マウス性腺の形態形成に関与する転写因子Dax1,Emx2,WTI,GATA4及びSox9と蛋白 : 蛋白相互作用をする因子の発現様式とそれらのデｰタベｰス解析
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(2) 目次 1 序論・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・…. 1∼3. H 実験材料と実験方法・・・・・・・・・・・・・・・・・・…. 4∼6. 1．実験：材料・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・…. 。・・4. （1）大腸菌・・の・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・…. 4. （2）Two−hyb記もystemで分離した各クローン・・・・・・・・…. 4. （3）プラスミド・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・…. 4. （4）マウスの125日胚・・・・・・・・・・・・・・・・・・…. 4. 2．実験方法・・・・・・・・…. ●●・．．．’●”●’●●●5. （1）ホールマウントin situハイブリダイゼーション（WISH）による. 発現様式の解析・・・・・…. ◎・・・・・・・・・・…. 5. （2）セレラ社のデータベースを用いた解析・・・・・・・・… 皿 結果・・・・・…. φ・・・・・・・・・・・・・・・・…. 5∼6. 7∼9. 1．各転写因子の発現様式と蛋白質一蛋白質相互作用をする. クローンのマウス125日胚での発現様式・・・・・・・・…. 7∼8. （1）Dax 1の発現様式とDax 1と蛋白質一蛋白質相互作用をする. クローンの12，5日胚での発現様式・・・・・・・・・・・…. 7. （2）Elnx2の発現様式とEmx2と蛋白質一蛋白質相互作用をする クローンの12．5日干での発現様式・・・・・・・・・・・…. 7. （3）WT 1の発現様式とWT 1と蛋白質一蛋白質相互作用をする. クローンの125日胚での発現様式・・・・・・・・・・・…. 8. （4）GArA4の発現様式とGArA4と蛋白質一蛋白質相互作用をする クローンの12．5日胚での発現様式・・・・・・・・・・・…. 8. （5）Sox9の発現様式とS◎x9と蛋白質一蛋白質相互作用をする クローンの12．5日胚での発現様式・・・・・・・・・・・…. 2．セレラ社のデータベースを用いた解析・・・・・・・・・…. 8. 8∼9.
(3) IV 考察・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・…. 10∼13. 1．各転写因子と蛋白質一蛋白質相互作用を行う因子の 発現様式とデータベス解析につい・・・・・・・・・・・…. 10. 各転写因了と蛋白質一蛋白質相互作用を行う因了の. 性分化における関与の可能性について・・・・・・・…. 10∼13. V謝辞・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・… 14 VI参考文献・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・…. 表1∼表6. 図1∼図31. 15∼17.
(4) 1 序論 哺乳類は雄と雌という2つの性が存在しており、この雄と雌が生殖を行うこ とによって子孫ができる。哺乳類の性腺の発生過程ではXY型染色体を持つ個 体が雄、XX染色体を持つ個体が雌となる。また、形態的な性分化の過程は、 未分化の性腺がSRY（Sex dete㎜ining region on Y chromosome）の作用によ り精巣に、作用のない場合卵巣に分化する（Gubbay就訊，1990；Sirlclair就訊，. 1990）。分化した精巣では、生殖細胞を取り囲むようにしてセルトリ細胞とラ イデリッヒ細胞が出現する。これら2つの細胞からミュラー管阻害因子（MIS），. AMH（セルトリ細胞から分泌されるTGF一β族に属するホルモン）とテストス テロン〈ライデリッヒ細胞から分泌される男性ホルモン）が分泌され、それぞ れミュラー管を退縮させ、ウォルフ管を発達させる（広川，1999；武藤，1998）. 一方、分化した卵巣ではミュラー管阻害因子とテストステロンが分泌されない ので、ミュラー管は発達しウォルフ管は退縮する。. しかし、SRYだけの支配では性が決定しないことが、性腺の性分化に異常を おこす疾患の原因遺伝子の同定などを通して明らかになり、性分化を担う転写 因子のいくつかが発見された。その中にはDax1（DSS−AHC℃riticaユregion on the X chromosome 1）、 Emx2（ernbryonic cerebral cortexで発現している ernpty spiracles）、 WT1（Wilm’s tumor l gene）、 GATA4（GATA trans cription. factor 4）、 Sox9（SRY−related HMG box9）などの転写因子が含まれていた（図 1）。. Dax1はX染色体にリンクしており、先天性副腎低形成（AHC）の患者からク ローニングされた遺伝子で”orphan”核内ホルモンレセプターであるが、他 の”orphan”核内ホルモンレセプターを持つ遺伝子と違い、 Znフィンガーを持. たない。またDax1のリガンド結合ドメインの変異はAHCの病態、副腎皮質 低形成と低ゴナドロピン性性機能不全を引き起こすと考えられている。Daxl の発現を性腺の発生に沿ってみていくと、初期には精巣、卵巣ともに発現は同 じくらいで共に低く、発生が進むと卵巣よりも精巣に多く出現する。これは主 にライデリッヒ細胞での発現を反映している（広川，1999）。. Emax2はホメオボックス（形態形成を制御する遺伝子）をもっている。ホ メオボックスはキイロショウジョウバエの頭部間隙遺伝empty 1.
(5) spiracles（ems）のマウス相同物であり、背側終脳の発生においても重要な遺伝. 子である（吉田，1997）。また、αヘリックスが3つ組み合わさってDNAに結 合するという立体構造の蛋白質をつくる塩基配列が存在する。またEmx2は泌 尿生殖器システムが発生するとき上皮構成成分に発現することや、Emx2ノッ クアウトマウスは出生顕すぐ死亡し、胎生期に性腺原基が十分に発達しないた め両性とも副腎、性腺が欠損することや、後腎において後腎問充組織中に働き、. 輸尿管芽の機能にとって重要な因子であるウォルフ管と中腎管の退行がミュラ ー管の形成なしに異常に加速されたという多くの報告が存在する（宮本，1997）。. しかしEmx2の性腺の分化に関わるアプローチは全くといっていいほどなされ ていないためEmx2についての報告はほとんどない。 WT1は幼児期に起こる腎芽細胞腫（ウィルムス腫瘍）の原因遺伝子として単離、 同定され、その変異がXY型逆転と関連していることがみつかっている（Plletier. 就a1．，1991）。またWT1が深く関連する疾患にDDS（Denys−Drash− syndrome）症候群やWAGR（Wilrn’s tumor a：nirida， ger疵ourinary abnormalities and mental retardation）症候群があることがわかった。これら. の疾患はいずれも泌尿器生殖器に関連する部位での腫瘍の形成や、組織形成異. 常を起こしていた。なかでも生殖器異常は様々起こり、染色体46本、XXは正 常なのに対して染色体46本、XYは外性器の性別がつきにくいか男性半陰陽と. なり、ミュラー管の残骸を伴っていた。このDDS患者の60％以上がWT1の エキソン9（3番目のZnフィンガードメイン）で突然変異を起こしていた （Reddy eオ認，1996；Call e亡a乙，1990）。また、 WT 1の組織発現、は精巣ではセ. ルトリ細胞に限局していることや、性分化後の精巣でWT1はセルトリ細胞で 検出されるがライデリッヒ細胞では検出されないこと、WTI欠損マウスでは性 腺と腎臓が無形成になり、生殖隆起はアポトーシスを起こして退縮すること、. またWT1の発現は初期の性腺、中腎、後腎などの分化途上の泌尿生殖器にみ られることがわかっている（Pelletier就訊，1991）。. GATA4はGATA転写因子群の1つで、 DNA結合モチーフであるZnフィ ンガーを2つ持つ（White e亡訊，1995）。腹側の形態形成に必要な転写因子であ り（Jeffery eオ訊，1997）、性腺の形成開始において雌雄ともにみられ、その後、 雌雄差がでてくると精巣のセルトリ細胞に強く発現する（Viger e亡a1。，1998）。. Sox9はSRYのHMG boxと呼ばれるDNA結合領域と高い類似性を示す 2.
(6) H：MG boxを持つSox転写因子群の1つで、 HMG bQxの他にも転写活性領域 を持つ（Koopman，1999）。 Sox9は先天性骨形成不全症候群（CD雲campomehc dysplasia）からクローニングされた遺伝子で、 CD患者は骨や軟骨の変形や形 成不全を引き起こすと共に男性から女性への性転換がみられる（Foster eオ鉱， 1994；Wa㎎11er e幽明，1994）。また、性腺の分化に先立ち発現量に性差が現れ、 雄のセルトリ細胞で強く発現する（Kent e酸1．，1996）。. これらのDax1，Emx2，WTl，GATA4，Sox9の転写因子がどのようなメカニズ ムのもとでその機能が働くのか、どのように性腺の分化に関わるのか分子レベ. ルでのメカニズムは解明されていない点が多い。そこで1999年越ら2000年 にかけて繁戸、有吉らはマウス（Mus mロscωs）を用い上記Dax1， Emx2， WT1，. GATA4， Sox9の各転写因子と性腺分化時期においてこれらの転写因子と蛋白 一蛋白相互作用をする因子を探すため、蛋白質複合体検出システムである出芽 酵母を用いたTwo−hybrid system（Ph患p e‘a乙，1996）を用い、蛋白質一蛋白. 質相互作用をするクローンを数多く検出した。検出されたクローンが既知の蛋 白質であるかどうか調べるためBlast serchによるデータベース検索を行った。. その結果データベースに存在しておらず、まだ解析されていないもの機能が不 明の16個のクローンが得られた（表1）。. 本研究ではこれら16個の未解析のクローンについてマウス初期胚を用いた 発現様式の同定と、マウスのゲノムデータベースによる詳しい解析を行うこと. を目的とする。発現様式の同定にはホールマウント加sf加ハイブリダイゼー ション法（Whole mount加s伽hybridyzation；WISH）（野地，1997）を行い、. マウスの12．5日胚の性腺での各クローンの発現様式を解析する。ホールマウ. ント加sf加ハイブリダイゼーション法（WISH）は、遺伝子の発現をmRNAレ ベルで見るため、その遺伝子のmRNAにハイブリダイズする標識（ジゴキシゲ ニン）のついたプローブを作製し、mRNAとハイブリダイズさせアルカリフォ スターゼ（AP）を結合した一次抗体を用いて検出し、 NBT＆X一リン酸を基質とし. て発色させるものである。また、データベース解析にはセレラ社の発表してい. るマウスのcDNA及びゲノムのデータベースの情報をもとに解析を行い、性分 化に関与するクローンについて考察を行う。. 3.
