Plasma - stimulated media の アポトーシス抵抗性悪性腫瘍に対する抗腫瘍作用 メカニズム

Plasma - stimulated media

の

アポトーシス抵抗性悪性腫瘍に対する抗腫瘍作用 メカニズム

日本大学大学院医学研究科博士課程 内科系感染症内科学専攻

徳永 智彦

年

指導教員 矢内 充

【目次】

略語一覧・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・1 概要・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・2 緒言・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・4 対象と方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・9 結果・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・15 考察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・19 まとめ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・26 謝辞・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・26

Figure・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・27 Figure Legends・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

39

引用文献・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・41

研究業績目録・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・45

1

略語一覧

A2058 : ヒトメラノーマ細胞株

DMEM : Dulbecco’s modified Eagle’s minimal essential medium FBS : fetal bovine serum

HBSS : Hank’s balanced salt solution

HOS : ヒト骨肉腫細胞株

PSM ： Plasma - stimulated media ROS : Reactive Oxygen Species

SOCE : store-operated Ca²⁺ entry

TRAIL ： Tumor necrosis factor ( TNF ) - related apoptosis inducing ligand WI-38 : ヒト肺線維芽細胞株

7-AAD : 7-amino-actinomycin D

2

【概要】

背景： Tumor necrosis factor ( TNF ) - related apoptosis inducing ligand

( TRAIL ) 、低温大気圧プラズマ ( Cold plasma ) 、 Cold plasma を細胞培養液に照

射して生成するプラズマ活性化メディウム ( Plasma - stimulated media ; PSM ) は、

腫瘍選択性を持つ次世代の抗がん剤として期待されている。

骨肉腫やメラノーマは予後不良の悪性腫瘍であり、これら次世代の抗がん剤の有効性 が期待されていたが、残念ながら TRAIL に対しては抵抗性を示すことが判明した。

Cold plasma や PSM においては、骨肉腫やメラノーマに対する効果や抗腫瘍効果

のメカニズムについて不明な点が多い。

目的： TRAIL と PSM の骨肉腫やメラノーマ細胞に対する抗腫瘍効果を直接比較す る。またその分子メカニズムを明らかにする。

対象と方法： TRAIL と PSM の骨肉腫細胞、メラノーマ細胞に対する抗腫瘍効果を 体系的に測定・比較した。

また細胞死に関与するカスパーゼ活性化、ミトコンドリアダイナミクス、細胞膜脱分 極、およびカルシウムシグナルに及ぼす影響を比較した。

3

結果： PSM は TRAIL 抵抗性悪性腫瘍細胞（ 骨肉腫細胞、メラノーマ細胞 ）に対

して強い抗腫瘍作用を示し、その抗腫瘍作用は活性酸素 ( Reactive Oxygen Species ;

ROS ) を介した遅延型カスパーゼ非依存性細胞死によるものであった。

また、 PSM は TRAIL よりも強くミトコンドリアならびに小胞体の細胞内のカル シウム恒常性を変化させること、そのカルシウムおよびミトコンドリア恒常性の変化に

は TRAIL よりも強力な細胞膜脱分極作用が寄与していることが示された。

結語： PSM は TRAIL 抵抗性悪性腫瘍細胞にも抗腫瘍効果を発揮することが示され

た。また、この抗腫瘍効果には、 ROS の蓄積、細胞膜電位の変化ならびにカルシウム

恒常性の破綻を介した遅延型カスパーゼ非依存性細胞死が関与しており、 PSM が

TRAIL抵抗性悪性腫瘍の治療に有用であることが示唆された。

4

【緒言】

骨肉腫、メラノーマは悪性度の高い悪性腫瘍であり、化学療法、放射線療法、免疫療 法などの各種治療に抵抗性を示す。様々な集学的治療により予後は改善されてきている が、劇的な予後の改善には至っておらず、新たな治療が必要とされている。

Tumor necrosis factor ( TNF ) - related apoptosis inducing ligand ( TRAIL ) なら

びに低温大気圧プラズマ ( Cold plasma ) は正常細胞に影響を与えず各種の腫瘍細胞

を特異的に傷害することが報告されており新たながん治療法として期待されている。

しかし、 Cold plasma は組織浸透性が小さく、直接照射する方法では治療標的が皮 膚がんなどの体表近くのものに限定される。そこで近年、細胞培養液に Cold plasma

を照射して生成したプラズマ活性化メディウム ( Plasma - stimulated media ; PSM )

が注目されている。

PSM も TRAIL と同様に悪性腫瘍に対して強い抗腫瘍作用を示す一方で正常細胞

はほとんど傷害しないことが示されている。しかしこれまで TRAIL と PSM の抗腫 瘍効果を同じ細胞系で比較した研究はなく、どちらが抗がんツールとして優れているか は不明である。

