を測定し，生息環境の汚染状況との関連性を調べた。その結果，

魚類のMO 活性と員類の硫酸抱合酵素活性が生息水域の汚染の様相をよく反映することを明らかにし，特に低レベルの複合的汚染水域においては，従来の化学分析による

今ノ劇

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ーー""

方法を補完する水域汚染判定の指標として有用であることを実証した。本論文はζれらの研究成果を取りまとめたもので，全5章からなる。

- 3 -

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第1章ヒブナ，クルマエビ，アサリおよびラットの各肝臓における薬物代謝酵素活J性

生物の薬物代謝能を明らかにするには， in vivo で測定するのが理想的である。しか

しそれは多大の労力を必要とし、また解析が複雑である。一方in vitroで測定を行う場合，試料として組織をそのまま用いると，取り扱いが極めて難しい。よって，組織をホモジネート溶液として酵素活性そ測定すると，操作が容易であり，試料の長期保存も可能となる。しかし，一般にその活性値は低く，目的とする酵素反応がホモジナイズ時に放出された他の酵素群や生体内物質により阻害され易い。よって，ホモジネートを処理してできるだけ阻害を避けるとともに，比活性を高める必要がある。本研究では，肝細胞をホモジナイズした後，遠心分固により核，ミトコンドリア，リソゾーム，ミクロソームおよびシトゾルの5画分に分け，各画分について薬物代謝酵素活性を測定し，比較検討した。

第1節各供試動物肝臓の細胞分画

再現性のある細胞分画を行う上で最も重要な点は，出E織をホモジナイズする条件である。生物種が異なれば，その条件も違ってくると考えられるので，本章では哨乳類，魚類，軟体動物の肝臓，肝勝臓もしくは中腸腺(以下肝臓とする) におけるホモジナイズの条件そ設定し，分画の状態を比較検討した。

1. 実験方法実験動物

ヒブナ(Carassius auratω)は福岡市内の養魚場より平均体重L約60 gのものを入手，

- 4 -

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流水で、 1週間以上予備飼育し， 1日絶食させたものを用いた。クルマエビ(Penaeω japonicus)は旭商事(山口県秋穂町)より平均体重約70gのものを入手し，研究室で数日間蓄養した後に供試した。またアサリ(Ruditapes philippinarum) は，平均殻長約4 cmのものを博多湾海の中道海岸で採取し，一晩清浄海水で、蓄養し実験に用いた。アルビノラット(Wister King A)・4週令の雄は，九州大学純系動物飼育場より入手し， 25 OC の部屋で1日間絶食させた後，実験に用いた。

試料の調製

肝臓は多量の血液を含んでおり，ホモジナイズする前に乙れを除く必要がある。

ラットでは解剖し肝臓を摘出した後，肝門脈より 0.9 %塩化ナトリウム溶液を潅流して脱血を行った。しかしラット以外の供試生物の肝臓は脆弱で血管系も不明確なため，

濯流することが困難である。よってヒブナとクルマエビでは断頭し放血させた後�C . またアサリでは開殻した後にそれぞれ肝臓を摘出した。

摘出した各肝臓試料は氷冷した0 .9 %塩化ナトリウム溶液中に入れ，血液・脂肪組織・結締組織などを取り除いた。得られた組織は欽で細断し，漉紙に打ち上げ水分を切った後に秤量し. 9倍容の氷冷 0.25M sucrose - 10 mM Tris (hydroxy1methyl) aminomethane (Tris) ^-HCl (pH 7. 5) (以下ショ糖液)を加え， Potter - Elvehjem型50ml容ガラスーテフロンホモジナイザー (内径27.20mm)を用いてホモジナイズした。ペツスル(外径27.04 mm)は，東京理化製・ケミスターラ(B-100)に取り付け毎分 1，000回転させ，ポッターを10mlあたり約7秒の早さで、上下に動かしてホモジナイズした。得られたホモジネートは， Fig. 1-1 �C示す方法で、遠心分画を行った。すなわち，調製した

ホモジネートを 900 xgで10分間遠心し，まず核を含む沈殿を得た。次にその上清を 5，000 xgで15分間遠心し，ミトコンドリアを含む画分を分離した。さらにその上清を 10，000 xgで15分間遠心し，リソゾーム画分を得た。最後に残った上清を100，000 xg

で60 分間超遠心しミクロソーム画分を沈殿させた。得られた核，ミトコンドリア，リソゾームの各画分は 0.25Mのショ糖液に，ミクロソームの沈殿は0.1mMþDTA を含

- 5 -

(11)

Fish liver homogenate with 0.25 M sucrose- 1，0 mM Tris-HCl buffer solution (pH 7.5).

Centrifuge at 900 _{xg for}10 _min.

�up. PPt. (Nuclear 合action) Centrifuge at 5，000 _{xg for}10 _min.

�up. PPt. ( Mitochondrial fraction) Centrifuge at 10，000 _{xg for}₁₅_min.

�up. PPt. (Lysosomal fraction) Centrifuge at 100，000 _{xg for}60 _min.

Sup.(Cytosol) PPt. (Microsomal fraction)

Fig. 1-1. Procedure of cell fractionatioll.

