緒論

(1)

学位論文博士(薬科学)

免疫異常を伴う皮膚疾患の新規治療薬開発を目的としたホスホジエステラーゼ7選択的阻害剤の創薬研究

平成27年度

遠藤勇介

(2)

略号一覧

Ac acetyl

aq. aqueous

Asp aspartic acid

Boc tert-butoxycarbonyl

BSA bovine serum albumin

Bu butyl

cAMP cyclic adenosine monophosphate CD cluster of differentiation

cGMP cyclic guanosine monophosphate COPD chronic obstructive pulmonary disease dba dibenzylideneacetone

DCM dichloromethane

DMF N,N-dimethylformaldehyde DMSO dimethyl sulfoxide

dppf 1,1'-bis(diphenylphosphino)ferrocene DPPP 1,3-bis(diphenylphosphino)propane EDTA ethylenediaminetetraacetic acid ELISA enzyme-linked immunosorbent assay ESI electrospray ionization

Et ethyl

FAB fast atom bombardment

FBS fetal bovine serum

Gln glutamine

HEPES 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid HOBt 1-hydroxybenzotriazole

HPLC high performance liquid chromatography

i- iso-

IC50 half maximal inhibitory concentration

IL-2 interleukin-2

LAH lithium alminum hydride LDA lithium diisopropylamide

LE ligand efficiency

Leu leucine

LiHMDS lithium bis(trimethylsilyl)amide mCPBA meta-chloroperoxybenzoic acid

Me methyl

(3)

MS mass spectrometry

mw microwave

NASH non-alcoholic steatohepatitis

NIS N-iodosuccinimide

NMM N-methylmorpholine

NMR nuclear magnetic resonance

PDB protein data bank

PDE phosphodiesterase

Ph phenyl

Phe phenylalanine

Pin pinacol

POC proof of concept

rt room temperature

SAR structure activity relationship SPA scintillation proximity assay t- or tert tertiary

TBAF tetrabutylammonium fluoride

TEA triethylamine

TFA trifluoroacetic acid

THF tetrahydrofuran

TMS tetramethylsilane

Ts para-toluenesulfonyl

Tyr tyrosine

WSC water-soluble carbodiimide

X-Phos 2-(dicylclohexylphosphino)-2',4',6'-triisopropylbiphenyl

(4)

緒論 1

本論

第一章チエノピリミジノン構造を有するリード化合物の取得 5 第二章水溶性を有し、強力なPDE7阻害剤である

2-(4-pyridylamino)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one誘導体の創製とSAR研究

14

第三章強力なin vivo薬効を示す選択的PDE7阻害剤である

2-(isopropylamino)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one誘導体の創製

21

結論 30

実験の部 32

参考文献 59

謝辞 61

(5)

1

緒論

ホスホジエステラーゼ（PDE）はセカンドメッセンジャー分子である環状アデノシン一リン酸（cAMP）

と環状グアノシン一リン酸（cGMP）を加水分解する酵素である。現在までに、11種類のファミリーに分類され、PDEファミリー全体として21種類の遺伝子が同定されている。cAMPを選択的に加水分解する PDE分子種（PDE4, PDE7, PDE8）及びcGMPを選択的に加水分解するPDE分子種（PDE5, PDE6, PDE9）

が知られており、残りの分子種はcAMPとcGMPの両方を加水分解することが知られている。この基質選択性は、PDE分子中で、周辺の残基が形成する水素結合ネットワークによって、基質（cAMPとcGMP）

がグルタミンに固定化されることで、制御されている¹（Figure 1）。

Figure 1. PDE分子中のグルタミンによるヌクレオチド選択性の制御。A) PDE4DにおけるcAMPの認識

に369位グルタミン（Gln369）が関与、B) PDE5AにおけるGMPの認識に817位グルタミン（Gln817）

が関与

PDEは、様々な病気に対する治療剤として期待できる標的分子である^2,3。これまでに、PDE3、PDE4、

PDE5の阻害剤がそれぞれ、心疾患、COPD及び勃起障害の治療薬として臨床で用いられている。PDE7 阻害剤は、cAMPの加水分解を阻害することにより、体内におけるcAMPの濃度を上昇させる。さらに、

活性化T細胞やB細胞を上方制御する。したがって、PDE7阻害剤は、T細胞が関与する疾患に対する治療剤として、広い応用が期待できる。実際に、PDE7は白血病⁴、中枢神経系障害⁵、呼吸器障害⁶を含む様々な病気の治療剤における標的分子として考えられている。また、PDE7は表皮組織中でも多く発現していることがマウスで確認されている。PDE4に対する阻害剤は優れた抗炎症作用を示すことが知られており、既に多くの選択的PDE4阻害剤が種々の炎症性疾患治療剤として臨床評価されている（Table 1）が、

細胞種によって作用強度に大きな差があり、特に活性化した表皮角化細胞に対しては抑制作用を示さないことが報告されている¹⁶。

Gln369

Gln817 Tyr406

Tyr329 Gln775

Asn321

Ala767

Trp853

(6)

2

Table 1. 皮膚疾患を対象とする臨床試験中のPDE阻害剤

化合物名開発会社化学構造適応疾患備考

Crisaborole Anacor Pharmaceuticals

アトピー性皮膚炎 (P3)、尋常性乾癬 (P2)

PDE4とPDE7を両方阻害。

AN-2898 Anacor

Pharmaceuticals

アトピー性皮膚炎 (P2)、乾癬 (P1)

PDE4とPDE7を両方阻害。

Crisaboroleより強い in vitro作用。

Roflumilast Takeda

COPD (発売済)、喘息 (P3)、アトピー性皮膚炎 (P2)、 NASH (P2)

選択的PDE4阻害剤。

外用剤として乾癬でのP2試験を予定していたが、中止。詳細は不明。

GW-84247 0

biocrea/

GlaxoSmithKline

COPD (P2)、喘息 (P2)、アトピー性皮膚炎 (P2)、アレルギー性鼻炎 (P2)

アトピー性皮膚炎で P2試験に入ったが、

その後の更新無し。

E-6005 Eisai アトピー性皮膚炎

(P2)

PDE4阻害剤。アトピー性皮膚炎患者におけるP1/2試験で症状の改善傾向が認められた。

MK-0873 Merck & Co.

