より良いNMRスペクトルを得るために : 2-D NMR測定の最適化

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(1)より良いNMRスペクトルを得るために. 2−DNMR測定の最適：化. 機器分析評価センター. 石原晋次近年、NMR装置の進歩により分解能やS∠N比が向上するとともに、新しい測定手法の確立により測定時間の大幅な短縮が図られ、NMRスペクトル測定が益々容易になってきました。そのため、タンパク質の構造解析に留まらず、単純な有機分子でさえも、二次元（2−D）や多核測定によって構造決定する機会も増えております。実際、当センターでも、400MHz装置の導入に伴って2−D NMR測定の需要が増加してきております。そこで、今回はNMR利用者を対象として、2−D NMR 測定の注意すべき点や最近の技術について、項目に分けて紹介致します。. ◆2−DNMR’のパラメータ設定と測定時間の関係. 二次元NMR実験は、適切な手法の選定とパラメータの設定によって成否が決まります。故に、測定時間を短縮し効率化するためにも適切な設定が必須となってきます。そこで、ここではデータの取り込みパラメータと時間の関係について解説します。. Hz／pt. 蝋. 里＿一. 4Q（s）. 一. ⊥，. 》謡畿謡よP野幌！高分解育旨のデータを取得い一鵬，だとすると膨大な時間1）が必要であまり現実的ではありません。. そこで、どの程度デジタノレ分解能が必要かによって、可能な限L駈，りデータポイント数を減らして測定しています。通常のAbsolute. ㌶二瀦・欝晶㌫課腿齢読零欝∴・. 臨磐鷺秘繰越趨叡’欝鵬並，次元のデジタル分解能を図1異なるデジタル分解能での」一2およ. 藁2 一致させます。一方、び6Hzの観シグナルの分離・左の蜘直は1 ポイント当りの周波数（Hz／pt）であり、右は. Phase Sensitive COSYでその条件での取り込み時間（AQ）である。201。。一10H／0. 1400M且zの装置を使用し、観測範囲10ppm、積算4回でCOSYを測定したとすると、1・D 標準の32K pt（0．12且z／pt）では測定に20日かかる。対して512 pt（7．81｛z／pt）では約1時間と. なる。分離のあまり良くないAbsolute COSY実験では128∼1：K ptあれば十分である。. 6.

(2) は、より高分解能での実験が求められますので、更に2倍以上のデジタル分解能が必要となります。. 》積算回数TIMES 2−D測定では、積算1回でガ側のポイント数だけ積算を繰り返すこととなり、非常に長い時間がかかります。そのため、ある程度濃い濃度のサンプルを用意して時間の短縮を図ります。ただし、積算の最小数は、位相回しの数によって決まっており、測定法によっても異なります。当然ながら、感度が不十分な低濃度サ. ンプルでは、更に積算回数をn倍する必要があります。一方、後述のパルス磁場勾配法では、位相回しをある程度無視できる測定手法2）のため、大幅な時間短縮が可能となります。. 〉遅延時間PD NMR現象の緩和は非常に長いので、定常状態に戻るまでFID3）の取り込み後の待ち時間（PD）を十分に空ける必要があります。故に、 PDは観測核の縦緩和. 時間乃に応じて決定します。当然ながらサンプルや測定方法によっても最適な時間は異なりますが、長めに取ることで十分な感度を獲得でき、失敗は少なくなります。90。パルスを用いる通常のパルス系列では、最適感度を得るために繰り. 返しを71より長い間隔4）で行います。これはFIDの取り込み時間（AQまたは AcQTM：acquisition time）も含めていますので、実際はAQ＋PDとなります。 2−D測定では時間を最適化して、PDをおよそ1秒∼2秒程度に設定しています。. ◆測定時間を短縮する様々な測定手法》プロトン観測異種核二次元シフト相関. NMRはしばしばマシンタイムが運用のネックとなりますが、感度向上と時間短縮のために様々な手法が開発されています。たとえば、IH−13C相関に代表され. る異種核相関を調べる方法では、近年、HMQCやHMBCなどのプロトン観測で測定することが主流となっています。これは、低感度の核で観測するよりも大幅に感度が増大するためであり、実際に13C観測のIH−13C相関実験で一晩かかっていた測定が、一時間程度でも観測できるようになります。更に、観測不可能な希薄なサンプルでも1H観測ならば可能となる場合もあります。従来は、不要な 12Cと結合したプロトン信号（親共鳴）を消去するのに難しさがありましたが、 2通常は位相回しも合わせて使用する。 3 ：丘噛ee induction decayo. 4繰り返しの時間効率を考えると、1．3乃が最適なS／N条件となる。. 7.

