岡 山 医 誌(1996) 108, 293∼296
組 織 固 定 剤 と して の タ ンニ ン酸,特
に グル タ ール
ア ル デ ヒ ドとパ ラ ホル ム アル デ ヒ ドとの混 用
岡 山 大 学 医 学 部 第 二 解 剖 学 教 室(主 任:村 上 宅 郎 教 授) 村 上 宅 郎,朴 大勛,大塚 愛 二,西 田 圭 一 郎 (平 成8年6月27日 受 稿)Key words: Tannic acid, paraformaldehyde, glutaraldehyde, tissue fixation
緒 言 タ ン ニ ン酸 は 五 倍 子 ま た は 没 食 子 か ら単 離 さ れ る ガ ロ イ ル グ ル コー ス で,そ の 生 薬 は タ ンナ ル ビ ンが 登 場 す る ま で 腸 収 歛 薬 と し て 重 用 され た.タ ンニ ン 酸 は 皮 の な め し剤,お 歯 黒 の 基 材 (附子)と して も名 高 く,農 家 で は 竹 籠 な ど張 り子 の上 薬(柿 の しぶ)と し て も使 用 され た. タ ンニ ン酸 の組 織 学 に お け る利 用 はSchuberg (1909)のAzur-Eosin染 色1)か らで,そ の 後 渡 銀 の 還 元 剤 等 に 多 用 され た2).そ し て 水 平 ら は タ ンニ ン 酸 と グ ル タ ー ル ア ル デ ヒ ドの 混 液 は 弾 性 線 維 を明 瞭 に 固定 す る強 力 な 組 織 固 定 剤 で あ る こ と を示 した3).ほ ぼ 同 時 に,私 達 は タ ン ニ ン 酸 の 組 織 固 定 作 用 と金 属 還 元 作 用 を利 用 して タ ンニ ン ・ オ ス ミウ ム導 電 染 色 法 を 開 発 し4),続い て ア ル ギ ニ ン 等 の ア ミ ノ酸 や 糖 質 を 用 い て タ ン ニ ン 酸 の 組 織 内植 え込 み の 増 強 を行 っ た5). 本 研 究 で は 組 織 固 定 剤 と し て の タ ン ニ ン 酸 を 再 検 討 し,タ ン ニ ン酸 単 独 で もペ プ トン を 沈 殿 させ,グ ル タ ー ル ア ル デ ヒ ドや パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ドと混 用 す る と単 味 の ア ル ギ ニ ン を も沈 殿 させ る強 力 な 固 定 剤 で あ る こ と を述 べ る. 材 料 と 方 法 1. 下 記a)-e)の 固 定 液 を調 製 した. a) タ ン ニ ン酸 単 独 液(タ ン ニ ン酸, TAAB Laboratories,を0.5%の 割 合 に 含 む0.1M カ コ ジ ル酸 緩 衡 液, pH 7.2)-(T液) b) グ ル タ ー ル ア ル デ ヒ ドま た は パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド単 独 液(グ ル タ ー ル ア ル デ ヒ ド, 片 山 化 学,を2.5%ま た は パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド,片 山 化 学,を4.0%の 割 合 に 含 む0.1 Mカ コ ジ ル 酸 緩 衡 液, pH 7.2)-(G液 ま た はP液) c) グ ル ター ル ア ル デ ヒ ド ・タ ン ニ ン酸 混 液 (グ ル ター ル ア ル デ ヒ ドを2.5%,タ ン ニ ン 酸 を0.5%の 割 合 に 含 む0.1Mカ コ ジ ル 酸 緩 衡 液, pH 7.2)-(GT液) d) パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド ・タ ン ニ ン酸 混 液 (パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ドを4.0%,タ ン ニ ン 酸 を0.5%の 割 合 に 含 む0.1Mカ コ ジ ル 酸 緩 衡 液, pH 7.2)-(PT液) e) グ ル ター ル ア ル デ ヒ ド ・パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド ・タ ン ニ ン酸 混 液(グ ル ター ル ア ル デ ヒ ドを2.5%,パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ドを4.0 %,タ ン ニ ン酸 を0.5%の 割 合 に 含 む0.1M カ コ ジ ル 酸 緩 衡 液, pH 7.2)-(GPT液) 2. 下 記f)-l)の ア ミノ酸,ペ プ チ ドの 単 味 被 験 液 を調 製 した. f) グ リ シ ン 液(グ リ シ ン,片 山化 学,を10 %の 割 合 に 含 む 蒸 留 水) g) ア ル ギ ニ ン液(ア ル ギ ニ ン,片 山化 学, を10%の 割 合 に 含 む 蒸 留 水) h) グ ル タ ミン酸 液(グ ル タ ミン 酸 飽 和,ま た は グ ル タ ミン 酸 ソ ー ダ,片 山化 学,を10 %の 割 合 に 含 む 蒸 留 水) 293
