2-(4-pyridylamino)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one 誘導体の創製と SAR 研究
リード化合物28eは、良好なPDE7阻害活性を示すが、水に対する溶解度が低いものであった。そこで、
水溶性が向上した臨床候補化合物の取得を目的として、チエノピリミジノンにおける2位置換基を探索 し、4-ピリジルアミノ体が良好なPDE7阻害活性と溶解度を示すことを見出した（Scheme 10）。続いて、
7位の置換基を探索することで、良好な溶解度、高い活性及びPDE7選択性を示す3-ピペリジン誘導体を 取得した。中でも、化合物62は最も良好なPDE7阻害活性を示した。
Scheme 10. 2-(4-Pyridylamino)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one誘導体の取得
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第三章 強力な in vivo 薬効を示す選択的 PDE7 阻害剤である
2-(isopropylamino)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one 誘導体の創製
In vivo薬効を示す臨床候補化合物の取得を目的として、2位置換基について脂肪族側鎖を検討し、高い
溶解性を示す2-(isopropylamino)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one誘導体を取得した（Scheme 11）。7位置換 基の検討により、良好なPDE7阻害活性と溶解度を有する3-ピロリジン体を導いた。得られた3-ピロリ ジン体97は、マウスTPA耳介浮腫モデルにおいて、強力な抑制作用を示した。本化合物は、炎症性疾患 における臨床候補化合物として、より詳細な研究を行うのに値するものであると言える。
Scheme 11. 強力なin vivo薬効を示す2-(isopropylamino)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one誘導体の取得
以上のように、著者は、複数のヒット化合物の中から、チエノピリミジノン構造を有するヒット化合 物に対し、コンピューターモデリングとリガンド効率を指標とすることで効率的にリード化合物28eを 取得した。続いて、得られたリード化合物の最適化を実施することで、良好な溶解度、PDE7選択性及び 活性を示す2-(4-pyridylamino)thie-no[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one誘導体を取得した。さらに、2位置換基に ついて脂肪族側鎖を検討することにより、高い溶解性を示す2-(isopropylamino)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H) -one誘導体の取得に成功した19。得られた3-ピロリジン体97は、マウスTPA耳介浮腫モデルにおいて、
強力な抑制作用を示した。本化合物は、選択的なPDE7阻害剤であり、PDE3、4、5の阻害による副作用 を示しにくいと考えられる。その作用機序から、免疫異常を伴う皮膚疾患に対する新規の抗炎症剤とな ると考えられる。さらに、表皮角化細胞における活性化抑制作用も示すと考えられ、今後、その証明が 望まれる。なお、今回用いたマウスTPA耳介浮腫モデルは抗炎症作用を確認するものであり、乾癬の病 態モデルではない。したがって、乾癬を適応疾患として開発するためには、乾癬患者皮膚移植モデルな どのより病態に近いモデルにおける高次評価が必要になると考えられる。今回得られた化合物の抗炎症 作用は極めて強いものであり、今後、アトピー性皮膚炎を含めた炎症性疾患における臨床候補化合物と して、より詳細な研究を行うのに値するものであると言える。
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実験の部
PDE7A1およびPDE4B1の活性評価
科研製薬株式会社創薬研究部の担当者に依頼し、実施した。昆虫細胞でヒトPDE7A1及びPDE4B1を 過剰発現させた。PDE7A1の酵素活性は、[3H]-cAMPに対する[3H]-AMPへの加水分解を測定して決定し た。反応液（最終量100 μL）は、アッセイ緩衝液（20 mM Tris, pH 7.5、10 mM MgCl2、0.1 mM EDT
A）中に10 nM [3H]-cAMP及び40 nM cAMPを含んだものを用意した。PDE4B1では、同様の緩衝液に
20 nM [3H]-cAMP及び480 nM cAMPを加えた。
PDEタンパクを含む溶液を加えることで酵素反応を開始し、反応液を室温で30分間インキュベートし た。反応液に25 mM ZnCl2を50 µL 加えて、反応を停止した後、10 mM Ba(OH)2を50 µL加えた。GF -B glass fiber filters (Millipore)を用いて沈殿物をろ過し、水道水で複数回洗浄した。フィルターを乾燥し、
TopCount NTX (PerkinElmer)を用いて計測した。
PDE3Aの活性評価
科研製薬株式会社創薬研究部の担当者に依頼し、実施した。ヒトPDE3Aは購入したものを用いた。P DE3Aの酵素活性は、[3H]-cAMPに対する[3H]-AMPへの加水分解を測定して決定した。反応液（最終量 100 μL）は、アッセイ緩衝液（50 mM Tris, pH 7.5、10 mM MgCl2、0.5 mM EDTA、100 µg/mL BSA）