(7) H 実験材料と実験方法 1．実験材料 （1）大腸菌. 実験に用いた大腸菌株はDH5α、 TOP 10である。遺伝子型Genotypeについ ては表2に示す。 （2）Two−hybrid systemで単離した各クローン Dax 1， Emx2， WT 1， GArA4， Sox9， WT 1と相互作用するクローンは1999年∼. 2000年において繁戸、有吉らによるTwo Hy願d Systemによってとれたものを 用いたく繁i戸2000，有吉2000）（表1）。. （3）プラスミド. 実験に使用したプラスミドはpGAD424、pBluescript∬（sK＋）及びpcR皿一 TOPOである。（図2）. （4）マウスの125日胚 実験に用いたマウスの125日胚性腺は、基礎生物学研究所（細胞分化研究部 門）において、受精して125日経過した♀マウス内の胎児から採取した（図3）。. 4.
(8) 君. 2．実験方法 （1＞ホールマウント加sf轡型イブリダイゼーション（WISH：）による発現様 式の解析 1999年置2000年において繁戸，有吉らによるTwo Hybdd Systemによってとら. れたクローンのうち、まだ機能等が解明されていないもので生体内で有効な相. 互作用をするのではないかと考えられるクローン16個（表1）について、遺. 伝子の発現をmRNAレベルで見るため、ホールマウント加3伽ハイブリダイ ゼーション法（野地，1997）により解析を行った。. また、本研究における組換えDNA実験における基本操作は、 Current Protocol in Molecular Biology（Ausubel eオa1．，1987），Molecular Cloning（Sambrook e‘a1．，1989）の方法を使用した。また、 DNAシーケン. シングにはBig Dye Terminator法によるPCR法とABI 373 DNAシーケン サーを用いた。. ・DIG標識プローブの作製 pGAD424にクローニングされているクローンをEcolR I，Sma I，BamH I， Sal I，飴d，卿豆の各種制限酵素で切り、制限酵素地図を作成した（図4）。. この制限酵素地図をもとにプローブ作製部位を決定し、T7／T3プロモーターを 持つpBluescdpt∬（SK＋）または、 T7／SP6プロモーターを持つpCR皿一TOPOヘ. リクローニングを行った。このリクローニングを行ったものについてアンチセ ンスプローブ（AS），センスプローブ（S）の確認が必要となるため、 DNAシー. ケンシングを行いAS、 Sの確認を行った。 DNAシーケンシングで確認できな かったものについては、ベクター側に存在する制限酵素とクローン中に存在す. る制限酵素で切断し、電気泳動でDNA断片の長さを調べることにより確認を. 行った。確認ができたクローンはPCRでDNA断片を増幅し、そのDNA断片 をtelnplateとしてジゴキシゲニンでラベリングを行った（PCRの反応サイクル は表3に示す）。. ・ホールマウント加s加ハイブリダイゼーション（WISH） ジゴケシゲニンでラベリングされたDIG標識プローブをマウスの12．5日胚 ヘハイブリダイズさせ、アルカリフォスファターゼ（AP）を結合した一次抗体を. 用いて検：出し、NBT＆X一リン酸を用いて発色を行った（図5）。発色時間につ. いては、まず1時間30分以内に一度発色状態を顕微鏡下で観察し、ASとS 5.
(9) での違いが著しいものやバックまで染色されたものは十分発色しているものと みなし、発色液を洗浄して発色を止めた。十分発色できていないものについて. はそれから30分ごとに顕微鏡下で観察を行い、十分発色できしだい発色をと めた。発色できたものについては、エタノールで脱色を行った。なお、各転写 因子Dax1， Emx2， WTI， GATA4， Sox9のWISHの結果は基礎生物研究所細 胞分化部門より提供していただいたものである。. （2）セレラ社のデーターベースを用いた解析. 表1に示した16個のクローンのDNAシーケンスデータを、セレラ社が発 表しているデーターベース（www．celera．com）を用いて検索した。まずDNA シーケンスデータをマウスのmRNA（cDNA）のデータベースを用いて相同性の 最も高いものを抽出した。抽出した配列をアミノ酸配列に変換し、モチーフ検 索を行った。また、ゲノムデータベースとの検索も行い、得られたゲノム情報. からエクソン、イントロンを決定した（図6）。これは図7のエクソン、イン トロンの切断点のコンセンサス配列をもとに決定した（Frefelder DM，1989）。. 6.
(10) 皿 結果 1．各転写因子の発現様式とそれらの転写因子と蛋白質一蛋白質相互作用をす るクローンのマウス12．5日胚での発現様式. 今回WISHで用いたマウスの初期胚は12．5日胚である。マウス125日胚は 性分化が起こり始めた初期段階で、雌雄差が形態においても区別が可能なステ ージである。. （1）Dax璽の発現様式とDax Iと蛋白質一蛋白質相互作用をするクローンのマ. ウス125日胚での発現様式 Dax 1およびDax 1と蛋白質一蛋白質相互作用をするクローンの性腺における. WISHの結果を図8，9に示す。 Dax1は11．5日胚から雌雄の性腺に発現がみら れた。発現の雌雄差は12．5日胚からみられ、雌の方に強く発現しており14．5 日胚では雌では発現が弱く、逆に雄では発現が最も強くなっていた。Dax1＃4、. Dax1＃21については、雌雄差は見られないが、どちらも性腺に強く発現して いた。. （2）Emx2の発現様式とEmx2と蛋自県一軍早帰相互作用をするクローンの マウス12．5日胚での発現様式. E㎜2およびEmx2と蛋白質一蛋白質相互作用をするクローンの性腺におけ るWISH：の結果を図8，10に示す。 Emx2は1L5日胚から雌雄の性腺に発現が みられた。また、発現の雌雄差は12．5日胚で雄より雌の方が若干発現が強く みられた。また、12．5日胚や14．5日目をみると性腺だけでなく副腎にも発現 が見られた。Emx2 N＃2，16、 Emx2 N＃3、 Emx2 C＃17については雌雄どち. らも性腺で発現しており、雌雄差については雄のほうが雌よりも強く発現して. おり、Emx2 N＃2，16では精細管に強い発現がみられた。 Emx2 FQx（N＃39，18，37，42，43）については雌雄どちらも副腎に強い発現がみられたが、. 雄では性腺での発現もみられた。. Emx2 C＃4及びEmx2 C＃57については雌雄どちらも発現がみられなかった。 Emx2 C＃8，23，48，64については雌雄どちらも性腺に強い発現がみられた。. Emx2 C＃45については雄については性腺、副腎のどちらにも強い発現がみら れ、精細管にも強い発現がみられ、雌は副腎に強い発現がみられた。 7.
(11) （3）WTIの発現様式とWT1と蛋白質一蛋白質相互作用をするクローンのマ ウス12．5日胚での発現様式. WT1およびWT1と蛋白質一蛋白質相互作用をするクローンの性腺における WIS：Hの結果を図8，11に示す。 WT1は1L5日胚から性腺、副腎ともに発現 がみられた。また、発現の雌雄差はみられないが、12．5日胚や14．5日胚も11．5 日胚と同様に性腺、副腎ともに強い発現がみられた。WTl BC5（1−21）、 WTl BGll（3−25）のどちらも性腺に強い発現がみられた。また、 WTl BC5（1−21）に. ついては、雌よりも雄の方が若干発現が強く、副腎にも発現がみられた。. （4）GATA4の発現様式GATA4と蛋白質一蛋白質相互作用をするクローン のマウス12．5日野での発現様式. GATA4およびGATA4と蛋白質一蛋白質相互作用をするクローンの性腺に おけるWISHの結果を図8，12に示す。 GATA4は11．5日胚から性腺に発現が みられた。また、発現の雌雄差は12．5日胚と14．5日胚で雄の精細管で特に強 い発現がみられた。GATA4 C−T＃7についてはネガティブコントロールと比べ. てみても、雌雄どちらも発現がみられないように思われる。GATA4 C−T＃U は雌雄ともに性腺で強い発現がみられた。GATA4 C−T＃48は雌雄どちらも性 腺、副腎に発現がみられた。. （5）Sox9の発現様式とSox9と蛋白質一蛋白質相互作用をするクローンの マウス12．5日胚での発現様式. Sox9およびSox9と蛋白質一蛋白質相互作用をするクローンの性腺におけ るWISHの結果を図8，13に示す。 Sox9は11．5日胚、12．5日間、14．5日胚 ともに雄の精細管に強い発現がみられ、雌はほとんど発現がみられなかった。 Sox9／GATA4 AG3俳46）／AF3（C−SC＃95）は雌雄ともに発現がみられ、特に雄. の精細管に強い発現みられた。また、このクローンはGATA4でもとれてきた ものである。. 2．セレラ社でのデータベースを用いた解析. セレラ社のデータベースでの検索では1つのクローンに関して相同性の非常 に高いものが、各クローンにつき1つずつ検索された。また、表1に示した16 個のクローンのシーケンス結果と、セレラ社のデータからダウンロードしてき たmRNAの配列がどれくらいの割合で相同性があるか調べたところ（表4）、 8.