COPD (P2)、関節炎 (P2)、尋常性乾癬 (P1)

2010年から2%クリーム剤を用いた乾癬 POC試験を実施。試験は既に終了しているが、結果未発表でその後の更新無し。

(7)

3

一方、これまでに選択的PDE7阻害剤の臨床試験は実施されていないが、近年、CSIC社^7,8、Celtech社

9、Pfizer社^10,11、Biocrea社¹²、BMS社¹³及びその他^14-16の複数の研究機関から報告されており（Chart 1）、免疫細胞だけで無く、表皮角化細胞に対しても抑制効果を発揮することが報告されている。

Chart 1. 選択的PDE7阻害剤の報告例

アスビオファーマ社のPDE7阻害剤（ASB16165）はマウスを用いた皮膚の炎症モデルにおいて、抗炎症作用を示しており、PDE7は、炎症性疾患の治療に対する有用な標的分子であると考えられる¹⁶。また、

臨床で使用した際、他のPDE分子種の阻害は、望まない副作用を生じる可能性があることから、選択的阻害剤が望ましいと考えられた。

以上の背景から、著者は、PDE7を強力に阻害することにより、抗炎症作用と表皮角化細胞の活性化抑制作用を示す、薬効の高い外用剤を目標とした。さらに、選択的なPDE7阻害剤とすることで、望まない副作用を回避することを目指した。本研究の適応疾患として、未だ治療方法に改善の余地がある乾癬を選択した。現在、乾癬患者の8割は軽症に分類され、ビタミンD製剤やステロイドの外用剤による治療を受けているが、ステロイド剤の長期使用は敬遠され、ビタミンD製剤には遅効性、皮膚刺激性等の問題がある。これらの既存外用剤の問題点から、①優れた抗炎症作用を示し、ステロイド剤のような副作用を発現しない、②表皮角化細胞の機能異常を改善し、即効性のある外用剤は、乾癬患者の治療満足度

TA-7906 Maruho 構造非開示アトピー性皮膚炎

(P2)

田辺三菱製薬からマルホに導出された

PDE4阻害剤。

OPA-15406 Otsuka 構造非開示アトピー性皮膚炎

(P2)

PDE4阻害剤。

軟膏でP2試験中。

DRM-02 Dermira 構造非開示

酒土性座瘡 (P2)、アトピー性皮膚炎 (P2)、尋常性乾癬 (P2)

PDE4阻害剤。

ゲルで開発中。

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4

を満たす新規の外用剤となりうると考えられる。また、症状の重い患者に対して用いられる抗体医薬は、

単剤で強い治療効果を示すことが明らかとなっているが、治療費が高価である。さらに、効果を示した場合においても病変部位が残存するケースも多く報告されている。したがって、上記のコンセプトを満たす安価な外用剤は、既存治療法からの代替や抗体医薬との併用により、さらに高い満足度を示す治療方法となると考えられる。

選択的PDE7阻害剤を見出すためのPDE分子種選択性については、グルタミンとの相互作用をコントロールすることで、cGMPを選択的に加水分解する分子種（PDE5, PDE6, PDE9）に対する選択性を理論的に構築できる。一方で、cAMPを加水分解する他の分子種（PDE4やPDE8など）に対する選択性は、

構造が極めて近いものもあるため、理論的に導くことは困難であると考えられた。したがって、ライブラリー化合物から多様な母核構造を有する複数のヒット化合物を得て、合成展開することにより、選択性を有するリード化合物を見出すことを目指した。今回、複数のヒット化合物の中から、チエノピリミジノン構造を有するヒット化合物に対し、コンピューターモデリングとリガンド効率を指標とすることで効率的にリード化合物を探索した。その結果、選択性を有するリード化合物28eを取得した¹⁷（Figure 2）。

Figure 2. 本研究の概要

続いて、得られたリード化合物の最適化を実施することで、in vivoで抗炎症作用を示す臨床候補化合物の取得を目指した。2位置換基について芳香族アミンを検討することにより、2位に4-ピリジルアミノ基を有する2-(4-pyridylamino)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one誘導体¹⁸が、良好な溶解度、PDE7選択性及び活性を示した。

さらに、2 位置換基について脂肪族側鎖を検討することにより、高い溶解性を示す 2-(isopropylamino)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one 誘導体の取得に成功した ¹⁹。得られた 3-ピロリジン体 97は、マウスTPA耳介浮腫モデルにおいて、強力な抑制作用を示した。本化合物は、炎症性疾患における臨床候補化合物として、より詳細な研究を行うのに値するものであると言える。

(9)

5

本論

第一章チエノピリミジノン構造を有するリード化合物の取得

始めに、PDE7阻害活性を指標に、自社化合物ライブラリーのスクリーニングを実施し、チエノピリミジノン構造を有する化合物5-7を得た（Figure 3）。

Figure 3. スクリーニングにより得られたヒット化合物

得られた5-7は、強力なPDE7阻害活性（IC50=160~1100 nM）を示し、既知のPDE7阻害剤とは異なる構造を有していた。本研究では、化合物の有用性を評価する際の指標として、リガンド効率（ligand efficiency,

LE）^20,21を用いた。リガンド効率（kcal･mol^-1･HA^-1）は、次式を用いて計算した。

LE = -RT[ln(IC50)](HA)^-1

ここで、R = 1.987×10-3 kcal･mol^-1･K^-1、T = 298 K、HA = 重原子数の値を用いた。この値が高いほど、

分子が重原子数に対して効率よく活性を示していることとなり、良好なリード化合物であると言える。

Figure 3に示す3種のヒット化合物は、いずれもLE値が約0.30という良好な値を示した。本章では、こ

のリガンド効率を指標に、ヒット化合物をリード化合物へ導くことを目指した。

次に、PDE7に対するヒット化合物の結合様式を推定するため、コンピューターモデリングを実施した。

既知のPDE7共結晶情報（PDB ID 1ZKL²²）をテンプレートとし、ソフトウェアとしてGlideとMaestro²³ を用いることで、化合物5の推定結合様式を得た（Figure 4）。