5 1. 骨肉腫

骨肉腫は原発性悪性骨腫瘍の中では最も頻度の高い疾患である。発生起源は不明であ る。以前は四肢の切断を余儀なくされ、切断しても肺転移などにより死亡する可能性が 高かった。現在では様々な外科的手技、医療機器、集学的治療の進歩により、健常部を 含めた広範切除と、欠損部に対する腫瘍型人工関節置換、皮弁移植術、自家骨移植術等 を併用し、四肢を温存することも可能になってきている。

近年、集学的治療として adjuvant 療法や neoadjuvant 療法が行われ、多剤併用化

学療法の進歩により、5年生存率は70％にまで向上している ( 1 ) ものの、未だ満足す

べき成績とはいえず、多くの患者は肺転移などにより死亡する。また、様々な治療の進

歩はあるが、化学療法で使用する薬剤はここ20年間でほとんど進歩しておらず、新た

な治療薬の開発が必要とされている。

2. メラノーマ ( 悪性黒色腫 )

メラノーマはメラノサイトを発生起源とする悪性腫瘍であり、ほとんどがメラノサイ トの存在する皮膚から発生し、日本人では特に足底に発生するものが多い。

メラノーマは非常に転移しやすく、早期ならば切除のみでの完治が望めるが、進行期 では骨肉腫同様、化学療法、放射線療法に抵抗性であり予後は不良である。メラノーマ でも様々な治療が試みられているが、予後の劇的な改善には至っておらず新たな治療が

6 必要とされている ( 2 ) 。

3．TRAIL

TRAIL は TNF スーパーファミリーに属するサイトカインであり、がん細胞のカス

パーゼ活性化、ミトコンドリアダイナミクス、カルシウムシグナル、および細胞膜脱分 極に影響を及ぼして抗腫瘍効果を示す一方、正常細胞には影響を与えないため、腫瘍選 択性を持つ次世代の抗腫瘍薬として期待されている。

4. 低温大気圧プラズマ ( Cold plasma )

プラズマは気体を構成する分子の一部または全体が陽イオンと電子に電離した状態

を指し、固体、液体、気体に並ぶ、物質の第4の存在状態である。半導体加工や機能性

薄膜堆積等においてプラズマ技術は不可欠であるが、近年医療分野においても応用が進 められ、なかでも温度が室温に近い Cold plasma が生体に作用し、止血、血管新生、

臓器癒着防止、細胞増殖促進などの多岐に渡る効果を示すことが報告されている。

また、 Cold plasma は比較的容易に作成することができ、正常細胞を傷害せず腫瘍

細胞を選択的に傷害するため新しいがん治療法として注目されている ( 3-6 ) 。

その作用機序は不明な部分が多いが、プラズマにより生成するフリーラジカル、励起 原子・分子、電子、紫外線などが作用していると考えられている。

7 5. Plasma - Stimulated Media ( PSM )

近年、細胞培養液に Cold plasma を照射して生成した PSM が注目されている。

我々は、ヘリウムガスの放電によって生成した Cold plasma をダルベッコ改変イー グル培地 [ Dulbecco’s modified Eagle’s minimal essential medium ; DMEM ] に照射 することにより PSM を作成した。

最近、 PSM が cold plasma と同様に正常細胞をほとんど傷害せず膠芽腫、胃がん および膵臓がんなどの様々な腫瘍細胞に対して in vitro および in vivo で抗腫瘍効果 を示すことが示されている ( 7-10 ) 。また、近年、種々の気体や媒体から作成された

PSM が多種多様ながん細胞 ( 大腸がん、卵巣がん、肺がん、神経膠芽腫 ) に抗腫瘍

効果を示すことが報告されている ( 11 - 14 ) 。しかしながら、 Cold plasma 照射と比

較して PSM の抗腫瘍効果のメカニズムはほとんど知られておらずその腫瘍選択性の 分子的基盤は不明であった。

我々は自身で作成した PSM の抗腫瘍作用を検討した結果、メラノーマ、神経芽腫、

骨肉腫などの薬剤耐性悪性腫瘍に対しても強い抗腫瘍作用を示すことを発見した

( 15 ) 。

さらに PSM 中に生成する過酸化水素 ( H2O2 ) 等の活性酸素 ( Reactive Oxygen

Species ; ROS ) がミトコンドリア内でスーパーオキシド等の二次的な ROS の産生と

蓄積を引き起こすこと、この酸化ストレスがミトコンドリアの断片化、凝集などのミト

8

コンドリア形態異常と細胞死を誘発すること、および腫瘍細胞は正常細胞に比較してこ の酸化ストレスに脆弱であることが腫瘍選択性の要因であると報告した ( 15 ) 。

6. ミトコンドリアならびに細胞内のカルシウムの恒常性

細胞内のカルシウム濃度の恒常性を維持することは細胞の生存や機能を維持するた めに重要である。我々は、ミトコンドリアのカルシウム恒常性の変化 ( 過剰負荷、過 剰減少 ) が TRAIL の抗腫瘍効果を促進することを報告している ( 16 , 17 ) 。