-6-

(12)

む0.25 Mのショ糖液に懸濁させた。 ζれらをl回ホモジナイズして再!懸濁し，核，ミトコンドリア，リソゾームおよびミクロソームの各画分の測定制斗を調製した。また最後の分画で得られた上清をシトゾル画分とした。以上の操作はすべて5 oC以下で行った。

分画条件の検定

本研究では分画の良否を判定するために，得られた各画分についてそれぞれ細胞内の各器官に局所的に存在する酵素(標識酵素)の活性を測定し，他の画分との分離の 1対兄を明らかにした。但し，協国分には適当な標識酵素がないため DNA量を標識とし，

SCHNEIDER 16)の方法を用いて測定し?と(Fig. 1-2)。すなわち，試料に過塩素酸を加えて

除蛋白した後，脂質， RNAを除きDNAを分離した。この溶液にジフェニルアミン試薬を加えて発色させ， 540 nmの吸光値より DNAを定量した。

ミトコンドリア画分では，コハク酸『シトクロムc還元酵素を標識酵素とした。 Fig.

1-3 �C示すようにSCHNIEDER17)の方法に従い，試料に緩衝液， KCNおよびシトクロム

cを添加した後，コハク酸を加え，還元型シトクロムcの増加量より酵素活性そ測定した

リソゾーム画分では酸性ホスファターゼを標識酵素とし， RAoとVAIDYANA百fAN18)

の方法により測定した。その方法をFig. 1-4に示した。試料lζ緩衝液と基質を加えて反応させた後，トリクロロ酢酸を加えて除蛋白を行った。との上澄みにモリブデン酸試薬を加えて発色させ， ⁷⁹⁰nmの吸光値より本酵素の活性を測定した。

ミクロソーム画分ではNADPH-シトクロムc還元酵素を標識酵素とした。 OMURA とTAKESUE19)の方法に従い， Fig. 1-5 �と示すように試料に緩衝液とシトクロムcを加えた後NADPHを添加し，還元されたシトクロムc量より酵素活性そ測定した。

シトゾル画分では乳酸脱水素酵素を標識としREEVESとFIMOGNARI20) の方法により測定を行った。その方法そ Fig. ^1-6�ζ示す。試料に緩衝液とピルビン酸を加えた後 NADHを添加しその減少量より本酵素活性を測定した。またタンパク質はIρwryら

-7-

(13)

ubcellular fraction， 2 ml

Add 4 ml of cold 10 % perchloric acid and centrifuge at 3，000 rpm for 10 min.

ppt. Sup.

|Add 4 ml of cold 10% perchloric acid and centrifuge at 3，000 rpm for 10 min.

PPt. _Sup.

Add 6 ml of ethanol and keep at room temperature for 15 min.

Cen廿ifuge at 3，000 rpm for 10 min.

ppt. Sup. (Lipid fraction)

Add 6 ml of ethanol-ether (3: 1) and stand for 15 min at room temperature.

�t. Sup. (Lipid合action)

Add 2 ml of 1 N KOH and stand over night at 37 oC.

Neu甘a1ize with 6 N HCl and cen仕ifuge at 3，000中m for 10 min.

�t. Sup. (RNA仕action)

Add 2 ml of 5 % perch10ric acid and keep at 90 OC for 15 min.

Centrifuge at 3，000 rpm for 10 min.

ma Sup. (DNA fraction)

pNA fraction， 1 ml.

Add 2.5 ml of diphenylamine reagent*.

Heat in boiling water for 10 min.

Cool in running water.

Absorbance at 540 nm.

Fig. 1-2. Determination of DNA in subcellular仕actions of livers obtained from several species.16)

* Diphenylamine reagent: diphenylamine， 19; acetic acid， 98g;

conc. H2SO 4' 2 g.

-8-

(14)

�ubcellular fraction， 0.1 _m1.

Add 1.0 _{ml of}0.1 M phosphate buffer (pH 7.4)，

0.05 _{ml of}0.05 _{M KCN，} 0.2 _{ml of} 0.2 _mMcytochrome c and 0.6 ml of distilled water.

Preincubate for 5 _{min at}30 _oc.

Add 0.05 _{ml of}1 M sodium succinate.

Immediately start measurement of absorbance at 550 _nm.

Fig. 1-3. Assay of succinate-cytochrome c reductase activity in subcellular 仕actions of livers obtained合om severa1 species.17)

-9-

(15)

Subcellular fraction， 0.9 ml.

Add 0.02 ml of 10 % Triton X-I00， 0.08 ml ofO.25 M sucrose-l 0mM Tris-HCl buffer(pH 7.5)， 0.5 ml of 0.2 M acetate buffer (pH 5.5) and 0.5 ml of 0.2 M ß-glycerophosphate.

Stand for 30 min at 30 oC.

Add 0.5 ml of 40 % TCA.

�up. (1 ml) PPt.

I

Add 2 ml of molybdate reagent本and4 ml of isobutanol.

I

Shake for 10 sec.

Isobutanol ex甘act (2 ml)

Add 2 ml of 0.5 % ascorbic acid and 1 ml of ethanol.

Stand for 30 min at 37 ^oC^. Absorbance at 790 nm.

Fig. 1-4. Determination of acid phosphatase activity in subcellular合actions of livers obtained仕om several species.18)

*Molybdate reagent : 3 % ammonium molybdate : 1.5 N H2S04 (1: 1， v/v) mixture.

-10-

(16)

Subcellular仕action， 0.1 ml.

Add 1.66 ml of 0.1 M phosphate buffer (pH 7.5)，

0.02 ml of 0.05 M KCN and 0.2 ml of 0.2 mM cytochrome c.

Preincubate for 5 min at 30 OC.

Add 0.02 ml of 10 m恥1NADPH.

Immediately start measurement of absorbance at 550 nm.

Fig. 1-5. Assay of NADPH-cytochrome c reductase activity in subcellular 合actions of livers obtained仕om several species.19)

Subcellular仕action， 0.1 ml.