(10)

6

Figure 4. 化合物5とPDE7の推定結合様式

得られた推定結合様式において、チエノピリミジノン構造の縮環部位が、Phe384とCH-π相互作用及

びPhe416とπ-π相互作用しており、カルボニル基がGln413と水素結合していると考えられた。これら

3つの相互作用部位は、PDE7阻害活性を示すために重要な役割を示していると考えられた。したがって、

それらの相互作用を維持する構造を設計し、合成することで強力なPDE7阻害剤の取得を目指すこととした。

そこで、本モデルを用いた効率的な構造活性相関情報（SAR）取得に向け、次の方針を立案した。

（１） PDE7阻害活性の発現に重要な最小構造を探索するため、分子サイズを小さくしていく。

（２）ライブラリー化合物のスクリーニング結果のみでは、情報が不十分である6位部分の置換基変換を実施する。

（３）結合ポケットにおいて、広い空間を有していると考えられた7位部分のSARを取得する。

上記の3つの方針に基づき、強力かつ選択的なPDE7阻害剤の探索を開始した。

始めに、方針（１）に従い、PDE7阻害活性を示す最小構造を明らかにするため、初期の構造活性相関情報取得を実施した（Figure 5）。

Figure 5. 初期の構造活性相関情報

得られたヒット化合物の中で、共通構造である化合物8を設計し、合成した。その結果、ヒット化合物と比較して活性が低下したもののリガンド効率としては、同程度の値を示した。さらに、6位のフェニ

(11)

7

ル基を削減した化合物9は、わずかに活性が向上し、リガンド効率が大きく向上した。化合物9は、モデリングにより予測された3つの相互作用を有していると考えられ、PDE7阻害活性を示す最小構造であると言える。次に、Pfizer社のチアジアゾール化合物やASB16165に見られるシクロアルキル基を参考に、

アリルアミンをシクロアルキルアミンに変換した。その評価結果は、予想以上に良好であり、2位にシクロペンチルアミノ基を有する化合物10が望ましい活性向上を示した。シクロヘキシル基を導入した化合物11も合成し、活性の向上が見られたが、シクロペンチル基の方が良好であった。したがって、化合物 10を基に、更なる構造活性相関情報取得を行うこととした。

続いて、方針（２）に従い、様々な大きさの6位置換基を有する化合物を設計し、合成した（Scheme 1）。

Scheme 1. 6位に置換基を導入する反応条件: (a) ethyl isothiocyanate, pyridine, reflux, 76–84%; (b) NaH, MeI, DMF, 0 °C, 98%; (c) K2CO3, MeI, CH3CN, rt, 75%; (d) mCPBA, DCM, rt, 66-87%; (e) cyclopen- tylamine, THF, reflux, 74-89%; (f) PhNMe3·Br3, CaCO3, DCM, MeOH, rt, 48%; (g) LDA, DMF, THF, 0 °C, 71%; (h) MeMgBr, THF, 0 °C, 84%; (i) PdCl2, Et3SiH, EtOH, rt, 54%; (j) 3-aminopyridine, toluen- e, reflux, then NaBH4, MeOH, rt, 62%; (k) H2, Pd(OH)2, MeOH, rt, 47%; (l) LDA, CO2, THF, 0 °C, 100%; (m) 1-(5-aminopyridin-2-yl)piperidin-4-ol,²⁴ WSC, HOBt, NMM, DMF, rt, 62% (n) H2, Pd/C, THF, rt, 5%.

アミン体12a, bにイソチオシアン酸エチルを反応させ、縮環体13a, bを得た。ヨードメタンを用いて

化合物13a, bをメチル化し、スルフィド基を酸化することでスルホン体14a, bを得た。得られた化合物

14a, bのメチルスルホニル部分をシクロペンチルアミンで置換することにより、アミン体10および15

をそれぞれ得た。続いて、6位置換基を官能基化するため、化合物10から次の4工程で誘導化した。トリメチルフェニルアンモニウムトリブロミドを用いた化合物10の位置選択的なブロモ化により、臭化物 16を得た。化合物16から、LDAとDMFによってアルデヒド体17を得た。化合物17に対し、Grignard

(12)

8

反応を行った後、トリエチルシランと塩化パラジウムを用いた水素化²⁵によって、エチル体18を得た。

なお、この還元により、2級水酸基とブロモ基の両方を除去した。続いて、中間体17の還元的アミノ化後、ブロモ基を還元することでアミン体19を得た。また、LDAとCO2（ドライアイス）を化合物16に作用させることでカルボキシル基の導入を行った後に縮合し、続いてブロモ基を還元することでアミド体20を得た。

チエノピリミジノンの6位部分に関する構造活性相関情報をTable 2に示した。なお、PDE7と同様に cAMPを選択的に加水分解し、最も近い構造であるPDE4に対する活性も示した。

Table 2. 6位置換基の異なる化合物の構造活性相関情報

化合物 R¹ IC50 (nM)

LE^c PDE7A^a PDE4B^a

10 H 150 4900 0.52

15 Me 11000 ND^b 0.36

18 Et 6500 3500 0.35

19 >1000 920 <0.31

20 2600 ND 0.22

a IC₅₀値は、2試験以上の平均値。^bND = 未測定。^cPDE7Aに対するリガンド効率

予想に反して、メチル基やエチル基といった小さな置換基の導入が、43―73倍の活性低下を生じた。

それに伴いリガンド効率も低下した。より嵩高い置換基の導入はわずかな活性向上へと導いたが、そのリガンド効率はさらに低下した。さらに、化合物18および19は、PDE7よりもPDE4に対する活性が高い結果となり、望まない選択性を示した。リガンド効率及び選択性の低下という結果を受け、6位置換基に関するこれ以上の検討は行わなかった。