中に100 nM [3H]-cAMP及び700 nM cAMPを含んだものを用意した。
PDEタンパクを含む溶液を加えることで酵素反応を開始し、反応液を室温で120分間インキュベート した。反応液に25 mM ZnSO4を50 µL 加えて、反応を停止した後、10 mM Ba(OH)2を50 µL加えた。
GF-B glass fiber filters (Millipore)を用いて沈殿物をろ過し、水道水で複数回洗浄した。フィルターを乾 燥し、TopCount NTX (PerkinElmer)を用いて計測した。
PDE5A1の活性評価
科研製薬株式会社創薬研究部の担当者に依頼し、実施した。ヒトPDE5A1は購入したものを用いた。P
DE5A1の酵素活性は、[3H]-cAMPに対する[3H]-AMPへの加水分解を測定して決定した。反応液（最終量
100 μL）は、アッセイ緩衝液（50 mM Tris, pH 7.5、10
mM MgCl2、0.5 mM EDTA、100 µg/mL BSA）中に38.5 nM [3H]-cGMP及び2 μM cGMPを含んだも のを用意した。
PDEタンパクを含む溶液を加えることで酵素反応を開始し、反応液を25 oCで120分間インキュベー トした。反応液にSPAビーズ懸濁液（28 mL超純水中に500 mgPDE YSi SPA Scintillation Beads）を加 えて、加水分解によって生じたGMPをビーズに吸着させた。TopCount NTX (PerkinElmer)を用いてSPA ビーズに吸着した[3H]-cGMPの放射活性を測定した。
IL-2の活性評価
科研製薬株式会社創薬研究部の担当者に依頼し、実施した。新しく単離したマウスリンパ球を10% F
BS、10 mM HEPES、1 mMピルビン酸ナトリウム、 0.5 mM モノチオグリセロール、100 U/mLペニ
シリン及び100 µg/mLストレプトマイシンを追加したRPMI1640培地で再懸濁した。細胞をanti-CD3及
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びanti-CD抗体で刺激し、5% CO2存在下37 °Cで3日間インキュベートした。上清を回収し、ELISAで
IL-2濃度を測定した。
X線共結晶構造解析
株式会社創晶に依頼して実施した。PDE7A1におけるアミノ酸130-482のコーディング領域をベクター pET32aでサブクローンした。プラスミドpET32-PDE7A1-(130-482)を過剰発現のため、Escherichia coli s train BL21 (codonplus) に形質転換した。大腸菌細胞を37 °C、LB培地でA600 = 0.6に生育した後、0.1 mM isopropyl β-d-thiogalactopyran-osideを加え、さらに15 °Cで24時間生育した。PDE7A1の触媒部位 をニッケル―ニトリロ三酢酸、Q-Sepharose及びSuperdex 200の3種のカラムクロマトグラフィーを用い て精製した。0.7-0.9 M (NH4)2SO4, 3 mM β-メルカプトエタノール、10 mM EDTA、10 mM MgCl2及び
0.1 M Tris·HClを含むpH 7.5の緩衝液中、2 µLのPDE7A1―化合物の複合体を4 °Cで懸濁することに
より、結晶化した。溶媒として20%グリセロールを加えた緩衝液を用いて、液体窒素で結晶を凍結し、
Micromax 007 generator及びR-AXIS VII image plate detector (Rigaku MSC)を用いて100 Kで計測した。
計測した回折データをPDE7A1触媒部位（PDB ID: 1ZKL22）の構造を用いた分子置換法により、初期位 相決定を行った。電子密度にあわせてモデルの確認及び修正を行い、さらにリガンドと溶媒分子の確認 を行った。あわせて最大尤度法による構造精密化を実施することで、構造解析結果を得た。なお、構造 解析にはCCP4（Coorp-erative Computational Project Number 4）の各ソフトウェアを利用した。
合成方法および分析方法
試薬及び溶媒は、特に記載がないものについては市販品を購入し、用いた。水分に影響を受けやすい 反応は、アルゴン雰囲気下、乾燥したガラス容器中で市販の脱水溶媒を用いて実施した。1H NMRスペ クトルは、JEOL JNM-ECA400 spectrometer (400 MHz)を用いて測定した。ケミカルシフトは、TMSを内 標準物質として用い、δ値（ppm）を記録した。質量分析は、Thermo Scientific Exactive Mass Spectrom-eterを用い、分解能25000でポジティブもしくはネガティブイオン化電気スプレーモードにより、実施し た。もしくは、質量分析装置（JMS-HX110A、日本電子㈱）を使用し、高速原子衝撃イオン化法による
positiveイオンの低分解能測定法（分解能1000）でFAB-MSスペクトルを測定した。
第一章 チエノピリミジノン構造を有するリード化合物の取得
2-(Allylamino)-6-[4-(4-isopropylpiperazin-1-yl)phenyl]-3-methylthieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one (5).