Add 0.4 ml ofO.5 M phosphate buffer (pH 7.4)，

1.4 ml of distilled water and 0.08 ml of 5 mM NADH.

Add 0.02 ml of 0.1 M sodium pyruvate.

Immediately sta口measurement of absorbance at 340 nm.

Fig. 1-6. Assay of lactate dehydrogenase activity in subcellular fractions of livers obtained from several species.20)

-11-

(17)

ら21)の方法により定量した。その方法をFig.1-7に示す。

試薬

実験に使用したシトクロムC， NADHおよびNADPHはシグマ社より，またピルビン酸ナトリウムおよびグリセロリン酸はメルク社より入手した。その他の試薬はすべて市販特級レベルのものを用いた。

2.結果と考察ヒブナ

Fig. 1-8はヒブナ肝臓を，ペッスルの上下回数を5， 6， 7回と変えてホモジナイズし

た後に遠心分画し，ミトコンドリア画分の標識酵素であるコハク酸ーシトクロムc還元酵素の活性を測定した結果である。ホモジナイズの度合はホモジナイズの回数によって影響されると考えられる。 5 回上下では，核画分Lと28 nmol/minJmg-proteinと最も高い活性が認められた。これに対し，ミトコンドリア画分では20 nmol/min/mg-protein と低く. まだ核画分にミトコンドリアがかなり含まれ，ホモジナイズが不十分であっ

た乙とを示唆している。次に 6 回上下した場合，核画分の活性は5固に比べ低下し，ミトコンドリア画分では 33nmoνmin/ mg-proteinと上昇した。しかし7回では，ミトコ

ンドリア画分の活性が6回に比べ低下し，過度のホモジナイズにより活性が低下したことを示している。つまりヒブナの肝臓では6回上下してホモジナイズした場合，ミトコンドリアの分離が最も良いことが明らかになった。次にヒブナ肝臓を6回上下ホモジナイズし，遠心分画して得られた各画分における蛋白質とDNA の分布は， Fig.

1-9 22) �ζ示すようであった。全蛋白質量に対する分布率は，シトゾル画分で53 %と最

も高く，核画分で17 %. ミトコンドリア，リソゾーム，ミクロソームの各画分はいずれも10 %以下であった。

DNA量は，核画分に最も多く312μg!mg-proteinであった。他方，リソゾーム画分で

-12-

(18)

�ubcel1ular fraction (dilute 100-fold with distilled water)， O.5ml.

Add 5 ml of 2 % Na2C03， 0.01 % CuS04 and 0.02%

Na， K-tar廿ate in O.lN NaOH.

Stand for 10 min at 30 OC.

Add 0.5 ml of phenol reagent.

Stand for 30 min at 30 oC.

Fig. 1-7. Determination of protein content in subcellular fractions of livers obtained 合om severa1 species.21)

- 13-

(19)

7 Times

Homogenization (up-and-down)

6 Times Mt

Ly Mc Mt

Ly Mc Ly Mc

Mt 30

20

10

。

50 100 100 。

。 50 50 100

。

Protein (0/0)

Fig.1・8. Changes in the activity of succinate-cytochrome c reductase in subcellular fractions of goldfish liver.

Fractions are abbreviated as follows: Nc， nuclear fraction; Mt， mitochondrial fraction; Ly， Iysosomal fraction;

Mc， microsomal fraction; Cyt， cytosol.

5 Times

(C一20」abε~cEさoEC)kC3zo句。EKANC凶

ー]hFl

(20)

-」ω〉一一芸wZ刀一00』OCOZO何」』」回一コ=ωυDコωzoωωc一日cgcoo〈ZOUC何COZコDEω一万C一ω日O」牛.0aF・0一比

(c一22abε~01)〈ZQ

00の (ま)520』仏

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一Oωovho

-」』一何戸』Oω

O」O一三 -」』一何に』Oω

oωKAJ

と一回立ちcozoot2

-」』」何ω一OコZ

-15-

(21)

は核画分の 20 % と低く，その他の画分でも10 %以下であり，核画分が良好に分離されたことを示している。

各標識酵素の活性はFig.1-10に示すようであった。ミトコンドリア画分の標識酵素であるコハク酸ーシトクロム c還元酵素の活性は，ミトコンドリア画分で31 nmolJminJmg-proteinと最も高く，次いで、核画分28nmolJmin/mg-proteinであり，その他の画分は極めて低くかった。すなわち本酵素は，ミトコンドリア画分に最も高い割合で認められたが，核画分にもかなり分布していた。 Fig.ト8の結果から，ホモジナイズの度合を強くしても両画分における本酵素の分布ノ〈ターンは余り変化しないものと考え

られる。

リソゾーム画分の標識酵素である酸性ホスファターゼの活性は，リソゾーム画分で

28 nmolJminJmg-protein，ミクロソーム画分で29 nmo1/minlmg-proteinと高く，ミトコン

ドリア画分ではそれらの約50 %，核画分およびシトゾル画分ではそれらの約15 %と低かった。

NADPH-シトクロムc還元酵素の活性は，主に存在していると考えられるミクロソーム画分で46 nmol/min/mg-proteinと最も高く，次いでリソゾーム，ミトコンドリア，核画分の順であり，シトゾル画分で最も低かった

乳酸脱水素酵素の活性は，シトゾル画分で最も高く9.0μmo1/min/mg-proteinであり，

リソゾーム. ミクロソーム画分はその約3 0 %，ミトコンドリア画分でその約10 %， _また核画分で、は極めて低かった。

以上の結果より本条件下での細胞分画は，ミトコンドリアの核画分への混入，リソゾームのミクロソーム画分への混入などが若干認められたが，他の画分ではそれぞれ標識した画分で活性および含量が最も高く，遠心分画法としては分離が良好であり，

MAEMURAとOMURA23)の報告と同様の結果であった。

-16ー

(22)

。vcおパdc-u H凶pr D A M川Succinate-cyt. c

reductase

Mc

Cyt

J::::.:::ミ...日:::::::::♂少・〆早:ぷJ・4士...