また、我々はミトコンドリアカルシウム量が過剰になるとミトコンドリアの繊維状構 造が断片化し、ミトコンドリアカルシウムが不足するとミトコンドリアが通常の繊維状 構造よりも過剰に融合することを明らかにしている ( 16 , 17 ) 。

7. 本研究の目的

前述のように TRAIL は様々な腫瘍に対して抗腫瘍効果を示すが、メラノーマや骨 肉腫は、 TRAIL に対して耐性であることが示されている ( 18 ) 。

そこで、今回、我々は同様な抗腫瘍効果を持つ PSM の骨肉腫、メラノーマに対す る有効性を検討し、 TRAIL との相違がどのような生物学的作用によるものなのかを

解明することで悪性腫瘍に対する新たな治療法の開発の可能性について検討した。

9

【対象と方法】

1. 実験準備

1-1. 使用試薬

遺伝子組み換えヒト可溶性 TRAIL はエンゾライフサイエンス社 ( サンディエゴ、

USA ) 、 Thapsigargin はシグマアルドリッチ社 ( セントルイス、 USA ) 、 Z - VAD

- FMK はメルクジャパン ( 東京 ) から購入した。 MnTBaP はコスモバイオ株式会

社 ( 東京 ) から購入した。これらの試薬はすべてジメチルスルホキシドに溶解し、ハ ンクス緩衝塩溶液 ( Hank’s balanced salt solution ; HBSS , PH7.4 ) で希釈し最終濃

度0.1%未満で使用した。

1-2. 細胞培養

今回の実験で用いたヒト骨肉腫細胞株 ( HOS ) 、ヒトメラノーマ細胞株 ( A2058 )

は ヘ ル ス リ サ ー チ ソ リ ュ ー シ ョ ン バ ン ク ( 大 阪 ) か ら 、 ヒ ト 肺 線 維 芽 細 胞 株

( WI-38 ) は国立研究開発法人医事基盤、健康、栄養研究所 JRBB 細胞バンクから購

入した。

これらの細胞は10%ウシ胎児血清 ( fetal bovine serum ; FBS ) を含む DMEM 中

で37℃、5％CO2インキュベーター内で培養した。

10 1-3. PSMの作成

本学理工学部にて開発されたプラズマジェット発生装置を用いて、電流20 mA 、印

加電圧8 kV、ヘリウムガス流量300 ml/分の条件で Cold Plasmaを生成した。

Cold plasmaをDMEM 1 ml に300秒間照射し PSM を作成した。 PSM は適宜

DMEM で希釈して用いた。

2. 実験方法

実験1. ヒト骨肉腫細胞、メラノーマ細胞、肺線維芽細胞に対する TRAIL および PSM

の細胞障害効果

HOS 細胞 ( 骨肉腫細胞 ) と A2058 細胞 ( メラノーマ細胞 ) は TRAIL ( 100

ng/ml ) または50%、25% PSM で、 WI-38細胞 ( 肺線維芽細胞 ) は TRAIL ( 100

ng/ml ) または 25% PSM で処理し、それぞれ 37℃、5％CO²インキュベーター内で

72 時間培養した後に細胞生存率を測定した。細胞生存率はセルカウンティングキット

( Dojindo 、熊本 ) を用いた WST - 8 法により測定した。試験試薬で処理、培養した

細胞に WST - 8 試薬を加え、インキュベーター内で1時間培養した後にマイクロプレ

ートリーダー ( ARVO MX 、パーキンエルマージャパン、東京 ) で吸光度を測定して 細胞生存率を算出した。なお、 WI-38 細胞を50% PSM で処理したものはコンタミネ

ーションによるばらつきが大きくなったため、今回のデータからは除外した。

11

実験2. 骨肉腫細胞、メラノーマ細胞における PSM によるカスパーゼの活性化とカスパ ーゼ阻害剤、スーパーオキシド消去の効果

実験2-1. TRAIL および PSM の骨肉腫細胞、メラノーマ細胞におけるカスパーゼ

3/7活性と7 - amino - actinomycin D ( 7-AAD ) に与える効果

HOS 細胞と A2058 細胞を TRAIL ( 100 ng/ml ) と25% PSM で処理した後、

Muse cell Analyzer ( MERCK MILLIPORE 、東京 ) でカスパーゼ3/7活性と細胞膜

傷害マーカーである 7-AAD を測定した。

細胞を24穴プレートに2×10⁵個/穴で播種し、試験試薬で処理した後、37℃、5％CO2

インキュベーター内で24時間培養した。その後、細胞に Muse™ Caspase-3/7 working

solution と Muse™ Caspase 7-AAD working solution を添加し、 Muse™ Cell

Analyzer によるフローサイトメトリーで、生存細胞 [ カスパーゼ3/7活性 ( － ) 、

7-AAD ( － ) ] 、前期アポトーシス細胞 [ カスパーゼ3/7活性 ( ＋ ) 、7-AAD

( － ) ] 、後期アポトーシス細胞 [ カスパーゼ3/7活性 ( ＋ ) 、7-AAD ( ＋ ) ] 、ネ

クローシス細胞 [ カスパーゼ3/7活性 ( － ) 、7-AAD ( ＋ ) ] の4つの領域に細胞を

分類したものを Muse™ Caspase-3/7 softwareで解析した。

なお、本実験では50% PSM を用いた場合、抗腫瘍効果が強すぎたため、 PSM は

25% PSM を用いた。

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実験2-2. PSM の骨肉腫細胞、メラノーマ細胞におけるカスパーゼ阻害剤、スーパーオ