本化合物は、 BioFocus DPIから購入した（純度98%）。 1H NMR (CDCl3): δ 1.11 (6H, d, J = 6.9 H z), 2.71 (1H, m), 3.30 (8H, m), 3,52 (3H, s), 4.16 (2H, m), 4.64 (1H, m), 5.22-5.34 (2H, m), 5.99-6.09 (1H, m), 6.93 (2H, d, J = 8.7 Hz), 7.17 (1H, s), 7.58 (2H, d, J = 9.2 Hz). ESI-MS m/z: 424 [M+H]+.
3-[2-(Allylamino)-3-methyl-4-oxo-3,4-dihydrothieno[3,2-d]pyrimidin-6-yl]-N-(2-hydroxyethyl)benzamide (6).
本化合物は、 BioFocus DPIから購入した（純度 98%）。 ESI-MS m/z: 385 [M+H]+.
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4-[2-(Allylamino)-3-methyl-4-oxo-3,4-dihydrothieno[3,2-d]pyrimidin-6-yl]-N-(3-(dimethylamino)propyl)ben-zamide (7). 本化合物は、 BioFocus DPIから購入した（純度97%）。 ESI-MS m/z: 426 [M+H]+.
3-Ethyl-2-thioxo-2,3-dihydrothieno[3,2-d]pyrimidin-4(1H)-one (13a).
化合物12a （9.58 g, 60.9 mmol）をピリジン（122 mL）に溶解した後、イソチオシアン酸エチル
（10.7 mL, 122 mmol）を加え、14時間加熱還流した。室温に冷却後、溶媒を減圧濃縮した。残渣を クロロホルムで洗浄することで、化合物13a（収量10.8 g 、収率84%）を白色固体として得た。
1H NMR (CDCl3): δ 1.22 (3H, t, J = 6.9 Hz), 4.44 (2H, q, J = 6.9 Hz), 7.01 (1H, d, J = 5.5 Hz), 8.16 (1H, d, J = 5.5 Hz).
3-Ethyl-2-(methylthio)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one.
化合物13a（27.2 g, 0.128 mmol）をDMF（0.43 L）に溶解した後、ヨードメタン（16 mL, 0.26 mol）
及び水素化ナトリウム（60% in oil, 7.6 g, 0.19 mol）を順次加え、0 °Cで1時間撹拌した。反応液に飽 和塩化アンモニウム水溶液と水を順次加えた。析出物をろ取し、水で洗浄した。残渣を減圧下、乾燥す ることで、3-ethyl-2-(methylthio)-thieno-[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one（収量28.6 g、収率98%）を得た。
1H NMR (CDCl3): δ 1.38 (3H, t, J = 6.9 Hz), 2.63 (3H, s), 4.24 (2H, q, J = 7.3 Hz), 7.20 (1H, d, J = 5.0 Hz), 7.70 (1H, d, J = 5.5 Hz).
3-Ethyl-2-(methylsulfonyl)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one (14a).
3-Ethyl-2-(methylthio)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one（28.6 g, 0.126 mol）をDCM（0.63 L）に溶解し た後、70% mCPBA （79 g, 0.32 mol）を加え、室温で1時間撹拌した。反応液に飽和炭酸水素ナトリウ ム水溶液及び飽和チオ硫酸ナトリウム水溶液を加えた。クロロホルムで抽出し、有機層を硫酸ナトリウ ムで乾燥した。溶媒を減圧濃縮し、シリカゲルカラムカラムクロマトグラフィーで精製することで、化
合物14a（収量28.5 g、収率87%）を黄色固体として得た。
1H NMR (CDCl3): δ 1.48 (3H, t, J = 6.9 Hz), 3.54 (3H, s), 4.58 (2H, q, J = 6.9 Hz), 7.34 (1H, d, J = 5.5 Hz), 7.87 (1H, d, J = 5.0 Hz).
2-(Cyclopentylamino)-3-ethylthieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one (10).