50 100

40

。。 20

Cyt Mt

Nc 30

20

10

。VGu

a m山円 O 引C AU ，EE ぬW

a e

dd

BL a x103 10

5 50 100

Acid phosphatase 30

20

10 (c一20」♀切に』三一ε~一OEC)KC一〉ち何ωEKANC凶

100 100 50

50

(0/0)

Fig. 1・10. The marker enzyme activity in each subcellular fraction of goldfish liver.

Protein

Fractions are abbreviated as follows:

Nc， nuclear; Mt， mitochondrial; Ly， Iysosomal;

Mc， microsomal; Cyt， cytosol.

-17ー

(23)

クルマエピ

クルマエビの中腸腺を4回上下ホモジナイズした後，遠心分画を行った。各画分における標識酵素の活性をFig.1-11 �C示す。酸性フォスファターゼおよび、乳酸脱水素酵素の活性はそれぞれ併票識画分で最も高く，両画分の分離は良好であると考えられる。

しかし， NADPH-シトクロムc還元酵素の活性は，各画分中ミクロソーム画分が最低値を示す予想外の結果となったが，それらの活性値はいずれもヒブナの1/10以下の定量限界に近い値であり，測定誤差の影響も大きかったものと考えられる。

また，コハク酸ーシトクロムc還元酵素の活性も核画分で高く，シトゾル画分でもかなり認められ，本酵素活性を標識とする分離は不良であった。

アサリ

次に，アサリの中腸腺を6回上下ホモジナイズし，遠心分画を行った結果を Fig.1・12 �C示す。コハク酸ーシトクロムc還元酵素，酸性フォスファターゼおよび乳酸脱水素酵素の活性はそれぞれの標識画分で、最も高かった。しかし， NADPH-シトクロムc還元酵素の活性は前述のクルマエビの場合と同様に低い値であり，リソゾームミクロソーム画分およびシトゾル画分間で差が認められなかった。 LIVINGSTONEと FARRAR24)は. ムラサキイガイ中腸腺の細胞分画を行しコ本酵素活性を測定したところ，

ミトコンドリア画分からシトゾル画分にかけて本酵素活性が検出されたと，本実験と同様の結果を報告している。しかし. STEGEMAif5) はムラサキイガイ中腸腺でミクロソーム画分に最も高い活性を報告しているので，本条件での分画は. STEGEMAN25) の結果に比べてミクロソーム画分の分離がやや不良であったと考えられるが，他の画分の分離は良好であった。

ラット

Fig.1-13にラットの肝臓を4回上下ホモジナイズした場合の実験結果を示す。コハク -18-

(24)

NADPH-cyt. c reductase Succinate-cyt. c

reductase

Nc 2.0

1.0

100 Nc

20

10

100

Lactate

dehydrogenase

Cyt 50 50

Acid phosphatase

Nc Mt Ly 1.0

0.5

。。 50

25 (520』a'mにセC一ε\ちEC)と一〉一日。何ωEKANCU

50 100 50 100

(0/0)

Fig. 1・11. The marker enzyme activity in each subcellular fraction of mid-gut gland of tiger shrimp.

Protein

Mc， microsomal; Cyt， cytsol.

-19-

(25)

reductase

6.0 Cyt

3.0 Mt

Ly 6.0

4.0 2.0

100

ov cu a nH e qu o ，za AU ぬW 2MGv

dd a ー」

20

10

。。

50 30

50 100

Acid phosphatase Ly

20

10

(cBHO」atmE\C一ε\ちεc)bszo何ωEKANCU

50 100 50 100

(0/0)

Fig. 1-12. The marker enzyme activity in each subcellular fraction of mid-gut gland in short-necked clam.

-20- Protein

(26)

reductase

200

100 400 Mt

300

100

e nb a nH OV 門》ハuvaa -川U}

Vd

竹山uhH

a e

dd a ー」

Cyt 100 50

50

Acid phosphatase x103 10

5 (C5ちる10EE一ε\ちεc)KCSZO何OEKANC凶

40 30 20 10

50 100 50 100

(0/0)

The marker enzyme activity in each subcellular fraction of rat liver.

Protein Fig.1・13.