(12) すべて9割以上の相同性がみられた。これは検索したmRNAがクローンその ものであることを示している。次に検索してきたrnRNAの配列をアミノ酸配 列に直し、モチーフ検索を行った。これらドメイン位置についての解析結果の. 図を図14に示した。また、各ドメインについて特徴の一覧を表5に示した。. エクソン、イントロンの切断点については、ダウンロードしてきたmRNA配 列をマウスゲノムデータベースとの検索にかけ、エクソン、イントロン切断点 のゲノムコンセンサス配列をもとに決定した（図7）。ゲノムの塩基配列中のエ. クソン、イントロンの位置についての解析結果を図15に示す。また、各クロ. ーンのmRNAの塩基配列や、その配列上のエクソンの位置、 mRNAの塩基配 列に基づいたアミノ酸配列や、そのアミノ酸配列上のドメインの配列を示した. ものを図16∼31に示す。. 9.
(13) IV 考察 1．各転写因子と蛋白質一蛋白質相互作用を行う因子の発現様式とデータベー ス解析について. 本研究では性腺分化に関与する遺伝子を検出することを目的に実験、解析を 行った。実際には、マウス12，5日胚を用いWIS：Hを行うことで発現様式の同. 定を行った。また、セレラ社の発表しているマウスのcDNA及びゲノムのデー タベースを用い、cDNAおよびゲノムの詳しい解析を行った。これらの実験、. 解析を通して16個のクローンのうち、性腺分化に関与すると考えられるクロ ーンについての絞り込みを行った。16個のクローンのうち各転写因子が性腺で 発現しているにもかかわらず、発現がなかったEmx2 C＃4， Emx2 C＃57， GATA4 C−T＃7については性腺での蛋白質一蛋白質相互作用がないと考えられ、 性腺分化の関与が低いと考えられる。. 2．各転写因子と蛋白質一帯自閉相互作用を行う因子の性分化における関与の 口∫能性について. Dax1＃4について、セレラ社のマウスのrnRNA（cDNA）のデータベースを用 いて相同性の最も高いものを抽出した結果、sequence配列（1185bp）よりも短 いデータ（171bp）がダウンロードされた（図14）。また、 sequence配列の前. 半1869bpまでに相同性の高いデータが存在しなかった。これらのことから、 セレラ社の情報が間違いである可能性も考えられるので、このクローンに関し ては他のデータベースでさらに解析をする必要がある。. Dax1＃21について、セレラ社のマウスのmRNA（cDNA）のデータベースを 用いて相同性の最も高いものを抽出した結果、セレラ社のデータの配列中に 73bpの塩基配列の挿入があった（図14）。. Emx2の12．5日胚での発現様式は雌の方に若干強い発現がみられるが、 Emx2 N＃2，16， Emx2 FQx〈N＃39，18，37，42，43）， Emx2 C＃17， Emx2 C＃45. は雄の方に強い発現がみられた（図8，10）。特にEmx2 N＃2，16については精細. 管にも強い発現がみられた。逆にErnx2 C＃45は精細管での発現は弱いと思わ. れる。このように発現場所は異なるがE㎜2で発現がみられる性腺で、上記の クローンに発現がみられることは性腺分化の関与を示唆している。Emx2は性 分化に関わるアプローチがほとんどされておらず、謎の多い転写因子であるの. 10.
(14) で、この結果は大変興味深いものではないかと考える。 Emx2 N弊2，16はドメイン検索の結果、発生途中の男の胎児の性細胞、胎盤i、. 正常ではない細胞の腫瘍中に見つかるMAGE prOteinやProline−rich region と呼ばれるプロリンに富み、転写活性化領域となるドメインが検出された（表5）。. また、ゲノムのデータベースの検索の結果から、このクローンはマウスとヒト. のX染色体に存在することがわかった（表6，図15）。よってこのクローンは 転写活性化因子としての可能性や、雄の性細胞の分化に関与する可能性が考え られる。. Emx2 F（）x（N＃39，18，37，42，43）はドメイン検索の結果、 RNA認識モチー フとして知られるRRMが検出された（表5）。Fox1は線虫（c． elegaηs）（XX：雌. 雄同体、XO：雄）のX染色体の割合が決定づけられる一因となる主要な部位と して同定された（Jonathan et a1．，1994）。よってこのクローンも性腺分化に関 与する可能性が考えられる。. Emx2 C＃8，23，48，64はドメイン検索の結果、転写因子でみつかるB−bOxと. いわれるドメインや、B−box zinc fingerと呼ばれる40残基を含んだ ButyrQpfyhr1−1ikドメインや、まだ機能が解明されていないSPRYドメイン、 2つの亜鉛原子と結合することで蛋白質一蛋白質相互作用を行ったり、ユビキ チン化反応のE3に相当するZn−finger， RINGが検出された（表5）。また、 Zn−finger， RINGドメインはユビキチン化反応に類似するSUMO一化反応のE2. となるUBC9とは相互作用はないものの、 Emx2の後半部と相互作用があるこ とから（2000，有吉）、このクローンは大変興味深いものである。また、このク. ローンは未知の部分も多いが、蛋白質一蛋白質相互作用に関与する可能性も考 えられる。. Emx2 C＃17はドメイン検索の結果、 Proline−rich regionと呼ばれるプロ リンに富み、転写活性領域となるドメインや、B−box zinc fi㎎erと呼ばれる. 40残基を含んだButyropfyhn−likeドメインが検出された。 B−boxのcopies はtripartiteモチーフを形成しており、これは転写因子やリボ核酸蛋白質でみ. つかっているが、機能についてはまだ未解明である。また、SPRYといわれる 機能が解明されていないドメインも含まれていた（表5）。よってこのクロー ンはまだ未知の部分が多いが、転写活性の関与や、興味深い機能があるのでは ないかと考えられる。. 11.
(15) Emx2 C＃45はドメイン検索の結果、ヒットするドメインはなかったもののゲ ノムのデータベース検索の結果からマウスとヒトのX染色体に存在するクロー. ンであることがわかった（表6，図15）。しかし、マウスのmRNA（cDNA） のデータベースを用いて相同性の最も高いものを抽出した結果、sequence配 列（413bp）よりも短いデータ（272bp）がダウンロードされた（図14）。この短. さは遺伝子として機能する長さであるとは考えにくいため、これはセレラ社の 情報が間違いである可能性も考えられる。このクローンに関しては他のデータ ベースでさらに解析をする必要がある。. WT1の12．5日胚での発現様式は雌雄ともに性腺、副腎に強い発現が見られ、 WTI BC5（1−21）の発現様式と大変類似しているが、このクローンの発現様式は 雄の方が若干発現が強くみえた。. WTI BC5（1−21）はドメイン検索の結果、蛋白質の二量化に関連したり、赤血. 球結合モチーフとDNA結合モチーフであるIeucine−zipper−1ike−motifを持. ったDENN（AEX−3）ドメインや、機能が明らかでないPleckstrin−hkeドメ イン，Plexinドメインや、プロリンに富む配列に結合して蛋白質一蛋白質相互. 作用に関与するWWドメインや、免疫グロブリンを持つ領域からなるCell surface receptor I鷲／TIGや、細胞膜内外に分泌されるSernaドメインなど. が検出された（表5）。よって、このクローンはDNAと結合したり、蛋白質一 蛋白質相互作用に関与するのではないかと考えられる。また、他にも機能が明 らかでないドメインを含んでいるので大変興味深いクローンである。. WTl BG11（3−25）はドメイン検索の結果、カルシウム依存のリン脂質の結合. に関与するC2ドメインや、 C末端で含まれた蛋白質の中にはユビキチン蛋自 質リガーゼを含むH：ECTドメイン（ubiquitin−protein ligase）、特殊なプロリ. ンモチーフに結合し、蛋白質一蛋白質相互作用に関与するWW／Rsp5／WWPド メイン、プロリンに富む配列に結合して蛋白質一蛋白質相互作用に関与する. WWドメインが検出された（表5）。よって、このクローンは蛋白質一蛋白質 相互作用に関与したり、E1， E2， E3の働きによって標的蛋白質にユビキチンを. 付加し、ユビキチン化された蛋白質が分解の経路へ修飾する働きをもつユビキ チン化反応や、ユビキチン化反応に類似し、核移行する蛋白質に印をつける働 きのあるSUMO−1化反応に関与するのではないかと考えられる。 Sox9は雄に強い発現が見られ、特に精細管に強い発現がみられる。 Sox9 12.
(16) ／GATA4 AG3（＃46）／AF3（C−SC＃95）は、 Sox9とGATA4の両転写因子でと れたクローンで、Sox9， GATA4と同様に雄の精細管に強い発現がみられる。 また、SQx9／GATA4 AG3（＃46）／AF3（C−SC鞍95）のドメイン検索の結果、蛋白. 質一蛋白質相互作用ドメインとして知られるAnkyrin repeatドメインがヒッ トした（表5）。よってこのクローンは蛋白質一蛋白質相互作用に関与してい るのではないかと考えられる。性腺分化に関与’することがわかっている2つの. 転写因子と相互作用があったこのクローンは、性腺分化に大変重要な役割のあ るクローンである可能性が考えられる。 Dax1＃4， Dax1＃21， Emx2 N＃3， GATA4 C−T揮7， GATA4 C−T＃11，. GATA4 GT＃48はWISH：で性腺に大変強い発現がみられたので、これらのク ローンも性腺分化に関与する可能性が考えられる。しかし、GATA4 C−T算48. は、マウスのmRNA（cDNA）のデータベースを用いて相同性の最も高いものを 抽出した結果、sequence配列とmRNAの配列の相同する部分が大変短く、19bp しがなかった。この短さは遺伝子として機能する長さとは考えにくいため、こ. れはセレラ社の情報が間違いである可能性も考えられる。このクローンに関し ては他のデータベースでさらに解析をする必要がある。 以上、性腺分化に関与すると考えられるクローンがE㎜2C＃4， Emx2 C＃57，. GATA4 C−T＃7を除く13個に絞れれたが、さらにこれらが本当に性腺の分化 過程で重要な働きをしているのか調べる必要がある。そのために、セレラ社の データベース以外で解析をすることや、これらの遺伝子を欠失させたノックア ウトマウスを作成し、生殖腺の形態を解析することにより、さらに解明される のではないかと考えられる。. 13.