(3) 次に述べるパルス磁場勾配法によって極めて有効な手法となりました。. 》磁場勾配パルス法最近、一般化してきた手法として磁場勾配パルス法（PFG：Pulse Field Gradient）. を利用した二次元測定があります。磁場勾配パルスを利用する目的は、“コヒーレンス移動経路を選択する”ことでサンプルの信号のみを取り出すことであり、. よりノイズの少ないスペクトルが得られます。従来の測定は、位相回し（Phase cycling）によりコヒーレンス選択をしているので、サイクルに応じて決められた. 積算回数で測定しなければなりません。したがって、最低でも30分∼1時間程度かかるのが普通でした。また、位相回しでは差スペクトル処理による’1ノイズの発生や、先に述べた親共鳴の不要信号が消え残る場合が多々あります。磁場勾配パルス法では、これらの問題を効率よく解決し、ノイズが大幅に減少します。. AL400では3セットの磁場勾配パルスしかかけることができませんが、COSY、 DQF−cosY、 HMQc、 HMBcの各種方法に適用できます。ただし、分子拡散係数の早い化合物では、信号の減衰が大きくS／N比の悪いデータになることがあるため注意が必要です。. ◆きれいな2−Dスペクトルを得るためのデータ処理 2−Dのデータ処理は、実施者によっては大幅に概観が変わってしまうこともあり、. 適当に自動処理で行ってよいものではありません。逆に上手に測定できなかったデータも、ある程度は処理によって見栄えが良くなることもあります。》ウインドウ関数. 最も重要な処理としてウィンドウ関数があり、これは言わば人工的. にFIDシグナルの減衰を変える事に相当します。たとえば、FIDが緩. やかに減衰するように末端部と中間部を大きくするようなウィンドウ関数をかければ、減衰時間を長く. するのと同等の効果があるため、結果的に分解能が向上します。ただし、. 図2 ウィンドウ関数の効果上図：ウィンドウ関数をかけないFIDとスペクト. 取り込み時間AQは変わりません. ル。下図：IH：zで指数関数のウィンドウ関数をかけたスペクトル。下図ではノイズ部分の多い末端を減. ので、末尾がゼロにならないことに. 算させることでS加比が向上している. 8.

(4) よるノイズ5）が生じることもあり注意が必要です。一方で、急速に減衰させる. ようなウィンドウ関数をかければ、ノイズ比の多い末端部分が減少するために S∠N比が向上します（図2）。これらのウィンドウ関数は、実際のスペクトルを確認しながらパラメータを調節し、最適な条件を探していきます。定性的には、 FIDのノイズ部分を減らし、かつ信号を大きくすることがポイントです。. 取り込み時間AQの短い2−Dや多核の場合は、末端がゼロとなるような関数を使用します。特にAbsolute COSYでは、 FIDの経過とともに交差ピークに由来する信号が大きくなるため、初期と末端を強く打ち消すようなsine−bell関数等を使用します。. 》ゼロフィリングゼロフィリングは、言葉の通りFIDの末端にゼロとなる信号を挿入する方法で、付属の解析ソフトでは1回につき時間領域のデータ点を2倍にします。このようにゼロを挿入することによって、データポイントが増加しデジタル分解能が向上します。ただし、先に述べたように完全に減衰していない状態にゼロフィリングを行うとノイズが生じますので、適切なウィンドウ関数を使ってゼロにするか、または線形予測6）という特殊な方法で処理します。高分解能1−Dスペクト. ルでは、AQが数秒と長いのでウィンドウ関数の併用を意識する必要はありませんが、AQの短い2−Dでは極めて重要となります。》ノイズ処理. その他に、装置の不安定性によってシグナルの縦方向伍軸）に帯状に’1ノイズが生じることがありますが、それらを消去するために対称化などの方法があります。このようなノイズ処理は、取り. トllilllllllllll∴｝llllll∵ 一一. E一一一一一一. G一. @，；『l i. @ す’ F ｛ 4 T’. 扱いに注意しながら利用すれば有力な手段となります。. E1 」＿. 参考資料. ・エルンスト2次元NMR原理と測定法（吉岡書店）・有機化学のための高分解能NMRテクニック（講談社）・化学者のための最新NMR概説（化学同人）・これならわかるNMR（化学同人）. 図3 ’1ノイズ. 5末端が切り捨てられた（truncateされた）状態であり、シグナルの付近に波状の信号（ripPle， wiggle）が現れる. 6当センターの解析用端末のACD／SpecManagerに付属。. 9.

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