これまでの構造活性相関情報から、6位及び7位に置換基を有さないチエノピリミジノン化合物（化合

物10）が、32倍のPDE4選択性を示すことが分かった。これは、本系統において、PDE分子種選択性を

有する化合物が取得できる可能性を示している。また、6位置換基が、立体障害などにより、リガンドと PDE7の相互作用を阻害していると考えられた。さらに、PDE7触媒部位の推定結合様式から、7位周辺に開かれた空間が存在すると推定できた。したがって、著者は、7位置換体の合成に着手した。

鍵中間体である化合物16を基に、7位を置換したチエノピリミジノン誘導体を設計し、合成した

（Scheme 2）。

(13)

9

Scheme 2. 7位に置換基を導入する反応条件: (a) trimethylboroxine, Pd(PPh3)4, K2CO3, H2O, 1,4-dioxane, 100 °C, 83%; (b) potassium vinyltrifluoroborate, PdCl2(dppf)·CH2Cl2, TEA, EtOH, 80 °C, 71%; (c) H2 (3 atm), 10% Pd/C, THF, rt, 85-99%; (d) ethynyltrimethylsilane, PdCl2(PPh3)2, CuI, TEA, CH3CN, 80 °C, 19%; (e) TBAF, THF, rt, 92%; (f) CuCN, DMF, 150 °C, 24%; (g) alkyne, PdCl2(PPh3)2, CuI, CH3CN, 80 °C, 38-49%; (h) Ar-B(OH)2, Pd(OAc)2, PPh3, saturated aq NaHCO3, DMF, EtOH, 80 °C, 77-99%; (i) Ar-BPin, Pd(PPh3)4, K3PO4, 1,4-dioxane, 90 °C or reflux, 28-64%. (j) tert-butyl 3-oxopiperazine-1-carboxy- late, CuI, N,N-dimethylethylenediamine, K3PO4, 1,4-dioxane, reflux, 59%.

ブロモ体16に対し、鈴木―宮浦反応や薗頭反応などのカップリングを行い、化合物21、22、24-26お

よび28-30を合成した。化合物22および26a,bに対してパラジウム触媒を用いた接触還元を行い、化合

物23および27a,bをそれぞれ得た。

得られた化合物21-30のPDE7及びPDE4の阻害活性を測定した（Table 3）。加えて、活性化されたマウスリンパ球におけるIL-2の産生抑制作用についても測定した。この試験系は、ヒト血中のT細胞の活性化が、PDE7の誘導と関与していることが報告されており²⁶、細胞における機能評価系として実施した。

なお、T細胞におけるサイトカイン産生において、PDE7よりもPDE4の寄与が大きいことが報告されている²⁷一方で、他社のPDE7選択的阻害剤（ASB16165及びPF 0332040）が活性化T細胞におけるサイトカイン産生抑制を示すことが報告されている^28,29。また、リガンド効率についても算出した。

(14)

10

Table 3. 7位置換基の異なる化合物の構造活性相関情報

化合物 R² IC50 (nM)

LE^c

PDE7A^a PDE4B^a IL-2^b

10 H 150 4900 5400 0.52

21 Me 98 3800 >3000 0.50

23 Et 42 5900 2900 0.50

22 30 3700 980 0.51

24 45 3000 560 0.50

25 67 3200 890 0.49

26a 4.2 1400 1300 0.44

26b 19 820 1700 0.39

27a 7.3 1100 1000 0.43

27b 39 3400 2000 0.37

28a 5.6 720 1800 0.47

28b 380 3800 9100 0.31

28c 5.0 480 290 0.40

28d 4.9 1000 1300 0.40

28e 2.0 380 89 0.49

29a 2.3 640 1000 0.38

29b 1.0 520 77 0.41

30 12 3300 3000 0.21

aIC₅₀値は、2試験以上の平均値。^bIC₅₀値は、4試験以上の平均値。^cPDE7Aに対するリガンド効率

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11

始めに、7位に脂肪族置換基を有する化合物を評価した（化合物21-24）。メチル基及びエチル基は、高いリガンド効率を維持しつつPDE7阻害活性に良い効果を示した。6位置換体とは対照的に、PDE4に対する良好な選択性を示した。ビニル基、エチニル基やシアノ基のような不飽和結合を含む置換基の導入は、メチル基やエチル基を有する化合物と同程度の結果であった。一方で、より嵩高い置換基であるピリジン環を有する化合物26aおよび27aは、極めて高い親和性を示した。この2化合物は、特に高いリガンド効率を示し、PDE4阻害活性に対して150倍の選択性を有していた。

株式会社創晶に依頼し、化合物24とPDEのX線共結晶構造解析を実施した（Figure 6a、PDB ID 4PM0）。観測された相互作用を2次元図で表したFigure 6bにおいて、化合物24のカルボニル基の酸素がGln413 と水素結合していた。また、チエノピリミジノン環に対し、Phe384とのCH-π相互作用及びPhe416との π-π相互作用が観測された。さらに、化合物24のNHは、水分子と水素結合を形成していた。この水分子は、Tyr211とAsp362の側鎖と水素結合することによって安定化していることが分かった。続いて、ヒット化合物5の推定結合様式における構造（緑色）を重ね合わせた（Figure 6c）。チエノピリミジノン環の相互作用ポイント（上記のCH-π、π-π相互作用及び水素結合）はモデリングからの推測と一致したが、チオフェン環の位置がわずかに異なっていた。そのため、6位置換基が占める位置が予測と実測で異なることが分かった。この共結晶構造解析の結果は、6位置換基と7位置換基の活性差をよく説明している。即ち、6位置換基の導入では、化合物とその周辺残基（Leu401など）の間に立体障害が生じて活性を低下するのに対し、7位置換基導入については、その伸長方向に開かれた空間が存在するため、活性が向上したと考えられる。