(17) V 謝辞 本研究は兵庫教育大学自然系生物研究室で行った。終始有益な御指導と激励 を賜った吉岡秀文助教授、笠原恵助手、本研究全般にわたり適切な御指導と助 言を賜った基礎生物学研究所 諸橋憲一郎教授、福井由宇子博：士に心から御礼 申し上げます。. また、金澤洋平氏、田中譲二氏をはじめとする吉岡研究室のみなさま、ホー. ルマウント加3伽ハイブリダイゼーションをはじめ本研究に様々な御協力を していただいた基礎生物学研究所細胞分化研究部門研究室のみなさまに深く御 礼申し上げます。. 14.
(18) W 参考文献 赤坂甲骨2002．遺伝子科学入門，裳門門. 有吉悦了 2000．マウス性腺の形態形成に関与する転写因了WT−1及びEmx− 2と蛋白一蛋白相互作用をする因子の同定とその性質（修士論文） Foster JM， Domainguez−StegHch MA，GuioH S， Klowk G， Weller PA， stevanovic M， Weissenbach J， Mansour S， young ID， Goodfellow. PN，1994． Campomelic dysplasia and autosomal sex reversal caused by mutations in an SRY−related gene Nature 372：525−530．. Frefelder DM，1989．分子生物学 上巻．化学同人. 福岡麻衣子2000．SH3ドメインWWドメインによるポリプロリン認識機序． 実験：医学Vo18：37−41階層社. フナコシ 2002．分子生物学・遺伝子工学研究用試薬 Gubbay J， Colhgnon J， KOopman P， Capel B， Economou A， Musterbaerg A，Vivioa N， Goodfellow P，欺）v部1−Badge R，1990． A gene mappi㎎to the sex dete㎜ining regiorl of the mouse Y chromosome is a member of. nOvel family of embryonica丑y expressed genes． Nature 346：245−250．. 広川佳史1999．性分化を特徴づける転写因子たち．実験医学Vo1．17 No。3（増 干q）：139−145羊土社．. Jeffery DM， Qing L， Stephen AD， Eric NO，1997． Requirement of the transcription factor GATA4 for heart tube forrnation and ventral Jonathan H， Jonathan D， Zllan and Akbertson DG，1994． Identification of a. candidate prirnary sex determination locus， fox−10n the X. chromosome of Caenorhabditis elegans． Development 120：1381−3689．. morphogenesis． Genes＆Development 11：1061−1072， Kent J， Wheatley SC， Andrews JE， Sinclair AH， Koopman P，1996． A male−. specific role for Soxg irl vertebrate sex determination． Development. 122：2813−2815．. Koopman P，1999．Sry and Sox9：mammalian testis−determini㎎genes． Cell Mo1． Life Sci．55：839−856，. 15.
(19) Miyamoto N， Yoshida M，：Kuratani S， Matsuo I， and Aizawa S，1997. Defects of Urogenitial development in mice lacking Emx2．. Development l 24：1653−1664．. 諸橋憲一郎 1999，生殖腺の分化と転写因子．Homlone erolltter ill gynecology．6：211：217．. 諸橋憲一郎 2000．生殖腺の分化を支える転写因子群と細胞増殖因子。蛋白 質・核酸・酵素vo1．45 No．9：1624−1632．. 武藤照子 1998．哺乳類における性決定遺伝子と生殖巣の分化．蛋白質・核 酸・酵素vo1．43 No，4：478483，. 野地澄晴 1997．ホールマウント加ε伽ハイブリダイゼーション法の実際 （免疫染色・加s伽ハイブリダイゼーション）羊土野． PhiHp J， John H， Erizabeth AC，1996． Geomic libraries and a host strain. designed for highly efficient twO−hybrid selection in yeast． Genetics. 144：1425−1436。 PeUetier J， Martins S，Alan J。 B， Anne R， Daniel A． H，and David. H，1991．Expression of the Wilrns’tumor gene WTI the Inurine. Urogenit訊system．Genetics 144：1425−1436． Reddy JC， and Licht JD，1996． The WTI Wi㎞s’turbor suppressor gene：H：ow much do wwe rea丑y know？Biochim．Biophys． Acta．1287：1− 28．. 繁戸克彦 2000．マウス性腺の形態形成に関与する転写因子Sox9， GATA4及 びAd4BPと蛋白一蛋白相互作用をする因子の同定と発現様式（修士論文） Stephen J， O’Brien，Editor，1990 GENIiπIC MAPS， Locus Maps of Complex. Genomes， FIFTH EDITION．. 田村隆明 1995．転写制御のメカニズム．羊土社 遠山正繭，塩坂貞夫，木山博資 1994．蛋白質・核酸分子の加sf加計定法．羊 土社. Invitrogen，2001．TOPO TA Cloni㎎versionL. 16.
(20) Wagner T， Wrth J， Meyer J， Zabel B， Held M， Zimmer J， Pasantes J，. Bricarelli FD， Kleutel J， Hustert E，1994． Autosomal sex reversal and. carnpomelic dysplasia are caused by mutations in and around the SRY− related gelle SQx9． ceH 79：1111−1120。. 17.
(21) 表1本研究で解析に用いた16個のクローン名一覧表 スクリーニングに使用した転写. @. クローン名. 遺伝子名. 国子. Dax1. 齪. 糾. ㎜㎞own. 拶21. 面mown. N拶2，16. Dlexぬ P⑩㎞erich. M3 R）x（N衆39，18β742，43）. FQX−1−RNA b童縫（蛭ng modf iC．8∼ヒ∼2α紹. α4 G摩8，23，48，64. C撒7 C胴5 C霧57 wr 1. B（〕5（1−21）. BG11（3−25）. GAEA4. C−T御 C−T孝11. Sox野GArA4. homQ垂ogy）. un㎞own KIAA 1098（Huluan hQmo1◎gy）. Ze伽？. u血own ㎜㎞own ㎜㎞own V酬d㎝ahl con舳9 P朕）㎞2. unknown Chroma虚n assemb藁y f加t（襲r. C−Tガ48. 斌脆know獄. A（お（柵AF3（C−SC籾5）. un㎞own.
(22) Strain. DH5α. 表2 本研究で使用した大腸菌 Genotype F’Φ80d1αoZ△MI5△（1々oZZ4一α考g1『）UI69 Dω1ぴεα望1εη耐1 ﾁ認∼17（rk’mk＋）2助α43梶ρ桝4λ卿吻一1 gy乃496ハεゐ41. TOPO 10. Fη2αン4、△でη2ア芦加4Rル∬一〃κア露C♪φ8ααごZ、ムルf15、△Zα（沢74擢cAL. SεoRαアαD139ムでαzα一Z8κノ76978απ18αZκ7ア3μ5‘∫アIR♪8掘AZ耀ρG.
(23) 表3 各種PCRのサイクル （著）Dye丁erminator用 PCRサイクル（シーケンシング用）. （2）しaTaq用 PCRサイクル（リク日一ニング用）. 94℃. 1分. 護馨コ×30サイクル. （3）εco〃direct PCRサイクル（インサーート確認用）. 95℃. 5分.
(24) 表4 各種クローンのDNA配列とデータベースから得られたcDNA配列との相同性 スクリーニングに. クローン名. 遺伝子名. 比較した塩基数（bp）. 拶4. 1185. ＃21. un㎞own un㎞own. N＃2，16. Dlexin. N＃3. Pro豆i登e rich. mRNAとの相同性（％）. g用した転写因子 Dax 1. Emx2. Fox（N誰39，18，37，42，43）. Fox護一RNA bind胴囲g motif. 3400 667. 99．8 97．9 96．5. 麟 1067. 98．1. 138. 99．3. 418. 96．7. 97．7. @（C．ε1ε8αアz5 homology）. C糾 α823，48，64. un㎞own KIAA 1098 iHuman homol霊gy）. WTl. C沮7. Zedn？. 491. 97．0. C＃45. un㎞ow盒. 272. 96．6. C＃57. un㎞own un㎞own. 211. 97．2. 597. 92．2. 1523. 100．0. 351. 98．3. 146. 88．5. un㎞own. 19. 100．0. un㎞◎wn. ㈱. 95．9. BC5（1−21）. BG11（3−25）. GAIrA4. C．T＃フ. C−T澱1. C−T桝8. Sox9／GArA4. AG3（編）1 AFI3（C−SC紛5）. WW domain co登taining Protein 2. un㎞own Chromatin assemb蔓y factor.
(25) 表5 モチーフ検索で検出されたタンパク質のドメインー覧表 ドメイン名 C2 dGm毎n. Z面n騨Bbox. 構造及び機能. クローン名. カルシウム依存のリン脂質の結合に関与する。. wr1BG11（3−2翁. B−b似z面面n解はだいたい40アミノ酸である。転写因子hbα縦ud㏄鰹， p戯OQnCQ鱒で. ㎞2C棚48β年. ｩつかっているが、ドメインとしての機能は特にない。 RNA−bindi勲g re夢on RNP−1（RNA. 一本鎖RNAを結合すると推測される蛋白質が約90アミノ酸のRNA−bind瞼g dG霊㎞を含む。 RNA. @. F識モチーフとしても知られている（RRM）。. 麺e◎09磁on mo⑳. Bind㎞音瞬㎞depende蹴【篭mspo貫. B細al b瞳㎞g一蜘n（紬t瞭sy麟㎞er㎜b㎜eは、能動輸送システムにエネル. @ sys朕護月爵inner m㎝b㎜e. Mーを送るArP結含蛋白質である。. HECT domain（ubiqui血一P駁）tein. ‘H舳dogp戟舘油e E6，AP cぬ）xy1賢㎜盆us’から由来した名前である。 c末端でこのドメインを. @. ﾜんでいる蛋白質の申にユビキチン蛋白質リガーゼを含んでいる。. 韮gase） Pb㎞e項ch 1鷺gion. プロリンに富み、ケラチンで集中的にみつかる。皮膚表皮からのケラチン生成細胞は紫外線. iUV）の光を含む外部の有害な影響に対して保護するための機能をもつ。ゲノムDNA上にお. Bmx2R瀕（踊69，18；i環2，43）. ㎞2Nお wrlBG11β一2⇒. Emx2N徽16 dmx2 N漿3， Emx2C彦7. ｱったダメージの存在はシグナルトランスダクションのカスケードを活性化し、その結果多く. ﾌ遺伝子の発現幽ddl p蘭nを含鋤を誘導する。また、蜘一盛dh p㈱h1含む領域は転写 ?P北領域である。. DENN（AEX−3）dGma㎞. ヒトのセリンとロイシンの豊富なDENN蛋白質は、蛋白質の二劉ヒに関連した赤血球の付着モ. wrlBC25（1−21）. `ーフと魏。櫨泌ppe繭ke mo極fを所有しており、腫瘍壊死因子田画aファクターの領域を結合 ｷるレセプターと部分的に相同性を示す。. WW恥P51WWPdom｛血. 特別なプロリンモチーフを備えたに配列に結合することで蛋白質一蛋白質相互作用に関与す. wr1 BGll（i鋲2勾. 驕B. 次ページに続く.