キシド消去剤の効果

HOS 細胞と A2058 細胞を100% PSM と25% PSM で処理し、カスパーゼ阻害

剤である Z - VAD - FMK ( 10 μM ) とスーパーオキシド消去剤である MnTBaP ( 30

μM ) をそれぞれ添加し、72時間培養後、実験1と同様に WST - 8 法で生存率を測定

した。

実験3. TRAIL および PSM によるミトコンドリアネットワークの変化の評価

HOS 細胞と A2058 細胞を TRAIL ( 100 ng/ml ) と25% PSM で処理し、ミトコ

ンドリアネットワークの形態と核の形態を蛍光顕微鏡で観察した。

細胞を8穴カバースリップ ( アサヒガラス、東京 ) に1×10⁴個/穴で播種し、試験試

薬で処理した後、37℃、5％CO2インキュベーター内で 24 時間培養した。その後ミト

コンドリアを 20 nM Mito Tracker Red CMXRos ( ライフテクノロジージャパン、東

京 ) 、核を Hoechest 33342 ( Dojindo、熊本 ) で染色し37℃、5％CO²インキュベー

タ ー 内 、 暗 所 で 1 時 間 反 応 さ せ た 後 に 、 オ ー ル イ ン ワ ン 蛍 光 顕 微 鏡 BZ-X700

( KEYENCE、大阪 ) を用いて観察した。

なお、本実験でも50% PSM では抗腫瘍効果が強すぎたため、25% PSM を用いた。

13

実験4. TRAIL および PSM による細胞質、ミトコンドリア内カルシウムの恒常性の変

化

細胞質のカルシウムを Fulo-4 AM ( ライフテクノロジージャパン、東京 ) 、ミトコ ンドリアのカルシウムを Rhod-2 AM ( ライフテクノロジージャパン、東京 ) を用い て測定した。細胞を HBSS に懸濁し最終濃度を4 μM に調整した蛍光プローブでイン

キュベートした。インキュベートした細胞を96穴マイクロプレートに1×10⁶個/穴で播 種し試験試薬で処理した後にFluoroskan Ascent™ 蛍光マイクロプレートリーダにて

細胞質カルシウム濃度 ( [ Ca²⁺ ]^cyt ) とミトコンドリア内カルシウム濃度 ( [ Ca²⁺ ]^mit ) を測定した。

実験 4-1. PSM によるカルシウム恒常性の変化

HOS 細胞とA2058 細胞をHBSS に懸濁し Fulo-4 AM と Rhod-2 AM でインキ

ュベートし、12.5%、25%、50% PSM で処理し、処理直後を0分とし、1分、3分、5

分、10分後に [ Ca²⁺ ]cyt と [ Ca²⁺ ]mit を測定した。

実験 4-2. TRAIL および PSM による store-operated Ca²⁺ entry ( SOCE ) の変化

A2058 細胞を 1 mM EGTA を含む HBSS に懸濁し Fulo-4 AM でインキュベー

トし、96穴マイクロプレートに1×10⁶個/穴で播種し Thapsigargin ( 1 μM ) で処理し

た。処理直後を0分とし、1分、2分、3分、5分、10分後に [ Ca²⁺ ]^cyt を測定した。

14

その後、2 mM CaCl2を添加し11分、12分、13分後に [ Ca²⁺ ]cyt を測定した。

次に A2058 細胞を同様に処理した後に TRAIL ( 100 ng/ml ) と25%、50% PSM を

添加し、処理直後を0分とし、同様に [ Ca²⁺ ]^cyt を測定した 。

実験5. TRAIL および PSM の細胞膜脱分極作用

HOS 細胞、 A2058 細胞を HBSS に懸濁し DiBAC4(3) ( Dojindo、熊本 ) でイン キュベートし TRAIL ( 25 ng/ml , 100 ng/ml ) と100% PSM で処理した。処理直後