Nc， nuclear; Mt， mitochondrial;しy， Iysosomal;

-2 1-

(27)

酸ーシトクロムc還元酵素はミトコンドリア画分で，酸性フォスファターゼはリソゾーム画分で， NADPH-シトクロムc還元酵素はミクロソーム画分で，乳酸脱水素酵素はシトゾル画分で，それぞれ最も高い活性を示し，各画分の分離が良好であることを示している。 DE DUVEらあ)もラット肝臓の細胞分画を行い，コハク酸ーシトクロムc 還元酵素活性がミトコンドリア画分で、最も高いと報告している。

今ノ酎今ノM

(28)

第2節各供試動物の肝細胞内における薬物代謝酵素の分布

魚貝類肝臓の薬物代謝酵素活性を測定するには，測定に最適な闘分を明らかにする必要がある。よって第1節で検討した方法を用いて，魚貝類肝臓の細胞分画を行い，

得られた画分について，薬物代謝酵素のうち薬物酸化反応の主体であるP-450含量とそれにより触媒されるモノオキシゲナーゼ(MO)活性，ならひ可と硫酸抱合酵素およびホ

スファターゼの各活性を測定した。

法方均一ふ央川イパ一医局←十」-実武一

1 並ハ一

実験に供試したラット，ヒブナ，クルマエビおよびアサリは前節と同じであった。

これら生物の肝臓を前節に述べた条件下で、細胞分画し，得られた画分をドライアイスーエタノールで凍結後， -20oC で保存した。後日，以下に述べる酵素について活性を測定した。

酵素活性測定

(1)シトクロムP-450含量: OM目AとSAT027)の方法に従い. Fig.1-14に示すように試料2 ml に緩衝液2mlを加え，数mgのN�S203を加えて還元した後，試料セルと対照セルに分注し，試料セルにのみCOガスを20秒間通気後，目立ダブルビーム分光光度計(100-6 0形)を使用して400nmから500nmまでのスペクトルをとり， 450 nm と 500 nm における吸光値の差よりP-450含量を測定した。

(2)アニリン水酸化酵素( 71<.酸化酵素)の活性: BRODIEとAXELROD28)の方法を一

部改変し， Fig. 1-15に示すような操作で測定した。すなわち，試料に，緩衝液，基質およびNADPH生成系の補酵素を加え， 300Cで20分間反応させた後反応を停止し，

発色させて640nmの吸光値を測定し，活性を算出した。

丹、】今ノ』

(29)

S ubcell ular合action，2 _m1.

Add 2 _{ml of}0.1 M phosphate buffer (pH 7.6)

and a few mg of Na2S204・

Sample cel1 (1.8 _ml) Reference cell (1.8 _ml)

Bubble CO gas for 20 _sec.

Scanning from 500 _{nm to}400 _nm.

Fig. 1-14. Determination of cytochrome P-450 content.27)

A品τ今ノ釘

(30)

S u bcell ular合action，1.0 _ml.

Add 0.5 _{ml of}0.4 _MTris-HCl buffer (pH 7.5) _{and each}0.1 _{ml of} 20 unitJml glucose-6-phosphate dehydrogenase， 0.1 _M_glucose-6- phosphate and 0.1 _Maniline hydrochloride， and 0.05 _{ml of}0.2 _M MgC12 and 0.2 _Mnicotinamide.

Preincubate for 5 _{min at}30 _OC.

Add 0.05 _{ml of}10 rnM NADP and incubate for 20 _{min at}30 _OC.

Cool in ice water.

Add 2.0 ml of saturated NaCl solution and 25 ml of ethyl ether.

Shake for 10 _min

Centrifuge at 3，000 _{rpm for}10 _min.

Ç>rganic layer (20 _ml) Aqueous layer

Add 1 ml of 1.6 % phenol and 0.5 _{M N�PO}_4・

Shake for 5 _min.

Remove organic layer.

Stand for 30 min at room temperature.

bsorbance at 640 nm.

Fig. 1-15. Assay of aniline hydroxylase.

戸、J今ノ相

(31)

(3) p-ニトロアニソール 0-脱メチル酵素 (0-脱メチル酵素)の活性: NE廿ERと

SIEDEL29)の方法に従いFig. _1-16�C示すように試料に緩衝液，基質およびNADPH生成系の補酵素を加え， 300Cで20分間反応させた後， 1 N NaOHを含む反応停止液を加え 400nmの吸光値を測定し，活性を求めた。

(4)フェノールー硫酸抱合酵素(硫酸抱合酵素)の活性: KOBAYASHIら30) の方法に従いFi g.ト17に示すように試料に緩衝液. 基質のフェノールとe5S]KzS04および ATPなどの補助因子を加え， 300C で1時間反応させた後，トリクロロ酢酸で除蛋白した。未反応の[35S]S042-を除去した後，抱合体の放射能を測定し，供試[35S]K2S04の比放射能から活性を算出した。

試薬

アニリンおよびp-ニトロアニソールは東京化成製のものを， ATPは協和発酵製のものを， NADP，グルコースー6-リン酸およびグルコースー6-リン酸脱水素酵素はシグマ社のものを， C5S]Hß04は日本原子力研究所製のものを，液体シンチレーターは Amersham社のACS-II を用いた。その他の試薬はすべて市販特級レベルのものを用いた

2.結果および考察

Fig. _1-18 �C P-450 含量を示す。ヒブナにおいて，ミクロソーム画分は0. 2 4 nmol/mg-proteinと最も高く，次いでミトコンドリア画分で0.12，リソゾーム画分で 0. 06 nmollmg-proteinであり核画分およびシトゾル画分では検出されなかった(検出限界0.02 nmol/mg-protein) ⁰ BALKら31)はパイクの肝臓を細胞分画し，ミクロソーム画分でP-450含量が最も高いと報告している。アサリではミクロソーム画分にのみ0.02 nmolJmg-proteinと検出限界レベルのP-450含量が微弱ながらも検出された。しかしなが

ら，クルマエビはいずれの画分でも検出できなかった。他方，ラットではミクロソー

-2 6-

(32)

Subcellular fraction， 0.25ml.

Add 0.5 ml of 1 mM p-ni汀oanisole in 0.2 M Tris-HCl buffer (pH 7.8)

and each 0.05 ml of 0.01 M MgC12， 0.1 M glucose-6-phosphate，

glucose-6-phosphate dehydrogenase (20 units/ml) and distilled water.