(26) Bipaiti電￡1】【UCle窺r 1（）ca匪iza虹on signa｝. @. これは頻繁にヒットし、細胞に局在するドメインである。. 斜LS B2 NLABP分. D田d421，（斑U鐸11， fA［A4 CT潤8， SωαGA￡A4. `（お（絢∼A欝（cSC蜀. Z駐嚇ng￠ちR｛NG. 腿N（｝噂は2つの亜鉛原子と結合し、蛋白質一蛋白質相互作用を解決させることに関係す. Bmx2C雛｝調6年. 驕Bまた、RIN（蹟nger（㎞磁はユビキチン化反応の鎚に相当する。. H㏄㎞n−1歯e iPHDσMA恥. 細胞内のシグナリング細胞骨格の要素として含まれる広範囲の蛋白質に生じる10肱aくらい. WTIBC25（1・21）. ﾌ領域である。機能は明らかではない。. Gamnlarcafboxylase−Hke. グルタミン酸残基をgamma伽xy蜘醐eに変換する。. E蛾x2（朔7. C訊ci㎜．bh塾di薮g EF，㎞d. カルシウム結合蛋白。多くのカルシウム結合蛋白は同じ進化のファミリーおよびERh㎝dとし. GALへ4CT将. @ （6fh麟E田AN助. ﾄ知られている種類のカルシウムに結合する力のあるドメインを所有する。ER㎞dとはカル Vウムイオンが五角形の両錘の配置のなかで調整されている構造である。. A面曲. A噸n噸は約33のアミノ酸配列で繰り返されたモジュールである。それらは主に真核生. SQ酬GA毯4A（iB｛絢／A協. ｨの種々の機能的な蛋白質の多く生じる。多くのAnk拠n！騨y㎞は蛋白質一蛋白質相互. iC欄. ?pドメインとしての機能を持つことが知られている。. Hexh董. H磯nにおいてシステインリッチリピートの3（華esが見つかったが、このリピートの機能は未. WTI BC25（1・21）. mである。. MAGE p棚ein. MAGEファミリーは発生途中の男の胎児の陶細胞、胎盤および正常な細胞ではない様々な腫瘍. Emx2 N鉱16. ¥でみつかる。この細胞の機能についてはわかっていない。. WW doma溢. 多くの異種蛋白質の短い領域でみつかっており、2つのトリプトファン残基とプロリンを保持. WTlBG11（3イ29. ｵている。プロリンに富む配列に結含することで蛋白質一蛋白質縮互作用に関与する。. Cε嚢su血㏄rece碑or皿rHG. 免疫グロブリン〈抗体としての分子構造をもつ蛋白質）をもつ領域からなり、細胞表面のレセ. @. vターで見られる. α③. wrlBC25（1−21）. 次ページに続く.
(27) Plex加／semaphQd孤91hIteg蜘. 塵x廊，s㎝聴戚風塩斡g幡で見つかった領域である。 P｝e㎞蔭榊経上皮の分化に関与し、. wr1 BC25（1−2董）. r㎞懲はニューロンの成長、円錐の崩壊や麻痺に関与し、ln陀血sは上皮細胞の粘膜：の機 ¥に関与する。. SPIaZRyan（x㎞e撒P旗SPRY B卿phン血一1歯. S盟Yドメインの機能は未知である。. B㎜2Cが17；Emx2C魏3綱（辮. RIN（通㎎erを含んでいるいくつかの蛋白質は、さらにシステインリッチのドメインにB−b賦血. Bmx2 C産17. 奄脂aとよばれる40残基を含んでいる。B加xの（痢銘は⑳謡稔モチーフを形成し、！i㎎肋騨. amx2（黙23諏（4. ﾉ加えて超らせんドメインに関係してくる。血卿漉モチーフは転写要因、リボ核酸蛋白質お 謔ﾑ主要なカルシウム蛋白質でみつかるが、機能についてはこのドメインによるものと示され. ﾄいない。これらB加Kモチーフを含む蛋白質は、それ以外にまだ機能が未知のドメインを他 ﾉもつ。このドメインの1つにBu騨y㎞一hkeドメインがある。 Semapho鋤／（■）100 an丘ge盤. Sema（㎞ぬは膜内外に分泌される蛋白質（いくつかは軸索誘導のための避剤. @. Vグナルとして機能する大きなファミリー）である。. （Sema）. ARG RICH. ARGの多く含むドメインである。. WTIBC25（1痢2D. 肱x1 崇21， S（跳91GA払4 `（拾（擬）∼A露（C癬9動. TRP】剛CH. TRPの多く含むドメインである。. Bmx2蹴16. ALA R蔓CH. ALAの多く含むドメインである。. ㎞2R）憩（Nβ9，183742d3）. LYS R璽CH. 正YSの多く含むドメインである。. GArACぜが蝕. GLU RICH. GLUの多く含むドメインである。. GAfA（ン下伸βA互ACT許. GLN RICH. GLNの多く含むドメインである。. GAiAαT1ηβOKA（お（絢. GLY R【CH2. GエYの多く含むドメインである。. Sα菰｛ンGA毯4. 坙ﾚ3（桝6）／AB（CSC〃9翰.
(28) スクリーニングに使. 表6 マウス及びヒトの染色体番号、ゲノム内の位置 クローン名 遺伝子名 染色体番号. @用した転写因子. Dax1. ＃4. ＃21. B搬x2. N誰2，16. N43. u盤㎞ow勲. un㎞own Dlexin Prol蓋ne rich. ゲノム内の位置. マウス. ヒト. マウス. ヒト. 拶10. 孝12. 126674398帽. 5651068臥. P26676084. T6518111. 654379∼. 15603606∼. V35832. P5661124. 73462776・. 48883466瞬. V84694541. S8885562. 99769424−. 500979牛2∼. 411. X 415. 孝22. X 澱2. X9774451 Fox（N孝39，18，37ヂ42，43）. C桝 α8，23，48，64. C狙7 C桝5 C孝57. Fox↓RNA binding m◎tif. unknown KIAA 1098. Zetin？. unlmown un㎞own. ＃15. ＃5. ＃14. 糾. X 45. 孝22. ＃7. 弼 籾. X 孝7. 7557041（》》. 19904988み. V5795133. Q000夏＆30. 』17736866∼. 1C6310445剛. P77732娼. Pα3346327. 6104855か. 2728H98∼. U！0（β167. Q73（y7105. 581502◎8−. 8％86208》. T8167441. W94078％. 79667416｝. 5541777G）. V9680458. T5478499. 17736866∼. 1α3310445k. P7773248. Pα3346327. 次ページに続く.
(29) WT 1. BC5（1−21）. BG11（3−25）. GATA4. C−T孝7. C．T411. C−T糾8. Sox91GATA4. AG3（桝6）1 `F3（C−SC孝？5）. U捻㎞own V邸domain coRtaini魏9 Protei丑2. 囎㎞ow且 Chromatin assembly fac毛or. un㎞own un㎞own. ＃15. 据 拶7. ＃17. 孝19. 45. ＃22. ＃16. 411 ＃19. 孝1. 拶4. 88284649闇. 36223866酎. W84442豆6. R6245491. 108667016∼. 58381◎87∼. P08788560. T852206フ. 138254889∼. 420652∼. P38260403. S25323. 56459173∼. 422（舛65∼. T6486280. S267161. 16356557∼. 12208（君14》. ﾊ畠％269. P22168365. 85412925−. 72079798｝. W5526809. V2264042.
(30) セルトリ細胞. 精子形成. 精管の形成. A4BP SF−1 WTl Soxg GATA4. 犠 瘡誌. ミュ. @．. ラー管. 精巣上体. 制. ■ 雪. 殖細胞. @ ξ二選ヂ茎。. @ ルトリ細胞M ?l一. 、. 繭. 套. ミユフ隔繭イディッヒ細胞. よノ. ’. ?．. 捗 9. Ad4BP／SF−1 ウォルフ管. 胃. テストステロン分ξ’. ウォルフ管の発達. 未. 分生殖腺 Ad4BP／SF−1 Sox9. 化. 泌 尿. の. SRY ♂. ．. 生→生 ・ 殖Ad4BP／殖. 隆 SF−1原 起 WT1 基 中. ♀. Ad4BP／SF−1. axl. 卵管・子宮の形成 卵胞形成. nt4. Daxl. ウォルフ管. l＞塗研1ざ. Wnt4. 1ミュラー管・ 発 ’. 、. 3●. 二∵. つ. ・i｝〉，. 趨. 体細胞’圏」一一一一一剛レ。．. ㌦，’. の 雄ではセルトリ細胞などに相当）：‘●・. 婁○’. ミュラー管. 餐’. 滴イ1該. ひ. そ： 軸｝. 生殖細胞. ぴ・. g ．．．巳. ウォルフ管退縮 謬誤ヒ. 《．。・．. ．’・帖. （減数分裂する）. ウォルフ管 ＝将来、精巣上体、精管など男性器になる ミュラー管 ：将来、卵管、子宮など女性器になる. Sox9 ：SRY−related HMG box 9 GATA4 ：GATA transcription factor 4 Ad48P／SF−1. ：Adrenal 4 binding Protein／Steroidogenic factor 1. MIS. ：M面Ilerian inhibiting substance. SRY. ：Sex−determining region on Y chromosome. Wnt4 Daxl. ミュラー管阻害因子. lWingless十ht−1 4 ：DSS−AHC−criticalピegion on the X chromosome 1. WTl. ：Wilms‘tumor l gene. Emx2. ：embryonic㈱bral corbgxで発現しているemμy spiracles 図1 哺乳類の性分化過程の概略と性分化に関与する転写因子.