を0分とし、1分、3分、5分、10分後にFluoroskan Ascent™ 蛍光マイクロプレー トリーダにて細胞膜電位を測定した。

3. 統計処理

実験群間の統計的有意性は分散分析および Tukey’s test で解析し、値は平均値±標準偏 差で表記し、p＜0.05を有意とした。

15

【結果】

実験 1. ヒト骨肉腫細胞、メラノーマ細胞、肺線維芽細胞に対する TRAIL および PSM の細胞障害効果

TRAIL ( 100 ng/ml ) で72時間処理した場合、 HOS 細胞 、 A2058 細胞 の生存

率は未処理の場合と比較して有意な低下を認めなかった。一方、25%、50% PSM で処

理した場合は濃度依存的に HOS 細胞と A2058 細胞の生存率を有意に減少させた

( p＜0.01 ) ( Fig. 1 A , B ) 。

WI-38 細胞では、TRAIL 、 PSM による処理では、 HOS 細胞、 A2058 細胞と

もに生存率の有意な低下を認めなかった ( Fig. 1C ) 。

実験2. 骨肉腫細胞、メラノーマ細胞における PSM によるカスパーゼの活性化とカスパ ーゼ阻害剤、スーパーオキシド消去剤の効果

実験 2-1. TRAIL および PSM の骨肉腫細胞、メラノーマ細胞におけるカスパーゼ3/7

活性と7-AAD に与える効果

HOS 細胞では、 TRAIL は前期、後期アポトーシス細胞を有意に増加させなかった

が PSM は後期アポトーシス細胞を2.85%から26%まで有意に増加させた ( p＜0.01 )

16

( Fig. 2 A1-A4 ) 。 A2058 細胞では、 TRAIL ( p＜0.05 ) 、 PSM ( p＜0.01 ) はとも

に後期アポトーシス細胞を有意に増加させた ( Fig. 2 B1-B4 ) 。

実験 2-2. PSM の骨肉腫細胞、メラノーマ細胞におけるカスパーゼ阻害剤、スーパー オキシド消去剤の効果

HOS 細胞に PSM に MnTBaP を添加した場合、有意に生存率を改善させたが、

A2058 細胞では有意差を認めなかった ( p＜0.01 ) 。また、 PSM に Z - VAD - FMK

を添加した場合、 HOS 細胞、 A2058 細胞 ともに 100% PSM 、25% PSMのいず れにおいても細胞の生存率に有意な改善はみられなかった ( Fig. 2 C , D ) 。

実験 3. TRAIL および PSM によるミトコンドリアネットワークの変化

未処理の場合は HOS 細胞、 A2058 細胞の両方で健常な細胞核の周囲に網状のミ

トコンドリアが観察された。TRAIL で処理した場合は、細胞ならびに核の形態はほと んど変化させずミトコンドリアを短縮させたが線維状の構造は保たれていた。これに対 して、 PSM で処理した場合は核の断片化、ミトコンドリアの著しい断片化と凝集が 観察された ( Fig. 3 A , B ) 。

17

実験4. TRAIL および PSM による細胞質、ミトコンドリア内カルシウムの恒常性の変

化

実験 4-1. PSM によるカルシウム恒常性の変化

HOS 細胞では PSM ( 12.5% - 50% ) は1分以内に [ Ca²⁺ ]cyt と [ Ca²⁺ ]mit の両者を

増加させ、その効果は10分間持続した。 [ Ca²⁺ ]cyt の増加が濃度依存的であるのに対

して、[ Ca²⁺ ]mit の増加は高濃度ではむしろ少なくなる傾向であった ( Fig. 4 A1 - A2 ) 。

A2058 細胞ではPSM ( 12.5% - 50% ) は1分以内に [ Ca²⁺ ]^mit を増加させ、その効

果は10分間持続した。 [ Ca²⁺ ]cyt は PSM の濃度が増加すると変化が少なくなる傾向

であった ( Fig. 4 B1 - B2 ) 。

実験 4-2. TRAIL および PSM による store-operated Ca²⁺ entry ( SOCE ) の変化

PSM で処理した細胞では、無処理や TRAIL で処理した細胞に比べて小胞体プール

からのカルシウム放出を示す ΔF^release は有意に高値となり、その変化は濃度依存性を

示した ( p＜0.01 ) 。その一方で、ストア依存性カルシウム流入を示す ΔF^influx は PSM

で処理した場合、無処理や TRAIL で処理した場合よりも有意に低値を示し、この変 化も濃度依存的であった ( p＜0.01 ) ( Fig. 4 D , E1 - E2 ) 。

18 実験5. TRAIL および PSM の細胞膜脱分極作用

A2058 細胞、 HOS 細胞において PSM は1分以内に細胞膜脱分極を誘発し、その

効果は10分間持続した。これに対して TRAIL は100 ng/ml まで有意な膜電位の変化

を起こさなかった ( Fig. 5 A , B ) 。

19

【考察】

本研究では、抗腫瘍薬として期待される TRAIL と PSM の骨肉腫とメラノーマ細 胞に対する抗腫瘍効果の検討とそのメカニズムの解明のための実験を行ってきた。

実験 1 で PSM と TRAIL の抗腫瘍効果を骨肉腫細胞とメラノーマ細胞を用いて 比較した。その結果、 PSM は TRAIL 耐性の骨肉腫細胞、メラノーマ細胞に抗腫瘍