Preincubate for 5 min at 30oC.

Add 0.05 ml of 10 mM NADP and incubate for 20 min at 30 OC.

Add 1 ml ofO.2 N KOH in 20 % glycerol-1 % Triton X-100.

Fig. 1-16. Assay of p-ni廿oanisole O-demethylase.29)

ウー今ん

(33)

Subcellular 合action， 0.5 ml.

Add 0.5 ml of 0.5 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) and each 0.1 ml of 0.2 M KCl，

0.2 M MgC12， 0.01 M P5S]K2SO 4 and 0.05 M phenol.

Preincubate for 5 min at 30 OC^. Add 1 ml of 0.2 M A TP-Na.

Incubate for 1 hr at 30 OC.

Add 1 ml of25 % _TCA.

Add 0.2 ml of 0.3 M K2S04 and 0.5 ml of 6 % BaC12， and stand for 10 min.

Sup. �t.

I

Wash with 2 m1 of 5 % _TCA.

| Centrifuge at 3，000 rpm for 5min.

Sup. PPt.

Add 0.2 m1 of 0.3 M K2SO 4 and 0.5 m1 of 6 % _BaC12・

Stand for 10 min and cen廿ifugeat 3，000 rpm for 5 min.

Spp. PPt.

Add 0.2 m1 of 0.3 M K2SO 4 and 0.5 m1 of 6 % _BaC12・

Stand for 10 min and centrifuge at 3，000 rpm for 5 min.

Filtrate with 0.45μm Millipore filter.

F，iltrate BaS04(合ee 35SO 4)

I

Fill up to 10 ml with distilled watぽ.

I Add 1 ml of fi1trate to 15 m1 of scintillant (ACS-II).

Subject to measurement of radioactivity by liquid scintillation counter.

Fig. 1-17. Assay of phenol-su1fate transferase.30)

-28-

(34)

Goldfish Short-necked clam

0.3 _r- 0.3

Mc

0.2

C

噌。同d

�

^0.1

�

¹¹¹¹¹¹ ^民将司 ^0.1

ε ^。^ε^C

� 園

^Cyt ^。 ^Ly ^Mc

、、-

CEばてLr コ3

。 50 100 _。 50 100

0.3 _r- Tiger shrimp 1.2 _r- ^Rat Mc ε 。。

エ Hに

Oh = 3 0.2ト 0.6

に.)

0.1← 0.1

。

NC MtLy IMC Cyt

。 50 100 50 100

Protein (0/0)

Fig. 1・18. Cytochrome P-450 content in various subcellular fractions of livers.

-29-

(35)

ム画分に1.17 nmol/mg-proteinと最も高く，リソゾーム画分およびミトコンドリア画分にも存在した。ラット肝臓のP-450含量はヒブナの約5倍に相当した。

Fig. 1-19 �ζ水酸化酵素の活d性を示す。ヒブナではP-450 含量の傾向を反映し，ミクロソーム画分で0.097 nmoVmin/mg-proteinと最も高い活性が認められ，リソゾーム画分でその約1/2 ，ミトコンドリア画分で約1/3，核画分で約1/5 の活性が認められた。アサリではシトゾル画分以外の各画分にヒブナの約1/5 以下の活性が認められたが，いずれも検出限界C0.01 nmo1/minlmg-protein)に近い値であった。クルマエビでは P-450 と同様全く検出されなかった。本実験におけるヒブナ肝臓の P-450含量および水酸化酵素活性はMAEMURAとÜMURA23) の報告とほぼ同レベルの値であった。ラットでは.

ミクロソーム画分で最も高く，ヒブナのそれの約6倍の値であった

Fig. 1-20 �C 0-脱メチル酵素の活性を示す。ヒブナで、は水酸化酵素の場合と同様に，

ミクロソーム画分で0.35 nmo1/minlmg-proteinと最も高く，リソゾーム画分で0.24 nmol/min/mg-proteinであったが，他の画分からは検出されなかった。アサリは，ミクロソーム画分にのみ検出限界レベルの0.02 nmoVmin/mg-proteinと微弱な活性が検出され

P-450の分布と一致した。 LrVINGSTONEとFARRAR24)およびSTE GEMAN25)はムラサキイガイCMytilusedulis)で，本実験の結果と同様に，ミクロソーム�CP-450 と水酸化酵素が存在するととそ報告している。一方，クルマエビではいずれの画分でも検出されなかった。ラットではヒブナの場合と同様に，ミクロソーム画分で最も高く1 .9 nmol/min/mg-protein ，次いでリソゾーム画分で1.2 nmo1/ min/mg-proteinであった。ヒブナのそれに比べて，約5倍も高く， P-450含量や71<酸イヒ酵素活性と同様の傾向を示した

Fig. 1-21 �Cフェノールー硫酸抱合酵素の活性を示す。ヒブナとアサリの両者において，いずれもシトゾル画分にのみ 4.7および 1.4 nmol/min/g-liverの活性が認められたクルマエビでは全画分でその活性を検出できなかった(検出限界0.01 nmo l/min!g-liver)。

ラットでもヒブナやアサリと同様にシトゾル画分にのみ11 nmol/min/g-liverの活性が検出され，ヒブナとアサリのそれぞれ約2倍および8倍の値であった

nv 司、d

(36)

Short-necked clam 0.1

0.05

Cyt Goldfish

Mc

Mc 100 50 0.6

0.3 100

S

Cyt 50

Tiger shrimp

Mc Ly Nc Mt

。 0.1

只U

ハU

オt ハU

ハU (C一20」a'OE~c一εとoεc)kC5zo句。EKANC出

0.05

。

50 100 50 100

。。

(0/0)

Protein

Fig. 1・19. Aniline hydroxylase activity of various subcellular fractions of livers.