(31) ’MCS ＆oRi｛830｝ 5加σI1830） ㎞Hl｛図。｝. 勘川1）肋d翻1（41。｝釧‘図6｝. 5澱Bi・・・… P＿ゆ繍覇｝鶴 2μ07rf. GAし4 ad. 」α恥d m⊂109◎，. AαfIl15420，. 即ゐ1｛憶24。）. TADH1. pGAD424. ●．鰻. 3・・1｛5・3・1螺. 1／ZF2dill｛1310｝. 6．6kb. 酬’ 戟E｝一 唐`mp「. leu21 @ 五boRV（2220，. B811（4660｝・．菱. ColEl oガ C轟望 1｛2820，. Pワμll｛3470｝. MCSの配列 GAA TTC CCG GGG ATC CGT CGA CCT GCA G EcoRI S〃昭工 Bα配HI ∫4ZI P3fI PA。H1＝ADH1プロモーター（構成的に発現）. TADH1竃ADH1転写終結配列 Ga14bd＝Ga！4DNA結合ドメイン（アミノ酸1∼147） Ga14ad＝Ga14転写活性化ドメイン（アミノ酸768∼881） MCS自クローニング部位. （2000，’ﾉ戸修士論文より引用）. β5εHπ. 。混1↓ ∼aθ1. 翻 焉謂. 0 ゆ. s・ρIsερ1. s5ρ1. 「. x艇 ・【. ∼aθ1 o. 5σal蕊癬. ∂. 灘’. ￡ll義1. pBluescript H. 珪. 馬. 謬. Sa’1／；イ功C∬／Acc I. XわoI. 鴉1. 獅・’. 罎豫. 、5. ． 『’隆’・ ■. ‘ 冠. 亀. 舞謝 αaI. SK＋／一 2961bp. 蓼. 瓢1. 弊写1↑. Ks鰹l pBl…cdpt∬（SK＋）の制限酵素地図 （2002，フナコシ分子生物学・遺伝子学カタログより引用）. 次ページに続く.
(32) ’acZαA「G. 205 CAG GAA ACA GCT A塾三A. T TTA GGT GAC ACT ATA A AAT CCA CTG TGA TAT. ATG ATT ACG CCA AGC TAC TAA TGC GGT TCG. ．GTC CTT TGT CGA TAC T ∼εη. κ初d駆l. ゆηI. I l. l. TAC TCA AGC TAT GCA TCA AGC TTG ATG AGT TCG ATA CGT AGT TCG AAC. GTA CCG CAT GGC. AGC TCG GAT CCA CTA GTA ACG GCC TCG AGC CTA GGT GAT CAT． TGC CGG. 8S以1. ｝. （∫ofl. ’l. CCA TCA CAC TGG CGG GGT AGT GTG ACC GCC. ♪Ool l. ∼ε月Xba l. CCG CTC GGC GAG. GAG CAT GCA TCT AGA CTC GTA CGT AGA TCT. AAT TCA TTA AGT. CTG GCC GTC GTT TTA GAC CGG CAG CAA AAT. TCA CTC AGC ATA A「r. I. GGC GAA TTC TGC CCG CTT AAG ACG. 書闘翫国民農. Aρ∂1 ド. 目. T7 Promoter. AGT GAG TCG TAT T. εσoRV. εcoR l l. l. GCC AGT GTG CTG GAA TTC GCC CGG TCA CAC GAC CTT AAG CGG. T. SaCli㌣旧1． s7θl. 85以1 εcoR l. l. †. S6Promoter. M13Reverse P面mer. GGG CCC AAT TCG CCC GGG TTA AGC. AGA TAT TCT ATA. CCC TAT GGG ATA. M13（・40）Forward P日mer. M13（・20）Forward P丙mer C. T G. CGT GAC TGG GAA AAC GCA CTG ACC CTT TTG. ．468. pCRMOPOの制限酵素地図 ＋1 ●. 9. o. ●. pCRρIl・TOPO⑪ 3．9kb. ●. ●. ず ∂. σ. （2001，TOPO TA CIoning v6rsioなしより引用）. 図2. 実験に使用したプラスミドの構造.
(33) ①♀マウスに頚椎脱臼を行う. ②♀マウスから胎児を取り出す. 、二薄 〆− ＼タ麟1む亭. 摩. 一 4卜一一／二 ﾅ暑. ③三図砦児からマウス生筍鍵．. ？. ④性腺・副腎のみにトリミングする. 一鎗胴 L＝一樋コ 図3 マウス生殖腺の採取.
(34) ＜Dax 1＃4＞ Pst. Eco. Pst. Pst. B. 1. PGA PGAD424. iEco−Pst P60bp） （Pst−Pst：939bp）. ＜Dax1＃21＞. Eo. （Pst−Bgl＝1．5kbp）. 一 〇：4. Eco （Eco−Eco：979bp）. （Pst−Pst：407bp）. Bam. Eco. PGAD424. （Eco−Bam＝2kbp）. 次ページに続く.
(35) ＜Emx2 C＃4＞. Eco. pGAD424 E. Eco（Eco−Eco＝90bp）. B. Bam @ I. Pst Pst. am Sma. @l’Pst. Bg. Pst. （Pst−Pst：150bp） （Eco−Pst：60bp）. am− am＝．. P （Bam−Bgl＝4kbp）. ＜Emx2 C＃p57＞ （Sma−Bgl：3，2kbp）. S. Bam. PCR−TOPO. ma. o. CO囎. （Eco−Eco＝2．9kbp）. 91. ●. P. Bam. 舎t. Eco. Bgl. （Eco−Pst：43bp）. （Sma−Bam＝1．7kbp）. （Bam−Bg旧．5kbp）. 次ページに続く. 1. pc叫 TOPO.
(36) 〈WTl BC5（1−21）〉. 260bp. pGAD424 EcO. Bam. 380bp. ㎡1掻 Sma. 、 45b. pn. Bgl. ノ E. PGAD424. −B i’22kb. 〈WTI BG11（3−25）〉. Eco. （Pst−Eco＝200bp）（Eco−Pst：400bp） （Pst−Pst：600bp）. ＜GATA4 C−T＃11＞ （Sm−m＝00b pGAD424 Pst EcO. am. （Sm年，，，、§臨）Eo Sma. （Pst−Bgl＝500bp）. Pst 1. PCR−TOPO. （Eco−Eco：1kbp）. （Bam−Eco：950bp） （Bam−Bgl＝1。8kbp）. 図4 制限酵素地図及びWISHで用いたプローブ位置 黒い実線はベクター部位を、長方形部分はリクローニングした各クローン、ピンク色の部分はWSHで用いたプローブ部位を示す。.
(37) T3. RV pBS. T7. FW. pBSヘクローニングを行う （TOPO 10の場合も同様）. ↓. PCR FW T7. PCRでプローブ領域を増やす. T3 RV ↓. T7／T3 RNA polymerase＋↑一UTP. ジゴキシゲニンでラベリングされた. ◎. DIG標識プローブを作製する. 凹P，。be ↓ WISH. probe 四 ”冨耀圃〃”躍. マウスの12．5日胚へDIG標識プローブを. 劉’. ハイブリダイズする 胚. AP. mRNA アルカリフォスターゼ（AP）を結合させた. ” 獣鴇’’”劉’劉劉卿劉劉劉躍’. ↓. DIGを認識する抗体はD畳G標識プローブへ 結合する. 抗体に結合しているアルカリフォス ターゼ（AP）が基質のX一リン酸部分を. 切ることになり青色を発色させる 図5 WIS卜1の方法.
(38) sequence （∼300bp）. 各クローンの部分的塩基配列の決定. （⊃ ↓. マウスmRNA（cDNA）データベース. （タンパク配列）. ／ ＼ 茎ヒ贈 マウスゲノムデータベース. モチーフ検索. （500kbpデータ）. （exsonsデータ）. 図6 セレラ社のデータベースを用いた解析方法について.
(39) エクソン 5’・・・…. イントロン AGGUAAGU・・・・…. エクソン 。・・6。…. PyPyPyPyPyPyNCAGN・・・…. 3’. 図7 エクソン、イントロンの切断点のコンセンサス配列 Pyはピリミジン塩基（uまたは。）、 Nは任意の塩基を示す.
(40) ♀. ♂ ・鯉. Dax1. 磁：驚懇ヲ. 蓮. 鵡＿. Emx2. WT 1. 講. 撃’. ’㍉−. 鳶ツ. GATA4 ㌧転. ’一一』. ㌣．”r』. @. 梱 ヒ. 馳ゆ騨鱒・. ．、. Sox9. 嚇. ズ：：1撫、．㌦蕪躍. ごを. ㌔＼. ぬセへぬじ. キニ の. 図8 マウス12．5日胚における各転写因子の発現様式 （基礎生物学研究所細胞分化研究部門による資料提供）. 等.
(41) Dax−1full＃4 ♀. ♂. AS. S. Dax−1full＃21 ♀. ♂ 、. AS. S. 図9 Dax1と蛋白質一蛋白相質互作用でとれたクローンの発現様式 ASはアンチセンスプローブを使用し、 Sはセンスプローブを使用した結果を示す。.