効果を示し、肺線維芽細胞に対する細胞毒性が低いことを確認した ( Fig. 1 A , B , C ) 。

これまでの報告では PSM は主としてアポトーシスを誘導して抗腫瘍効果を発揮す るとしてきた。

これに対し、我々は PSM が A375 細胞 ( メラノーマ細胞 ) で典型的なアポトー

シスとは異なる細胞死を引き起こすことを報告した ( 15 ) 。この細胞死はアポトーシ

スの効果因子であるカスパーゼ-3 の活性を阻害しても抑制されず、カスパーゼ-3 およ

びその基質のポリ ADP リボース合成酵素の切断が明瞭に認められなかった ( 15 ) 。 この結果を確認するために、実験 2 で PSM が誘導する細胞死の特徴を検討した。

HOS 細胞では PSM は初期 ( 24時間以内 ) には TRAIL よりも強くカスパーゼ

を活性化させ細胞膜傷害を誘発した ( Fig. 2 A1-A4 ) 。この結果から、 PSM が初期

( 24 時間以内 ) の段階ではカスパーゼの活性化と細胞膜傷害を誘発していると考えら

れた。

20

また、 HOS細胞、 A2058 細胞を PSM で長時間 ( 72時間 ) 処理したときに誘導

される細胞死は、カスパーゼ阻害剤である Z - VAD - FMK で抑制されなかった。一方

で HOS 細胞ではスーパーオキシド選択的消去能を有するマンガンポルフィリン化合

物 MnTBaP で細胞死が抑制されたが、 A2058 細胞ではその効果は認められなかった

( Fig. 2 C , 2 D ) 。

この結果より PSM は初期にはカスパーゼ-3/7 の活性化を誘発するが、 PSM によ

る遅発性の細胞死はカスパーゼ非依存的であり細胞種によってはスーパーオキシド依 存性であると考えられた。

また、我々は PSM がミトコンドリア内スーパーオキシドなどの不安定な ROS を

複数産生し、最終的に最も安定的な H2O2 が細胞死のメディエーターとして機能してい

る可能性が高いと報告した ( 15 ) 。実際に、低濃度の H2O2 はミトコンドリア膜電位

の消失およびカスパーゼ 3/7 の活性化およびアポトーシスを促進し、一方、高濃度の

H2O2 はカスパーゼ非依存性細胞死を誘発することも報告されている ( 19 ) 。

したがって、 PSM の刺激後の異なる時間 ( 24および 72時間 ) におけるカスパー

ゼ依存性アポトーシスならびに遅発型カスパーゼ非依存性細胞死の誘発は時間ととも

に H2O2 が高濃度に蓄積することによって誘導される細胞死がアポトーシスからカス

パーゼ非依存性細胞死へと切り替わったためであると考えられた。

しかし、以前の結果 ( 15 ) と同様に、 MnTBaP の効果は細胞種によって異なり、

21

PSM が誘導する細胞死におけるスーパーオキシドおよびそれに起因する H2O2 など

のオキシダントの役割は細胞によって相違があることが示唆された。しかしながら、非

特異的抗酸化剤である N-アセチルシステインが PSM が誘導する細胞死を細胞種に

関わらず抑制 ( 15 ) しており、PSM が誘導する細胞死に酸化ストレスが関与している

ことが示唆されている。

これらの結果を併せて考えると、PSM が誘導する細胞死は、細胞によって種類の異

なるスーパーオキシドおよびオキシダントが関与することが示唆される。今後さらにこ のようなオキシダントの同定と産生機構の解明を進めていく必要がある。

ミトコンドリアは、非常に動的な細胞小器官であり、ミトコンドリアネットワークを 形成し、その形や大きさは細胞内外の環境に応じてミトコンドリアが分裂、融合するこ とで顕著に変動している ( ミトコンドリアダイナミクス ) 。この分裂と融合のバラン スが網状構造のネットワークおよび機能を維持している。したがって、過剰な分裂や融 合はネットワークの破綻と重度の細胞機能の障害を引き起こす ( 20, 21, 22 ) 。我々は

TRAIL と PSM がともにミトコンドリアネットワークを標的としてその腫瘍選択的

な細胞毒性を発揮することを報告した ( 11 , 15 ) 。

ミトコンドリアの分裂はミトファジーによる劣化したミトコンドリアの排除に重要 であり、ミトコンドリアの分裂能が消失すると劣化したミトコンドリアの排除、ミトコ ンドリアの品質管理の不全が起き、ミトコンドリアネットワークが崩壊する。

22

一方でミトコンドリアの融合は、ミトコンドリア DNA やミトコンドリアの機能維

持に必要な代謝物の交換を促進しており ( 23 ) 、ミトコンドリアの融合能の消失はミ

トコンドリアの断片化およびミトコンドリアDNAの消失、ミトコンドリア膜電位の低

下、および呼吸障害をもたらす ( 24 ) 。

実験 3 で、TRAIL と PSM がミトコンドリアネットワークに与える影響を直接比

較した結果、 PSM が TRAIL ではわずかなミトコンドリアの断片化しか起こさない

条件においても、ミトコンドリアの著しい断片化と凝集を誘導したことから、 PSM は

骨肉腫細胞、メラノーマ細胞に対して、 TRAIL よりも強力にミトコンドリアネット ワークを破綻させることが示された ( Fig. 3 A,B ) 。

ミトコンドリアネットワークの異常が認められる場合は、細胞ならびに核の形態も変 化しておりミトコンドリアネットワークの異常が顕著なほど、細胞の生存率も低下する 傾向がみられた。これらの結果より、 PSM は TRAIL よりも強力に細胞死につなが るミトコンドリアネットワークの異常を誘発できると考えられた。