Nc， nuclear; Mt， mitochondrial;しy， Iysosomal;

-31-

(37)

Short-necked clam Goldfish

Ly Mc Nc Mt

0.4

0.2

。。 Gyt

Mc

Nc Mt 0.4

0.2

。。 50 100

Mc 50 100

2.0 Rat

1.0 Tiger shrimp

0.4

0.2 (c一20」CIOε\C一EごOEC)と一〉一目。回ωEKANC以

Nc Mt

。。 Mc Gyt

Ly Mt Nc

。。 50 100 50 100

(0/0)

Protein

1・20. p-Nitroanisole 0・demethylase activity of various subcellular fractions of livers.

巧ノ』弓『d

Fig.

(38)

Goldfish

5 ⁵

Short-necked clam

2.5ト I::::((:}:::・刈 2.5

，^，-L0 〉^刷^、

‘ロ�c

ε 。 o I 1;'::::::;:;:;;;;;;;:;:;:;:;' 。

E Nc Mt Ly Mc Cyt Nc Mt Ly Mc Cyt

、C^、-

4〉Ed^、 Tiger shrimp ^Rat

'5 5 ，.. 10 ^，.

-・にの・)

。

ε

〉N^、

比JC

2.5 t- 5

。。

Nc Mt Ly Mc Cyt Nc Mt Ly Mc Cyt

Fraction Fraction

Fig.1・21. Phenol-sulfate conjugation activity of various subcellular fractions of livers.

- 33ー

(39)

以上の結果より，魚貝類肝臓のMO活性を測定するにはミクロソーム画分を，硫酸

抱合酵素活性を測定するにはシトゾル画分を用いればよいことが明らかになった。またヒブナとアサリの酵素活性はラットの数分の一以下であり，薬物の代謝能がかなり

低いことが明らかになった。しかしクルマエビでは，いずれの酵素活性も検出できなかった。j王ら32)はクルマエビ中腸腺にトリプシンインヒビターを添加してホモジナイ

ズすると. P-450含量とベンゾ[a]ピレン水酸化酵素の活性は検出で、きたが，硫酸抱合酵素の活性は検出できなかったと報告している。よってクルマエビで各薬物代謝酵素の活性が検出されなかったのはその中腸腺に含まれているトリプシン様消化酵素の作用により，ホモジナイズ時に薬物代謝酵素群が分解されたためと考えられる。

-34-

(40)

第2章コイ，ヒブナ，ニジマス，ティラピア，マダイおよびブリの肝臓，腎臓および鰐における薬物代謝酵素活性の比較

前章における研究の結果，魚類肝臓のミクロソーム画分とシトゾル画分に薬物代謝酵素が存在するととを明らかにした。しかし肝臓以外の器官における薬物代謝能は明らかでない。よって魚類の開蔵，腎臓および偲における勲勿代謝酵素の活性を調べた。

第1節酸化酵素の活性

1. 実験方法供試魚

供試魚、としてコイ (の'Prinus carpio )，ヒブナ，ニジマス(Oncorhynchus mykiss )，ティラピア(刀lapia nilotica )，マダイ(Pagrus major) およびブリ(Seriola quinqueradiata )を選んだ。コイは八代市の養殖業者より，ヒブナとニジマスは福岡市内の業者より購入し，いずれも1週間以上井戸水で、飼育したものを，マダイは福岡県前原町志岐漁協で養殖

したものを，ティラピアは当研究室でふ化・飼育したものを，ブリは九州大学農学部水産実験所で飼育中のものを用いた。各供試魚種の個体数，平均体重，肝臓，腎臓お

よび鯉、の平均重量はTable 2-1に示すようであった。

酵素活性の測定

(共試魚より肝臓，腎臓および偲を取り出し，第1章に述べた方法(Fig.1-1) により細胞分画を行った。肝臓は個体別に，腎臓および偲は必要量をプールして細胞分画を行った。得られたミクロソームおよびシトゾルの両画分はドライアイスーエタノールで急速凍結した後フリーザ-中( -80 OC)に保存し，後日分析に供した。ミクロソーム画分についてP-450含量およびNADPH-シトクロムc還元酵素， NADH-シトクロム

戸、J巧『d

(41)

Table 2-1. Number of test fishes， and the average weights of their bodies and organs subjected to the assay of enzyme activity.

Fish species Number Whole bodyl) Liver1) Kidney2) Gills2)

of fish (g) (g) (g) (g)

Carp 4 224.8土10.0 3.67土0.12 1.05 2.52

Goldfish 7 82.2土 9.2 3.92土1.52 0.31 0.64

Rainbow trout 4 352.5 :t 21.3 3.79土0.58 2.32 1.19

Tilapia 4 243.2土39.0 3.41土0.17 0.60 1.19

Red sea bream 5 428.9土56.0 3.27:t 0.15 0.59 1.51

Yellowtail 6 229.2土37.0 2.48土1.01 0.80 1.52

D Pδ 土

ρν ρiv σb ob

a a

MM ぽ

v v

A A

、‘E，ノ、、a，ノ1i 今ん

ぷU巧『d

(42)

bs還元酵素，ベンゾ、fa]ピレン水酸化酵素t 0-脱メチル酵素およびアミノピリンN-脱メチル酵素(N-脱メチル酵素)の各活性を測定した。

NADHーシトクロム bs 還元酵素の活性lまTAKESUEとOMURA33)の方法に従った。 Fig.