(42) 各クローンの発現様式①. Emx2N＃2，16 ♀. ♂. ・鱗. AS. 、・惣1. 躍霧開閉嚢綴羅塗i聯. S. Emx2N＃3 ♂. ♀. AS. S. Emx2FOX（N＃39，18，37，42，43）. ♂. ♀. AS. 雛熱潮懸灘無謝. S. 鷺 ．一1編醸. 野 次ページに続く.
(43) 各クローンの発現様式②. Emx2C＃4 ♀. ♂. げ 棚. 1容「. セ ．戸. AS. ｸ輻. ！4. ？／ ㌦， ㌔ミ ，、．瀞. S. Emx2C＃8，23，48，64. ♂. AS. 肝. ♀. 三. 遷回り喫舞．艦罎∴魑 、 ＿鞠岬q∼一 一β ．m騨一. 鎖. S. ♂. AS. S. Emx2C＃17. ♀. 蟹纒難＿ン1. 8：葱隷一層. 次ページに続く.
(44) 各クローンの発現様式③. Emx2C＃45 ♂. ♀. AS. S. Emx2C＃57 ♀. ♂. AS. 鱒. ぐ㌧. S. ゆ う. 図10 Emx2と蛋白質一蛋白質相互作用でとれたクローンの発現様式 ASはアンチセンスプローブを使用し、 Sはセンスプローブを使用した結果を示す。.
(45) WTI BC5（1−21） ♀. ♂. ポ. AS P. S. WTI BG11（3−25） ♂. ♀. AS. S. 図11 WT 1と蛋白質一蛋白質相互作用でとれたクローンの発現様式 ASはアンチセンスプローブを使用し、 Sはセンスプローブを使用した結果を示す。.
(46) GATA−4 C−T＃7 ♂. ♀. 《. AS. 証號−一. ・ぽ軸. 一、」d騨爵漕. S. GATAC−T＃11 ♀. ♂. AS. S. GATA−4 C−T＃48 ♂. ♀. AS. S. 図12 GATA4と蛋白質一蛋白質相互作用でとれたクローンの発現様式 ASはアンチセンスプローブを使用し、 Sはセンスプローブを使用した結果を示す。.
(47) Sox9／GATA4 AG 3（＃46）／AF3（C−SC＃95）. ♂. 「. ♀ ヒ璽. AS. S. 図13 Sox9及びGATA4と蛋白質一蛋白質相互作用でとれたクローンの発現様式 ASはアンチセンスプローブを使用し、 Sはセンスプローブを使用した結果を示す。.
(48) Dax1＃4（unknown） 1869 sequence data. 3054. ：÷：・：・：・：・：・：・：・：・：・：1：1：8：5」⊃p：・：÷：・：・：・1・：・：・：・：・：・：・：・：. 1. 986. 1157 1185b. 82. 139a．a．．. mRNA. P「otein. motlf…. No Domain Hit. 次ページに続く.
(49) Dax1＃21（unknown）. 1546. 8 sequence data. @. ：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：限qq頃：：：：：. 1. 30. 1538. 3408. ：：：：：：：：：：：：二：：：：：：：：：：：：二：：：：：：：：：：：二：：：：：：：：：：：. 1611. 2976. 33b. 34. mRNA. protein. motif. 10. 992a．a．. 156∼218. 203∼220. ARG RICH NLS BP. 次ページに続く.
(50) Emx2 N＃2，16（Dlexin）. 676. 1. sequence data. mRNA. ：二6β7垣直：：：：：：：：. 18. 213. 34. 2536 2750b. protein. 62. motlf. 837a．a．. 48∼650 335∼504 390∼497. MAGE PRO RICH TRP RICH. 次ページに続く.
(51) Emx2 N＃3（proline rich）. 1. sequence data. 586 二：：鈴6頃：：：：：. 5 l. P6. 0. 519. 177. mRNA. proteln. 6173a．a． motif. 13∼139. 一一 PRO RCH 謬1 BPD T凧NSP INN MEMBER 次ページに続く.
(52) Emx2 Fox（N＃39，18，37，42，43）（Fox−1−RNA binding motif）. 1131. 67. nce data. ．. ・. ．. E @．. 1. mRNA. 477. ● …. ・ o. …. ・. ● ．. 9. 顧. ● 曾. 曹 L. 馴. 814. ■ ．. n. o. ■ ・ の. ● o. 」. ・ ■. ● ● 唖. ● ● ●. 國. 1. 80. 2071. 33289b. protein. 107. 639a．a．. RRM. 323∼394. rrm motif. 470∼567 322∼398 361∼368. ALA RICH. RRM RRM RNP 1. 次ページに続く.
(53) Emx2 C＃4（unknown）. 3 140. sequence data 3. 1 ． 70. 28 P4. 1 13. mRNA. 3368b. 1ご噛‘』 ・・違こ1・、 畢，. proteln 44. 939a．a．. motif・・ ・No Domain Hit. 次ページに続く.
(54) Emx2 C＃8，23，48，64（KIAA1098） sequence data. ＝・：・二・：4・18bP・二・：・：・：・. 355. 1 261. 73. 1806. 3893b. mRNA protem 21. 536a．a． 335∼352 462∼486 373∼397. 一一一一一一一一一一一一 e■」一一一一一一一一BUTYPHLNCDUF 131司72 一一一一黶怦鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈鼈黶EBBOX. 338∼527 56∼95. SPRY RING. 一白一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一zf−C3HC4. ギー一一一一一一一一・f−Bb。・ 56−96. ZF RING 339∼502. GAMMA CARBOXYLASE. 灘L＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿＿ZF BBOX 71∼80. ZINC FINGER C3HC4 次ページに続く.
(55) Emx2 C＃17（Zetin？）. 520. 30 sequence data. mRNA. proteln. ：：：：4獣頃：：：：. 1. 886. 2. 11. 1b. 496a．a．. a…………≡……鱗 1. motif. 2. 3 4. 5. ● 341∼464. 26∼62. SPRY PRO RICH. 290∼449. GAMMA CARBOXYLASE. 次ページに続く.
(56) Emx2 C＃45（unknown）. 161 413 sequence data. ：Z2煽. 1. mRNA. 9222b ［■. prote畳n 13 90a．a．. motif… No Domain Hit. 次ページに続く.
(57) Emx2 C＃57（unknown）. 255 sequence data. 1. 130. 469. ：・：・：・21・｝bp二・ 51. 2814. 3368b. mRNA. 44. motif…. 939a．a．. No Domain Hit. 次ページに続く.
(58) WTl BC5（1−21）（unknown） 87 sequence data. 685. ：・：・：・597bウニ・：・：. 7 16. 1. 782. 11301b. 11154. RNA. 3718a．a．. 1. proteln. motif 1644酎1700. PH 1880∼. 732239∼2272. Sema. 118∼257. DENN 2744∼2829. 2 2∼2742. 2316∼2367. TIG. 2∼2 2. 607∼2650. Plexin repeat 118∼257. 1648∼1700. DENN DOMAIN PH DOMAIN. 次ページに続く.
(59) WTI BG11（3−25）（WW domain containlng protein 2）. 2053. 5釜♀. sequence data. ヒ. 96. 1. 81. mRNA. ：，．：：：二：：：：：：：．：．：：1§零＄均P：：：：．：：：：：：：二：：二：：：. ．. ．. 卜. 丁. 1馬. 」 馳. −. 馳. ㌻. −. I. p. 脚 一. 」. ．. ■. ． ・. 1. さ. ’. F. r. 「. 一. ヒ. F・. 「. r. 「. 1. 馬. ・. 3. 噛一 −. ’. ㍗. 「. 919b. 圏. 「. ・. 、. 圏. 幽. ℃. ， F. 噛. 山688. r. 1. r. proteln. 14. 883a．a．. 343∼358 434酎448. motif. 344∼376. WWDOMAIN. 458∼490. WW. 32∼128. C2 547∼883 345∼374. 315∼344. 459−488. 420∼448. 578∼883 ヨ ヨリヨ. ら バ. HECTc. WW HECT WW DOMAIN 24. 549∼883 349∼374. 463∼488. HECT WW DOMAIN 1 次ページに続く.
(60) GATA4 C−T＃7（unknown）. 487. 136 sequence data. ：：：3：5：，：bb：：二. 91. mRNA. 1. proteln. 120. 40. 71∼99. motif. 44. 105∼133. 70∼130 252∼350. 300. 隣693b. 433a．a．. efhand EF HAND GLU RICH GLN RICH. 次ページに続く.
(61) GATA C−T＃11（Chromatin assebly factor）. 216 sequence data. 374. ・：1：・46bρ. 123. 1. 1. 78. 2700 2804b. mRNA protein 1. 900a．a．. 329∼432 323∼423. mjotif 344∼361 380∼397. 844∼861. LYS RlCH. GLU RICH NLS BP 5. 次ページに続く.
(62) GATA4 C−T＃48（unknown）. 189208. sequence data 10. 19bp 20. 1 4. 944. 14. 314a．a．. 1176b. mRNA. proteln. 3∼20. motif. NLS BP. 次ページに続く.
(63) SOX9／GATA4 AG3（＃46）／AF3（C−SC＃95）（unknowrl） sequence data. 87. 527 ㈱坤i：. 1. 575 662. 1014. 5314b. 417. proteln. 221. 1392a．a．. motif. 1286∼1298. 1298∼1310ANKYR囚. ｛llil AN穣i灘灘灘…難. 1∼15. 1∼1. 灘iii灘1灘灘灘. 269∼281. 121∼4 174∼198. ARG RICH. …山畠iiliiiiiiiii瀬iiii！il1. 1∼11. 174∼196. 182｛499. NLS BP 2. 404∼1392. NK REP REGION. 図14 セレラ社のmRNAデータベースで得られた解析結果 sequence dataはsequenceを行った結果、 mRNA，protein，motifはセレラ社のデータベースで得られたデータである。. sequence dataとmRNAデータ、 mRNAデータとproteinのデータは適合した位置にあわせて示している。.