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12

Figure 6. PDE7Aの触媒部位と化合物24の共結晶構造（PDB ID: 4PM0, 分解能2.1 Å）。a) 結合部位の残基と24の複合体。水素結合を点線で表し、重要な水分子を表記している。b) Maestro 9.3で発生させた24 の2次元相互作用図。 c) 24と推定結合構造（ヒット化合物5、緑色）の重ね合わせ図

当初得られた推定結合様式とX線結晶構造は、相補的な役割をしていると考えられる。推定結合様式は、ヒット化合物を同定する段階で迅速に用いることができ、7位置換基の導入という戦略を導いた。この予測は正しく、7位置換基の探索は、活性と選択性向上という結果を得た。一方で、推定結合様式の限界も明らかとなった。それは、6位及び7位置換基間のSARを説明することが困難であったことである。

しかしながら、既に述べたように、リード探索段階でX線結晶構造を用いることにより、SARをよく説明できたと言える。

7位置換基による影響を調べるため、さらに最適化を実施した。ベンゼン環（28a-d, 29a）及びピリジン環（28e, 29b）を有する化合物を合成し、評価した。ベンゼン環の導入（28a）は、極めて強いPDE7 阻害活性を示し、無置換の10と比較して、活性が27倍向上していた。メチルエステルをメタ位及びパラ位にそれぞれ有する化合物（28c, d）についても適した活性を示した。オルト位にメチルエステルを導入した場合（28b）、68倍の活性低下を示した。これら安息香酸エステルの中で、28cが、強力なPDE7 阻害活性及び細胞活性を示し、PDE4に対する96倍の選択性を示した。また、オキソピペラジン30は、

PDE7に対して良好な活性を示し、PDE4に対する275倍の選択性を示した。

b)

c)

Phe416 Gln413 Leu401

Phe384

Tyr211 Asp362

Gln413 Leu401

Phe416 Phe384 a)

H₂O Mg

Zn

(17)

13

続いて、ピリジン環を導入した化合物は、28eがナノモルオーダーの活性を示し、モルホリンを有する

29bはTable 2, 3に示した化合物の中で最も強い活性であった（IC50 = 1.0 nM）。加えて、28eは良好なリ

ガンド効率も示していた。この結果から、芳香環の導入は、脂肪族の導入よりも高いPDE7阻害活性を示すと言える。ピリジン環を有する化合物28eは、PDE4に対する選択性が190倍であった。著者は、PDE3、

PDE4及びPDE5に対する選択性が、望まない副作用を避けるために必要であると考えており、他のPDE 分子種に対する選択性も測定した。その結果、PDE3に対して800倍、PDE5に対して1650倍という高い選択性であった。化合物28eは、細胞活性についてもIC50 = 89 nMと強力であり、強力なPDE7阻害活性が寄与していると考えられた。

PDE3、PDE4、PDE5及びPDE7のIC50値を自社で測定していたが、Caliper Disocovery Alliance & Services 社に依頼し、Caliper LabChip 3000を用いて化合物30の各PDE分子種に対する選択性を明らかにした

（Figure 7）。ここでは、化合物28eの低水溶性（第二章に記述）を考慮し、化合物30を選択した。

Figure 7. 化合物30の選択性プロフィール。化合物濃度は120 nMで実施。

その結果、化合物30はその他のPDE分子種に対しても良好な選択性を示していることが分かった。リード化合物とした28eの選択性評価は実施していないが、類似の構造を有しており、同様の選択性プロフィールを有すると考えられる。

以上、著者は、新規かつ強力なPDE7阻害剤として、2-(cyclopentylamino)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one 誘導体を見出した。化合物ライブラリーのスクリーニングによって見出されたヒット化合物を基に、構造活性相関情報の取得とコンピューターモデリングを行った。得られた情報を用いて、新規かつ強力な PDE7阻害剤である7位置換体へ導いた。その結果、極めて強力なPDE7阻害活性とIL-2産生抑制作用を有し、他の分子種に対して高い選択性を示す化合物28eをリード化合物として得た。

-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

PDE1A PDE1B PDE2A PDE3A PDE3B PDE4A1A PDE4B1 PDE4D3 PDE5A1 PDE6C PDE7A PDE8A1 PDE9A2 PDE10A2 PDE11A

% inhibition

(18)

14

第二章水溶性を有し、強力な

PDE7

阻害剤である

2-(4-pyridylamino)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one

誘導体の創製と

SAR

研究

第一章で著者は、PDE7阻害活性、PDE分子種選択性及び細胞活性が良好なリード化合物である28eの取得を達成した。しかしながら、化合物28eとその誘導体は、合成展開中に得られたフラグメントサイズの化合物10よりも水溶性が低いことが分かった（Figure 8）。

a50 mMリン酸緩衝液を用いて測定（pH 6.8、室温）

Figure 8. 2-(Cyclopentylamino)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one誘導体のPDE7阻害活性および溶解度。

この結果は、7位置換基の導入によるものであると考えた。そこで、良好な活性を示し、かつ水溶性についても良好である7位置換基を探索することで、臨床候補化合物を見出す必要があった。さらに、2位置換基についても水溶性と活性に大きく寄与していると考えた。したがって、合成展開の容易さも考慮し、2位置換基の最適化後に7位置換基の変換を実施する方針とした。第一章の研究において、

2-(cyclopentylamino)thieno[3,2-d]-pyrimidin-4(3H)-oneの2位のシクロペンチル基がPDE7の疎水性結合ポケットに適合し、良好な活性を示したと考えた。そこで、Scheme 3に示す条件で、2位への芳香環導入を試みた。すなわち、化合物14aのメチルスルホン部分を各種アミンで置換し、化合物37-47を得た。

Scheme 3. 2位に芳香族アミノ基を導入する反応条件: (a) R¹-NH2, LiHMDS, DMSO, rt or 60 ^oC, 3-58%; (b) R¹-NH2, THF, 120 °C, 6%.