我々は、細胞内カルシウム動態、特にミトコンドリアカルシウムの恒常性を維持する ことが骨肉腫細胞やメラノーマ細胞の生存や機能を維持するために重要であり、その変 調が TRAIL による細胞死誘発に関与していることを見出した ( 16 , 17 ) 。

そこで、今回 PSM の細胞内カルシウム濃度に対する作用についても検討した。

23

実験4-1 では PSM がカルシウム恒常性の破綻を誘発し、 PSM も TRAIL と同様

に、細胞内カルシウムの恒常性を破綻させることで腫瘍細胞に対し細胞死を誘導してい

る可能性が考えられた ( Fig. 4 A1-A2 , B1-B2 ) 。

小胞体からミトコンドリアへのカルシウム流入は、細胞内カルシウムリザーバー機能 を持つオルガネラの品質管理ならびに細胞生存にとって極めて重要な役割を果たして

いる ( 25 ) 。SOCE は小胞体のカルシウムプールが枯渇するとこれを認識した

STIM1 が小胞体から細胞膜にトランスロケートし、その働きで Orai チャネルが活性

化し、開口して細胞外カルシウムが流入する仕組みである。小胞体からミトコンドリア に輸送されるカルシウムはミトコンドリアにおける代謝やエネルギー産生に必須であ

るため、 SOCE が機能不全になればカルシウム恒常性は大きなダメージを受けること

になる。特にミトコンドリアへのカルシウム供給が抑えられるため、エネルギー産生が

低下して、細胞が生存できなくなると考えられる。実際、 SOCE の活性化ががん細胞

の浸潤や転移を促進しているという報告もある ( 26 ) 。

実験 4-2 では PSM が小胞体にカルシウムを蓄積させることで SOCE によるカル

シウムの流入を阻害する ( Fig. 4 D,E ) ことから、 PSM は SOCE を阻害することで

抗腫瘍効果を発揮している可能性が考えられた。

今回はA2058 細胞での結果であるが、今後、 HOS 細胞でも同様の実験を計画して

いる。

24

我々は TRAIL によるアポトーシス誘発において、 TRAIL 刺激から２～４時間後

に細胞膜の持続的な脱分極がみられること、および種々の膜脱分極剤が TRAIL 感作

作用を示すことを報告している ( 27 ) 。さらに、持続的な細胞膜の脱分極がミトコン

ドリアの過剰な断片化と凝集に重要な役割を果たすことを明らかにしてきた ( 28 ) 。 本研究では PSM が細胞膜電位に与える影響と TRAIL との作用の違いを検討した。

実験 5 で HOS 細胞と A2058 細胞を PSM と TRAIL で処理した直後から細胞

膜電位を測定したところ PSM が TRAIL よりも強力に即時的で持続的な細胞膜の脱

分極を誘発することを見出した ( Fig. 5 A , B ) 。この結果は以前に報告したメラノー マを用いた研究 ( 29 ) と一致した。今後、25%、50%希釈の PSM でも同様の実験を 行い、脱分極の強さとの間に濃度依存的な関係性があるか確認する必要がある。

細胞膜脱分極は、生理学的なカリウムイオンとナトリウムイオン濃度の維持と細胞内 イオンの恒常性の破綻によって引き起こされる ( 30 , 31 ) 。また、細胞膜脱分極は電 位差依存性カルシウムチャネルを活性化して細胞内カルシウム動態に影響を与えるた め、細胞膜脱分極とカルシウムシグナルは相互に非常に密接に関連している。

我々はこれまでに悪性腫瘍細胞では細胞膜の脱分極を増強させることで小胞体スト レスが生じ TRAIL の細胞毒性が増強されること ( 11 ) 、およびミトコンドリア内カ ルシウム恒常性の破綻が TRAIL によるアポトーシスおよびカスパーゼ非依存性細胞

死を促進させることを報告した ( 17 ) 。

25

したがって PSM は、 TRAIL よりも強く細胞膜電位ならびにカルシウム恒常性の

破綻を誘発することにより、 TRAIL 抵抗性悪性腫瘍細胞においてもミトコンドリア

ネットワーク異常を惹起して、強力な抗腫瘍効果を示すと考えられた。さらに、細胞膜 が脱分極すると SOCE におけるカルシウムの細胞内への流入が消失し PSM による