(64) Dax 1＃4. Chromosome＃10 4. （genome 126674398∼126676084：length l 687bp） 3. 2. 1. エクソン. genome. イントロン 1ength. genome. length. 468876酬468993（126675966∼126676084）＊. 118. 468875鞭）5（12667596，126675886）＊. 80. S68742棚794〈126675832〔’126675885）. T3. S68741姻39（126675831−126675530）. R02. S68375姻38（126675465∼126675529）. U3. S68374∼468258（126675464’》126675349）. P16. S67308∼468257（126674398−126675348）. X50. 123. 次ページに続く.
(65) Dax 1＃21. chromosome＃11 （genome 654879∼735832：length 80954bp）. 2 3 45678 9. 1. 2. 1. 3. 1011 1213 5. 4. エクソン. 6. 8. 9. 0 11. 12 13. 14. 151617. 145. 18. 1 17. イントロン. genome. length. 131260∼131381（649879勇95001）＊. ge駐ome. 1ength. 121. 131382−149011（695002∼704530）＊. 9529. P40912｝140985（704531御7（ン駅505）. V4. P40986州143242（7（ン脳∼706861）. Q256. P43243∼143370（706862∼706990）. P28. P43371∼147871（706991∼711490）. S500. P47872∼148158（711491阿711778）. P48159〔’148720（711779∼712339）. T61. P48721｝148922（712340創712542）. P48923〔’152262（712543∼715881）. R339. P52263飼152438（715882陶716058）. P52439∼155025（716059−718644）. Q586. P55026｝155161（718645∼718781）. P55162−155336（718782−718955）. P74. P55337・｝155516（718956∼719136）. P55517−157499（719137∼721118）. P982. P57500∼157732（721119∼721352）. P57733−161618（721353∼725237）. R885. P61619倒161690（725238∼725310）. P61691−162092（725311創725711）. S01. P62093∼162276（725712∼725896）. P62277｛’163211（725897∼726830）. X34. P63212》163291（726831∼726911）. P63292∼163844（726912−727465）. T52. P63845∼163984（727464御727604）. P63985∼167031（727605∼730650）. R046. P67032削167116（730651∼730736）. P67117∼168525（730737−732144）. P408. P68526鰍168658（732145∼732278）. P68659∼170007（732279∼733626）. P348. P70008∼170349（733627∼733969）. P70〔350∼170813（73397（）雨734432）. ?S99. P70814∼170981（734433∼734601）. P70982創171481（734602−735100）. P71482・》172212（735101∼735832）. 次ページに続く.
(66) Emx2 N＃2，16 14. ChromosomeX. （genome 78462776ん78469541：1ength 6765bp）. 13. 12. 13. 109876 5. 11. 12. 9. 10. 11. エクソン. 8. 7 6. 4 4. 5. 2. 3 3. 1. 2. 1. イントロン. genome. length. 1. 310190阿310209（78469521倒78469541）＊. 20. 2. 309995曜310157（78469326∼78469489）. 3. genome. 1ength. 1. 310189−310158（7846952（》磁78469490）＊. 30. 163. 2. 3（P994竪309428（78469325」78469760）. 74. 3. 鰯. 309354剛309427（78468685∼78468759）. 3C9353∼308651（78468684∼78467983）. 702. 4. 3α7958ヴ308650（78467289〔’78467982）. 693. 4. 307957∼307385（78467箆B∼78466717）. 572. 5. 30671（〉ワ307384（78466041∼78466716）. 675. 5. 306709∼306612（78466040∼78465944）. 卯. 6. 306548哩306611（78465879創78465943）. 64. 6. 306547∼306367（78465878∼・78465699）. 180. 7. 306286》306366（78465618∼78465698）. 80. 7. 306285阿306169（78465617∼78465501）. l16. 8. 306αη一306168（78465408∼78465500）. 92. 8. 306076帽305859（78465407園78465191）. 217. 9. 305779倒30583B（7846511（》u78465190）. 80. 9. 305η＆一305688（78465109∼78465020）. 90. 10. 305645飼305687（78464976∼78465019）. 43. 10. 305644餌305326（78464975∼78464658）. 318. 305263周305325（78464594陶78464657）. 63. 11. 305262∼304958（7846593’》7846290）. 304. 12. 304842∼304215（7846173周78463547）. 627. 13. 303828∼303647（78463159声》78462979）. 181. 11. 12. 304843〔’304957（78464174∼78464289）. 115. 13. 3（B829∼304214（78463160ん78463546）. 386. 14. 303445菌3036砲5（78462776陶78462978）. 202 次ページに続く.
(67) E㎜2N＃3 Chromosome＃15 （genome99769424∼99774451：length5027bp） 4. 3. 2. 3. 1. 2. エクソン. 1. イントロン. genome. 1ength. 116684∼116712（99769424∼99769452）＊. 28. P15378配115496（99770640∼99770759）. P19. P14239∼114484｛9977165鰹ンア71898）. x1383. P14238柑113069（99771899−99773067）. 123. genome. length. 116683剛115497（99769453∼99770639）＊. l186. P15377∼114485（99770760∼99771651）. E1169. P11686》113068（9蛾3068》99774451）. 次ページに続く.
(68) E㎜2FOX（M39，18，37，42，43）Chromosome＃15. （genome 75570410∼75795133：1ength 224723bp）. 15 1413 12 11109 8 7 6 5. 3. 14. 12 111. 8. 4. 7. 6. 5. 4. 3. エクソン. 2. 1. 2. 1. イントロン. genome. 1ength. genome. 1ength. 75794477∼75795133（509941∼510596）＊. 656. 75795134∼75691402〈509942∩406916）＊. 1α3（y76. V56914α3∼75691452（406867【406915）. V5691453−75641583（406868周357158）. S9868. V5641584雨75641694（35704＆》357157）. V564169，75620769（357049−336459）. Q0924. V5620770瞬75620995（336234嗣336458）. V5620勝75604974（336235制320586）. P6020. V5604975｝75605122（320439∼320585）. V5605123∼75601658（32（）440檀317177. R463. V5601659倒75601713（317123∼317176）. V5601714∼75593630（317124∼309188）. W082. V5593631∼75593724（309095州309187）. V5593725∼75590938（309096ッ306464）. V5590939｝75591000（3064α3・》306463）. V5591001∼75587510（306404∼303029）. V5587511∼75587565（302975心303028）. V5587566∼75587311（302976》302869）. V5587312戸》75587405（302776∼302868）. V5587406∼75586011（302777−301609）. V5586012∼75586145（301476飼301608）. V5586146∼75579883（301477−295391）. V5579884｝75579927（295348’》295390）. V5579228∼75541318（295349（’289692）. V5574139∼75574228（289603∼289691）. V5574229−75573649（289604∼289187）. V5573650∼75573723（289114∼・289186）. V5573723∼75570409（289115∼287285）. Q785 ﾚ 253139362615788銘3313. V5570410∼75571821（285B74∼287284）. 次ページに続く.
(69) E㎜2C桝 Chromosome＃5 16. 15. 141312. 15. 14. 12. （genome l 7736866∼・17773248：length 36382bp）. 111098 765 11. 10. 9. 8. 7. エクソン. 4 6. 5. 4. 2. 3 3. 2. 1. 1. イントロン. genome. length. 1. 119856》120296（17736866∼17737307）＊. 441. 2. 119674∼119719（17737443’》17737489）. 3. genome. 1ength. 1. l19855・｝119720（17737308∼17737442）＊. 135. 妬. 2. l19673−l13720（17737490∼17743442）. 5953. 113535∼113719（17743443∼17743628）. 185. 3. 113534∼107434（17743629’》17749728）. 6100. 4. 107192∼107433（17749729∼17749971）. 242. 4. 107191∼101718（17749972｛’17755444）. 5473. 5. 101502∼101717（17755445｝17755661）. 216. 5. 101501∼101457（17755662∼17755705）. 44. 6. 101249∼101456（17755706り17755914）. 208. 6. 101248園100037（17755915∼17757125）. 1211. 7. 99962卍100036（17757126∼17757201）. 75. 7. 99961∼97373（17757202∼17759789）. 2588. 8. 97262削97372（17759790帽17759901）. 111. 8. 97261切188（17759902∼17759974）. 73. 9. 96962−97187（17759975∼17760201）. 226. 9. 96961∼96260（17760202−17760902）. 701. 10. 96122∼96259（17760903削17761041）. 138. 10. 96121∩95447（17761042∼17761715）. 674. 95247削95446（17761716園17761916）. 200. 11. 95246蝋7（17761917∼17767115）. 5199. 89844∼900ピ艇5（17767116》17767319）. 2（B. 12. 89843∼89178（1776732（）｝17767984）. 665. 13. 88996｝88882（17768167∼17768280）. 114. 11. 12 13. 88997∼89177（17767985柑17768166）. 181. 14. 89763一’88881（17768281∼17768取X））. 119. 14. 88762陶86370（17768401∼17770792）. 2392. 15. 86188・》86369（1777α793削17η0975）. 藍82. 15. 86187−84510（17770976∼17772652）. 1677. 16. 83915》84509（17772653∼17773248）. 595 次ページに続く.
(70) Chromosome＃14. Emx2 C＃8234864 ， ，. ，. 4. 5. 6 5. （genome 61048552∼61063167：length 14615bp）. 4. 2. 3. 1. 2. 3. 1. イントロン. エクソン. genome. length. 1. 275095∼269459（61048521削61054928）＊. 5636. 96. 2. 269362∼268635（61055026め1055752）. 727. 268404∼268634（61055753∼61055984）. 231. 3. 268403∼265614（6105598㌻61058773）. 2789. 4. 265591∼265613（61058774崎10597助. 23. 4. 265590∼264828（61058798M51059559）. 762. 5. 264709∼264827（61059560∼61059679）. 119. 5. 264708∼263905（61059680∼61060482）. 6. 2684. ㎜. 261221創263904（61060483∼61063167）. genome. 監ength. 1. 275096∼275835（61048522∼61049262）＊. 740. 2. 269363∼269458（61054929∼61055025）. 3. 次ページに続く.
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