得られた化合物について、PDE7、PDE4阻害活性及び水への溶解度を評価した（Table 4）。

(19)

15

Table 4. 2位置換基の異なる化合物のPDE7、PDE4阻害活性および水への溶解度

化合物 R¹ IC50 (nM) 溶解度

c

PDE7A^a PDE4B^a (µg/mL)

10 150 4900 12

37 290 7400 20

38 88 4300 10

39 >1000 ND^b 66

40 >1000 ND^b 84

41 >1000 ND^b 1.9

42 2300 ND^b 0.4

43 61 2700 26

44 41 3000 6.3

45 >1000 ND^b 42

46 630 30000 110

47 60 5300 120

aIC50値は、2試験以上の平均値。^bND; 未測定。^c50 mMリン酸緩衝液を用いて測定（pH 6.8、室温）。

始めに、シクロペンチルアミノ基をフェニルアミノ基へ置換した。フェニル基を有する化合物37は、

活性がわずかに低下したが、化合物10に比べて溶解度が向上していた。この結果により、2位置換基について、詳細な構造活性相関研究を実施することが望ましいと考えた。次に、芳香環における置換基の効果について調べるため、化合物38-40を合成した。オルト位へメチル基を導入した化合物38は、PDE7 阻害活性を向上させたが、メタ位及びパラ位への導入（化合物39と40）は許容されず、大きな活性低下

(20)

16

となった。化合物38は、溶解度についても良好であったことから、オルト位への置換基導入が望ましいと考えられた。より大きな置換基であるエチル基（化合物41）および電子吸引基であるシアノ基（化合

物42）は低い活性であり、フルオロ基およびクロロ基（化合物43と44）は化合物37よりも高い活性を

示した。さらに、化合物43は、溶解度が向上した。これらの結果から、PDE7阻害活性については、オルト位への比較的小さな置換基のみが許容され、フルオロ基がPDE7阻害活性と溶解度の両方で最も良好な置換基であることが分かった。

続いて、フェニル基をより高極性のピリジル基へと変換した結果（化合物45と46）、大幅な溶解度の向上が見られたが、PDE7阻害活性の低下が生じた。化合物37に比較して約2倍の活性低下であった4- ピリジン体46に対して、フルオロ基の導入を試みた。その結果、溶解度を維持しながら、大きく活性が向上した。フェニル基と同様に、ピリジル基においても、オルト位へのフルオロ基導入は活性向上に適していたと言える。このように、2位置換基の変換により、3-フルオロ-4-ピリジルアミノ基がPDE7阻害活性及び溶解度を向上することが分かった。PDE4阻害活性に対する選択性については、オルト位置換体

38、43、44及び47でわずかに向上した。

第一章の研究において、7位芳香環の導入は、PDE7阻害活性の向上を導いた。しかしながら、水への溶解性を大幅に低下させることが分かっている。したがって、チエノピリミジノンの7位には、より好ましい置換基を探索する必要があった。そこで、PDE7阻害活性と溶解度を両立して向上する置換基を探索するため、化合物47の7位に様々な置換基を導入した（Scheme 4）。

(21)

17

Scheme 4. 7位に置換基を導入する反応条件: (a) NIS, AcOH, DCM, 40 °C, 57%; (b) 4-amino-3-fluoropyridine, LiHMDS, THF, rt, 93%; (c) CuCN, DMF, 100 °C, 57%; (d) ethylene glycol monovinyl ether, Pd(OAc)2, DPPP, TEA, iPrOH, 100 °C; 6 mol/L HCl aq., rt, 73%; (e) NaBH4, MeOH, rt; (f) MeMgBr, THF, rt, 18%; (g) 2-hydroxyethyl acrylate, PdCl2(PPh3)2, TEA, CH3CN, 80 °C, 26%; (h) H2 (4 atm), 10%

Pd/C, THF, rt, 77%; (i) LAH, THF, rt, 82%.

スルホン体14a をヨウ素化した後、メチルスルホニル基を4-アミノ-3-フルオロピリジンに置換することでヨウ化物48を得た。ヨウ素を置換することでシアノ体49を得た。また、ヨウ化物48に対し、エチレングリコールモノビニルエーテルによるHeck反応を行った後、ケト化することで、ケトン体50を得た。得られた化合物50に対し、還元もしくはGrignard反応を行い、化合物51および52をそれぞれ得た。

ヨウ化物48に対し、Heck反応及び還元を行うことで、アルコールとした後、LAHによる還元を行い、

アルコール体54を得た。

得られた化合物49、51-52、54に関し、PDE7、PDE4及びマウス活性化リンパ球におけるIL-2産生の阻害活性、溶解度を測定し、Table 5にまとめた。

(22)

18

Table 5. 7位置換基の異なる化合物のIn vitro活性と水に対する溶解度

aIC50値は、2試験以上の平均値。^bIC50値は、4試験以上の平均値。^cND; 未測定。^d50 mMリン酸緩衝液を用いて測定（pH 6.8、室温）。

シアノ基を有する化合物49は、7位無置換の化合物47と比較して高い活性と予想外の低溶解度を示した。そこで、水溶性を向上するために、親水性置換基として水酸基の導入を試みた。その結果、強力かつ溶解性のある化合物52および54を導いた。

続いて、望ましい水溶性を示すには、分子の平面性と対称性を崩すことが適していると考えた^30,31。そこで、飽和環であるピペリジンを有する化合物57、60-62を設計し、合成した（Scheme 5）。

化合物 R² IC50 (nM) 溶解度^d

PDE7A^a PDE4B^a IL-2^b (µg/mL)

49 25 670 ND^c 3.5

51 8.7 610 1700 5.4

52 2.1 56 260 18

54 3.9 180 480 31

57 1.1 310 ND^c 0.9

60 0.68 280 160 49

61 1.2 180 130 23

62 0.32 20 < 100 28

(23)

19

Scheme 5. 7位にピペリジル基を導入する反応条件: (a) 55, Pd(OAc)2, PPh3, sat. NaHCO3 aq., DMF, EtOH, 90 °C, 64%; (b) H2, 10% Pd(OH)2, THF, EtOH, rt; (c) TFA, toluene, rt, 62% (2 steps); (d) MeOCOCl, TEA, DMF, rt, 83%; (e) 58³², Pd(OAc)2, PPh3, sat. NaHCO3 aq., DMF, EtOH, 90 °C; (f) Et3SiH, TFA, DCM, 0 ^oC; 4 mol/L NaOH aq., rt, 26% (2 steps); (g) MeOCOCl, NMM, DCM, rt, 24%; (h) R-CO2H WSC, HOBt, NMM, DMF, rt, 49-85%.