強力な細胞膜脱分極が SOCE の阻害を誘発することで、 TRAIL よりも強力な抗腫瘍

効果を示す要因の一つであると考えられた。

現在のところメラノーマ、骨肉腫などの悪性腫瘍は TRAIL を含む多くの抗がん剤

に耐性を示し、治療が困難である。 本研究は PSM がこれらに対しても強い抗腫瘍効 果を示す一方で正常細胞に影響を与えないことを明らかにした。

今後、現時点では完全には同定されていない活性因子やその細胞膜電位、カルシウム、

ミトコンドリアダイナミクスに対する作用機構を解明していく必要がある。

また、今後、 PSM を臨床応用するにあたっては、培養液をヒトに投与することは 現実的に難しく、人体に害のない培養液として新たなプラズマ活性化溶液を検討する必 要がある。また、プラズマが遺伝子発現に影響を与えているという報告もあることから

( 6 , 10 ) 、生体への安全性も検討していく必要がある。プラズマ医療が有効な治療方

法として確立されるようにこれらの課題を克服していく必要があると考えられた。

26

【まとめ】

本研究で我々は、 PSM が TRAIL 抵抗性を示すメラノーマ細胞、骨肉腫細胞に対

しても抗腫瘍効果を示すことを明らかにした。 PSM はこれらの TRAIL ( アポトーシ

ス ) 耐性の悪性腫瘍細胞にカスパーゼ非依存性細胞死を強く誘発するため、メラノー マ、骨肉腫などの難治性の悪性腫瘍に対する新たな治療法ツールとして期待されると考 えられた。

【謝辞】

本研究に関し、利益相反はありません。本研究に関して、研究、学会発表、国際雑誌

への投稿ならびに学位論文の御指導、御校閲を直接賜りました鈴木良弘博士 ( 前生理

学分野助教、現一般社団法人プラズマ化学生物学研究所代表理事、英国王立医学協会フ ェロー ) に深謝いたします。また、研究のご指導を賜りました鈴木美喜研究員に深謝 いたします。

本研究のご指導を賜りました日本大学医学部内科学系総合内科・総合診療医学分野、

矢内充准教授、相馬正義教授ならびに日本大学医学部皮膚科学系皮膚科分野、落合豊子 教授、小野江明日香先生に深謝いたします。

27

Figure 1 １

28

Figure 2

29

Figure 2 ( Continued )

30

Figure 2 ( Continued )

31

Figure 2 ( Continued )

32

Figure 2 ( Continued )

33

Figure 3

34

Figure 4

35

Figure 4 ( Continued )

36

Figure 4 ( Continued )

37

Figure 4 ( Continued )

38

Figure 5

39

Figure. 1 HOS 細胞 ( A ) 、 A2058 細胞 ( B ) 、 WI-38 細胞 ( C ) に対する TRAIL

および PSM の細胞障害効果

結果は平均±標準誤差で表記した。n=3.

Figure. 2 TRAIL および PSM による HOS 細胞 ( A ) 、 A2058 細胞 ( B ) における

カスパーゼ3/7活性と7-AAD に与える効果および PSM の HOS 細胞 ( C ) 、 A2058

細胞 ( D ) におけるカスパーゼ阻害剤、スーパーオキシド消去剤の効果

A 1 , B 1 ; 未処理

A 2 , B 2 ; TRAIL 処理

A 3 , B 3 ; PSM 処理

A 4 , B 4 ; A 1 - A 3 および B 1 - B 3 の集計結果を平均±標準誤差で表記した。

C , D ; Z - VAD - FMK と MnTBaP を添加した結果を平均±標準誤差で表記した。

n=3.

Figure. 3 TRAIL および PSM による HOS 細胞 ( A ) と A2058 細胞 ( B ) のミト

コンドリアネットワークの変化

ミトコンドリアは Mito Tracker Red で赤に、核は Hoeckst33342 で青に染色され ている。

40

Figure. 4 A , B HOS 細胞 ( A ) とA2058 細胞 ( B ) における PSM によるカルシウ

ム恒常性の変化

[ Ca2+cyt ] ; 細胞質カルシウムイオン

[ Ca2+mit ] ; ミトコンドリア内のカルシウムイオン

Figure. 4 C , D, E TRAIL および PSM の SOCE の変化

ΔFrelease ; 小胞体プールからのカルシウム放出

ΔFinflux ; ストア依存性カルシウム流入

C ; 未処理時の ΔFrelease と ΔFinflux の変化

D ; TRAIL および PSM で処理した時の ΔFrelease と ΔFinflux の変化

E1 , E2 ; Figure. 4 D より得られた ΔFrelease と ΔFinflux の集計結果

Figure. 5 A2058 細胞 ( A ) 、 HOS 細胞 ( B ) における TRAIL および PSM の細胞

膜脱分極作用

41 引用文献

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46

研究業績目録

徳永 智彦

Ⅰ 発表

① 一般発表 18

② 特別発表 なし

Ⅱ 論文

① 原著論文 0 (共 0)

② 症例報告 0 (共 0)

③ 総説 なし

④ Letter 1 (共 1)

Ⅲ 著書 なし