2-1 �C示すように，ミクロソーム試料に緩衝液と基質を加えた後 t NADHを添加して反応を開始させ，直ちLζ420 nm における吸光度を測定し，その増加率から酵素活性を算出した。

ベンゾ[a]ピレン水酸化酵素の活性はCAN1下ORTら34) の方法に従い， Fig. 2-2 �ζ示すように，ミクロソーム試料に緩衝液t NADPH生成系，補助因子および基質として r14C]ベンゾ[a]ピレンを添加した後， NADPHを加えて反応させ，未反応のベンゾ、[a]ピレンを除去した後，残った水溶液の放射能を測定し，使用したC4C]ベンゾ"[a]ピレンの比放射能から酵素活性を算出した。

Fig. 2-3に示すようにN-脱メチル酵素の活性はLA Duら35)の方法に従い，ミクロソ

ーム試料に緩衝液， NADPH生成系，補助因子および基質としてアミノピリンを添加した後， NADPを加えて反応させた。次いで，除蛋白し発色させた後�C， 415 nmの吸光値を測定し，活性を算出した。また， P-450の定量， NADPH-シトクロムc還元酵素と0-脱メチル酵素の活性の測定は，第1章の方法(Figs. 1-14， 1-5および1- 16)に従った。反応温度は，ニジマスで 250C，他の魚種では300C であった。

試薬

NADH， NADP， NADPHおよびアミノピリンはシグマ社より， C4C]ベンゾ[a]ピレン (比放射能 52mCiJmmol)および液体シンチレーターはAmersham社より入手したその他の試薬はすべて，市販特級レベルのものを用いた。

2結果と考察

Fig. 2-4 �C各魚種の肝臓，腎臓および偲におけるP-450含量， NADPH-シトクロムc

還元酵素， NADH-シトクロムbs還元酵素の活性をノ示した。肝臓では平均値と標準偏差

勺/司、】

(43)

Microsomal fraction， 0.1 ml.

Add 1.0 ml ofO.2M Tris-HCl buffer (pH 7.5)， 0.2 ml of 1 0 m M potassium ferricyanide， and 0.6 m1 of distilled water.

Preincubate for 5 min at 30 oc.

Add 6 mM NADH， 0.1 ml.

lmmediately start measurement of absorbance at 420 nm.

Fig. 2-1. Assay ofNADH-cyt. bs reductase activity in microsomal fraction of fish liver， kidney and gills.33)

-38-

(44)

Microsomal合action， 0.05 ml.

Add 0.1 ml of 0.5M Tris-HCl buffer (pH 7.6)， each 0.025 ml of 0.1 M MgC12， 0.1 M glucose四6四phosphate， glucose-6-phosphate dehydrogenase (20 units/ml) and 0.01 ml of [14C] benzo[a]pyrene (20μCiJml in acetone )^，and 0.215 ml of distilled water.

Add 0.025 ml of 10 mM NADPH and 0.025 ml of 6 mM NADH.

Incubate for 20 min at 30 OC.

Add 1 ml of 0.15 M KOH in 85 % dimethyl sulfoxide and 5 ml of hexane.

Shake for 5 min and cen甘ifuge at 3，000 rpm for 5 min.

Aqueous layer Hexane layer Repeat twice this ex廿action.

Aqueous layer (0.2 ml)

1

Ad刷ωdωωdωOωO川of 6N問附H舵Cαl ^加d 15 mloぱfAC山q中仰u∞e…_untω Measurement of radioactivity.

Fig.2-2. Assay of benzo[a]pyrene hydroxylase activity in microsomal fraction of fish liver， kidney and gills.34)

-39-

(45)

Microsomal合action， 1 ml.

Add 0.5 ml of 0.4 M Tris-HCl buffer (pH 7.4)， 0.05 ml of 0.3 M semicarbazide， and each 0.1 ml ofO.l M MgCl2，

0.1 M glucose-6-phosphate， glucose-6-phosphate dehydrogenase (20 unitsJml) and 32 rnM aminopyrine.

Add 0.1 ml of 10 mM NADP and incubate for 20 min at 30 OC.

Add 0.5 ml of 20 % ZnSO 4 and stand for 5 min.

Add 0.625 mI of saturated Ba(OH)2 and stand for 5 min.

Sup. ( 2ml ) PPt.

I Add 0.8 ml of Nash's r切ger'lt* and stand for 30 min at 60 min.

Absorbance at 415 nm

Fig. 2-3. Assay of aminopyrine N-demethylase activity in microsoma1 fraction of fish liver， kidney and gills.35)

Nash's reagent: CH3CONH4 40 g and Acetylacetone O.4g dissolved in 100ml of distilled water.

-40ー

(46)

Carp

Goldfish

Rainbow trout

Tilapia

lhご

Red sea bream

Yellowtail

Cytochrome P-450

。 0.2

NADPH-cyt.c reductase

0.4 0 20

NADH-cyt. bs reductase

40 0 2

Content

(nmol/mg-protein)

Activity

( nmol/min/mg-proteín)

Activity

(Ilmol/mín/mg-protein)

Fig.2・4 Cytochrome P-450 content ，and activities of NADPH-cyt. c reductase and NADH-cyt. b5 reductase in microsomes of liver， kidney and gills from several fishes.

仁コ ^Liver WÆ ^Kidney � ^Gills