ヨウ化物48と市販のボロン酸エステル体55をカップリングした後、水素添加及びBoc基の脱保護を順次行うことで、ピペリジン体56を得た。56をメトキシカルボニル化することでカーバメート体57を得た。ヨウ化物48とボロン酸エステル体58³²をカップリングした後、脱保護することでピペリジン体59 を得た。得られた化合物59に対し、クロロギ酸メチルもしくはカルボン酸を縮合することで、カーバメート体60およびアミド体61、62をそれぞれ得た。

化合物57と60-62のin vitro活性及び水への溶解度をTable 5にまとめた。ピペリジン誘導体である化合物57と60はPDE7阻害活性を著しく向上した。4-ピペリジン体57は低い溶解度を示す一方で、3-ピペリジン体60は高い溶解度を示した。したがって、他の3-ピペリジン体である化合物61と62を評価したところ、両化合物とも良好な阻害活性と望ましい溶解度を示した。化合物60と62は1 nMを切るPDE7 阻害活性を示し、良好なIL-2産生抑制作用を示した。光学活性体の検討のため、キラルHPLCを用いた光学分割により、化合物62の光学活性体を取得した。その結果、片方のエナンチオマーは、もう一方のエナンチオマーと比較して、良好なPDE7、PDE4、IL-2に対する活性を示した。また、ピペリジン誘導

体（60-62）のPDE4阻害活性は、ピペリジンの置換基によって変化しており、その置換基がPDE4に対

する選択性に重要な役割を担っていると考えられる。

他のPDE分子種選択性を明らかにするため、化合物60-62のPDE3及びPDE5に対する阻害活性を測定した（Table 6）。

(24)

20

Table 6. 化合物60-62のPDE4, PDE3およびPDE5に対する選択性プロフィール

aIC50値は、2試験以上の平均値。

測定した化合物のすべてが選択性を示し、中でも化合物62は、PDE4に対して60倍、PDE3に対して 50倍、PDE5に対して9000倍の良好な選択性を示した。

以上、著者は、水溶性が向上した臨床候補化合物の取得を目的として、チエノピリミジノンにおける2 位及び7位の置換基を探索した。2位の展開によって4-ピリジルアミノ基を見出した後、7位の展開によって良好な溶解度、高い活性及びPDE7選択性を示す3-ピペリジン体を取得した。中でも、化合物62は最も良好なPDE7阻害活性を示した。

化合物 R² IC50 (nM)

PDE7Aâ PDE4Bâ PDE3Aâ PDE5Aâ

60 0.68 280 29 520

61 1.2 180 37 > 10000

62 0.32 20 17 2900

(25)

21

第三章強力な

in vivo

薬効を示す選択的

PDE7

阻害剤である

2-(isopropylamino)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one

誘導体の創製

第二章において、2位に芳香族アミンを導入することで、2位に4-ピリジルアミノ基を有するチエノピリミジノン誘導体を見出した。次の最適化の方針として、別系統となる強力かつ選択的なPDE7阻害剤の取得を目指し、2位に脂肪族アミンの導入を試みることとした。その後にin vivo試験を実施し、4-ピリジルアミノ体と取得した脂肪族アミノ体を比較することで、最も強力なin vivo薬効を示す臨床候補化合物の取得を目指した。

2位に脂肪族ユニットを有する化合物63-73を設計し、合成した（Scheme 6）。スルホン体14aに対し、

種々のアミンやGrignard試薬を作用させ、化合物63-72を得た。化合物72のメチルエステルを加水分解することで、カルボン酸体73を得た。

Scheme 6. 2位に各種置換基を導入する反応条件: (a) R¹-H, THF, 100 °C-130 °C, 1-66%; (b) i-BuMgBr, THF, rt, 50%; (c) 4 mol/L NaOH aq, THF, MeOH, 60 °C, 19%.

化合物63-73および初期SAR取得の際に合成した化合物10と11のアッセイ結果をTable 7にまとめた。

(26)

22

Table 7. 2位置換基が異なる化合物のin vitro活性と水に対する溶解度

aIC50値は、2試験以上の平均値。^bND; 未測定。^c50 mMリン酸緩衝液を用いて測定（pH 6.8、室温）。

最初の試みとして、化合物47の3-フルオロピリジル-4-アミノ基を変換した。エチルアミノ基やn-プロ ピルアミノ基のような小さい置換基の導入は、PDE7阻害活性を20倍以上低下させる一方で、良好な水

化合物 R¹ IC50 (nM) 溶解度^c

47 60 5300 120

63 2900 ND^b 240

64 1400 ND^b 69

65 370 11000 190

66 4700 ND^b ND^b

67 1500 ND^b 3.7

68 2600 ND^b 430

69 300 4800 6.3

10 150 4900 12

11 740 5300 4.1

70 430 12000 37

71 2300 24000 74

72 2100 ND^b 13

73 1300 ND^b 450

(27)

23

溶性を示した。続いて、立体的な嵩高さによる影響を調べるために分枝アルキルアミン体（65と67）を 合成した。その結果、化合物63と比較して活性が向上した。特に、イソプロピルアミン体65は、溶解度を低下させることなく、約8倍の活性向上を示した。さらに、リガンド効率についても調べたところ、