化合物14a（11.0 g, 42.6 mmol）をTHF（114 mL）に溶解した後、シクロペンチルアミン（20 mL,
0.20 mol）を加え、18時間加熱還流した。室温に冷却後、溶媒を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーで精製し、化合物10（収量8.73 g、収率89%）を白色固体として得た。
1H NMR (CDCl3): δ 1.33 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.46-1.54 (2H, m), 1.66-1.79 (4H, m), 2.12-2.20 (2H, m), 4.09 (2H, q, J = 7.3 Hz), 4.37-4.45 (1H, m), 4.43 (1H, br s), 7.05 (1H, d, J = 5.5 Hz), 7.62 (1H, d,
J = 5.5 Hz).
ESI-MS m/z: 264 [M+H]+.
3-Ethyl-6-methyl-2-thioxo-2,3-dihydrothieno[3,2-d]pyrimidin-4(1H)-one (13b).
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化合物13aと同様の手法により、化合物12b（150 mg, 0.878 mmol）から化合物13b（収量150 mg、
収率76%）を白色固体として得た。
1H NMR (CDCl3): δ 1.36 (3H, t, J = 6.9 Hz), 2.57 (3H, s), 4.56 (2H, q, J = 6.9 Hz), 6.64 (1H, s).
3-Ethyl-6-methyl-2-(methylthio)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one.
化合物13b（150 mg, 0.663 mmol）をアセトニトリル（2 mL）に溶解した後、 ヨードメタン（50 μL,
0.795 mmol）及び炭酸カリウム（137 mg, 0.994 mmol）を順次加え、室温で2時間撹拌した。溶媒を減
圧濃縮し、残渣に水を加えた。クロロホルムで抽出し、硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧濃縮し、
残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することで、3-ethyl-6-methyl-2-(methylthio)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one（収量120 mg、収率75%）を黄色固体として得た。
1H NMR (CDCl3): δ 1.37 (3H, t, J = 7.3 Hz), 2.59 (3H, s), 2.61 (3H, s), 4.21 (2H, q, J = 7.3 Hz), 6.87 (1H, s).
3-Ethyl-6-methyl-2-(methylsulfonyl)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one (14b).
3-Ethyl-6-methyl-2-(methylthio)thieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one（120 mg, 0.499 mol）をDCM（1 mL）
に溶解した後、 75% mCPBA（267 mg, 1.25 mol）を加え、室温で2時間撹拌した。反応液に飽和炭酸 水素ナトリウム水溶液を加え、クロロホルムで抽出した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧濃縮 した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することで、化合物14b（収量90 mg、収率 66%）黄色固体として得た。
1H NMR (CDCl3): δ 1.46 (3H, t, J = 7.2 Hz), 2.64 (3H, s), 3.51 (3H, s), 4.55 (2H, q, J = 7.2 Hz), 7.
00 (1H, s).
2-(Cyclopentylamino)-3-ethyl-6-methylthieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one (15).
化合物14b（90 mg, 0.33 mmol）をTHF（1 mL）に溶解した後、シクロペンチルアミン（563 mg,
6.61 mmol）を加え、4時間加熱還流した。室温に冷却後、溶媒を減圧濃縮した。残渣をシリカゲルカ
ラムクロマトグラフィーで精製することで、化合物15（収量68 mg、収率74%）を白色固体として得た。
1H-NMR (CDCl3): δ 1.32 (3H, t, J = 7.1 Hz), 1.42-1.54 (2H, m), 1.61-1.79 (4H, m), 2.09-2.19 (2H, m), 2.53 (3H, s), 4.06 (2H, q, J = 7.1 Hz), 4.34-4.41 (2H, m), 6.74 (1H, s).
ESI-MS m/z: 278 [M+H]+.
7-Bromo-2-(cyclopentylamino)-3-ethylthieno[3,2-d]pyrimidin-4(3H)-one (16).
化合物10（8.73 g, 33.1 mmol）をDCM（55.2 mL）とメタノール（55.2 mL）の混合液に溶解した後、
フェニルトリメチルアンモニウムトリブロミド（21.5 g, 99.3 mmol）及び炭酸カルシウム（13.2 g, 132
mmol）を順次加え、室温で14時間撹拌した。反応液をろ過し、溶媒を減圧濃縮した。残渣を水及び酢酸
エチルで洗浄した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製することで、化合物16（収量
5.45 g、収率48%）を黄色固体として得た。
1H NMR (CDCl3): δ 1.33 (3H, t, J = 7.3 Hz), 1.47-1.56 (2H, m), 1.67-1.78 (4H, m), 2.19-2.28 (2H, m), 4.10 (2H, q, J = 7.3 Hz), 4.44-4.58 (2H, m), 7.61 (1H, s).