化合物47よりも高い値（65：LE = 0.55、47：LE = 0.49）であることが分かった。続いて、NH基（化合物65）をCH2基（化合物66）に置き換えたが、PDE7阻害活性が低下した。これは、このNH基がPDE7 阻害活性を示すのに重要であると考えられた。したがって、2位のNH基を保持した側鎖の導入をさらに検討した。シクロプロピルアミンの導入（化合物68）が活性と溶解度を低下させる一方で、4から6員環のシクロアルキルアミン体69、10および11は、中程度の活性と低い溶解度を示した。極性の向上を目的としてシクロヘキサン環をテトラヒドロピラン環へ置換した結果、活性と溶解度が向上した。溶解度向上のため、シクロヘキサン環へ極性基を導入した化合物71-73は、活性が低下した。この2位の変換で合成したチエノピリミジノン誘導体は、PDE4阻害に対する選択性を有していた。2位置換基の検討の結果、イソプロピルアミノ基（化合物65）が、溶解度、リガンド効率、PDE7阻害活性及び選択性の面で、

最適化検討に適していると判断した。

第一章の結果から、7位への芳香環の導入が活性の向上に適していることが分かっている。したがって、

化合物65の7位に芳香環を有する誘導体を設計し、合成した。トリメチルフェニルアンモニウムトリブロミド化合物65の選択的ブロモ化により、臭化物74を得た。得られた化合物74と種々のボロン酸をカップリングすることにより、ヘテロアリールを有する化合物75-79を得た（Scheme 7）。

Scheme 7. 7位に芳香環を導入する反応条件: (a) PhNMe3·Br3, CaCO3, DCM, MeOH, rt, 79%; (b) R²-B(OH)2, Pd(OAc)2, PPh3, sat. NaHCO3 aq, DMF, EtOH, 80 °C, 50-99%; (c) R²-B(OH)2, Pd(PPh3)4, K3PO4, 1,4-dioxane, water, 130 ^oC (mw), 6%.

得られた化合物のアッセイ結果をTable 8にまとめた。

(28)

24

Table 8. 7位置換基が異なる化合物のin vitro活性と水に対する溶解度

aIC50値は、2試験以上の平均値。^b50 mMリン酸緩衝液を用いて測定（pH 6.8、室温）。

3-ピリジン環を導入した化合物75は、ナノモルオーダーの強力なPDE7阻害活性を示した。しかしな

がら、これ以上の最適化を実施するには、溶解度が不十分であった。他のヘテロ環への置換やピリジン環への置換基導入を試みたが、溶解度は向上しなかった。この結果は、分子の平面性や疎水性によるものであると考えられる³¹。

ここで、本系統の結合様式を確定するため、株式会社創晶に依頼し、得られた化合物75を用いて、PDE7 の共結晶構造（PDB ID 4Y2B, 分解能2.2 Å）を取得した（Figure 9）。

化合物 R² IC50 (nM) 溶解度^b

65 370 11000 190

75 4.4 520 5.8

76 12 550 0.1

77 6.4 200 4.5

78 4.6 420 2.4

79 7.6 1100 18

(29)

25

Figure 9. 化合物75とPDE7A触媒部位の共結晶構造（PDB ID 4Y2B, 2.2 Å resolution）。a) 結合領域における化合物75（緑色）の複合体。水素結合を点線で表し、重要な水分子を記載。b) Maestro 9.8で生成した2次元相互作用図。c) チエノピリミジノン7位周辺におけるPDE7結合ポケットの分子表面図。

本系統がPDE7に対する高い親和性を示すのに重要な相互作用を確認した。1つ目に、2-イソプロピルアミノチエノピリミジノンが、Gln413及び水分子に対して水素結合を形成していた。この水分子は、

Tyr211及びAsp362と水素結合することにより、安定化されていると考えられた。この水分子との水素結

合が存在するため、2位NH基が重要であったと言える。2つ目に、チオフェン環は、Phe416のベンゼン環とπ-π相互作用を有し、Phe384のベンゼン環とCH-π相互作用を示した。7位のピリジン環は、Leu401

とLeu420の側鎖に挟まれているが、飽和環の導入を許容できるスペースが存在していた（Figure 9c）。し

たがって、飽和環として7位ピペリジン体および7位ピロリジン体の合成を検討した（Scheme 8）。臭化物74とボロン酸エステル体80をカップリングした後、水素添加による還元、Boc基の除去により、ピペリジン体82を得た。化合物82のピペリジン環を修飾することにより、4-ピペリジン誘導体83-85を得た。

また、臭化物74とケトン体86および87から系内で生成したトシルヒドラジンをカップリング³³するこ a

)

b)

c)

Gln413 Leu401

Tyr211 Asp362

Phe416 Phe384

H₂O

Leu401 Leu420

c)

(30)

26

とにより、ジヒドロピロール体90とテトラヒドロピリジン体91をそれぞれ得た。水素添加とBoc基の除去の後、アミド化することで、3-ピロリジンおよび3-ピペリジン誘導体92-97を得た。

Scheme 8. 7位ピペリジン体および7位ピロリジン体の合成の反応条件: (a) 80, Pd(OAc)2, PPh3, sat. NaHCO3

aq., DMF, EtOH, 90 °C, 98%, (b) H2 (3 atm), Pd(OH)2, MeOH, rt, 25-84%, (c) 4 mol/L HCl in EtOAc, rt, 46-97%, (d) acetone, NaBH(OAc)3, DCM, rt, 14%; (e) 2-fluoropyridine, K2CO3, DMF, 100 °C, 11%; (f) Ac2O, Et3N, DCM or DMF, rt, 55-66%, (g) 86 or 87, Pd2(dba)3, X-Phos, TsNHNH2, LiOt-Bu, 1,4-dioxane, 110 °C, 25-39%; (h) R-COCl, Et3N, DCM, rt, 61-63%; (i) R-CO2H, WSC, HOBt, Et3N, DMF, rt, 47-56%.