294
村 上
宅郎:他3名
i) グ ル タチ オ ン 液(グ ル タチ オ ン 還 元 型, ナ カ ラ イ テ ス ク,を10%の 割 合 に 含 む 蒸 留 水) j) ペ プ トン 液(ペ プ トン,ミ クニ 化 学,を 10%の 割 合 に 含 む 蒸 留 水) k) ア ル ブ ミ ン液(牛 血 清 ア ル ブ ミ ン,片 山 化 学,を10%の 割 合 に 含 む 蒸 留 水) l) ゼ ラ チ ン 液(ゼ ラ チ ン,片 山 化 学,を10 %の 割 合 に 含 む 蒸 留 水) 3. 上 記1の 固 定 液 と2の 被 験 液 を4:1の 割 合 で 混 合 し,沈 殿 の 有 無 を調 べ た.ま た適 宜 に0.1 NHCIま た はNaOHを 滴 下 してpH 値 を上 下 し て 反 応 の 変 化 を み た. 結 果 1) グ リ シ ン 液 pH 7.2-1.0で はT, G, P, PT液 に 全 く反 応 しな か っ た.し か し, GTとGPT液 に はpH 1.5で 反 応 し白 色 沈 殿 が 生 じ た. 2) ア ル ギ ニ ン液 pH 7.2-1.0で はT, G, P液 に 全 く反 応 しな か っ た.し か し, GTとGPT液 に はpH 8.0-1.0で 白色 沈 殿 が 生 じた. PT液 に はpH 6.0-1.0で 白 色 沈 殿 が み られ た. 3) グル タ ミン 酸 液 pH 7.2-1.0でT, G, P, GT, PT, GPT液 に 全 く反 応 し な か っ た. 4) グル タ チ オ ン液 pH 7.2-1.0でT, G, P, PT液 に全 く反 応 し な か っ た.し か し, GTとGPT液 に はpH 5.0-1.0 で 反 応 し 白 色 沈 殿 が 生 じ た. 5) ペ プ トン液,ア ル ブ ミ ン液,ゼ ラ チ ン 液 こ れ ら3液 はpH 7.2-1.0でGとP液 に は 全 く 反 応 しな か っ た.し か し, 3液 はpH 7.2の レベ ル で 直 ち にT液 は も ち ろ ん の こ とGT, PT, GPT 液 と反 応 し 白色 沈 殿 を 生 じた. 6) ア ル ギ ニ ン と グ ル タチ オ ン 液 の 分 離 処 理 T, G, P液 を加 え た ア ル ギ ニ ン各 液 に そ れ ぞれG, T, T液 を追 加 す る と各 液 に 沈 殿 が 起 こ っ た.同 様 の 現 象 は グル タチ オ ン 液 で も認 め られ た が,グ リ シン と グル タ ミ ン酸 液 で は 認 め られ な か っ た. 考 察 昨 今 の 組 織 固 定 で は 構 造 の 保 全 と と も に,酵 素 や 生 理 物 質 の 保 存 と そ の 活 性 保 持 が 要 求 さ れ る.そ し て,従 来 の ホ ル ム ア ル デ ヒ ドに 代 わ っ て グ ル ター ル ア ル デ ヒ ドや パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ドが 一 般 的 に使 用 さ れ て い る.タ ン ニ ン 酸 は 凝 集 反 応 が 強 く組 織 固 定 に は 適 さ な い と され て き た.パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ドは 従 来 常 用 さ れ た ホ ル ム ア ル デ ヒ ドの 環 状 三 量 体 ト リオ キ シ メ チ レ ン と考 え られ て きた が, (CH2O)nのnが3以 上 10∼1000の もの も含 む と さ れ る. 水 平 と協 同研 究 者 達 は タ ン ニ ン酸 とグル ター ル ア ル デ ヒ ドとを混 用 す る こ とに よ っ て 弾 性 線 維 な ど を透 過 電 顕 下 に 明 瞭 に 観 察 し た3).そ して,そ の 後 の 検 討 に よ っ て,タ ン ニ ン 酸 は組 織 との凝 集 反 応 を 軽 減 で き る0.5%の 濃 度 で も十 分 な 固定 効 果 が 期 待 で き る こ とが 明 らか と な っ て きて い る. 本 研 究 は 水 平 らの 研 究 を 補 完 す る もの で あ る. す な わ ち,本 研 究 は タ ン ニ ン 酸 と グ ル タ ー ル ア ル デ ヒ ドと の 混 液 は ア ル ギ ニ ン な ど の 塩 基 性 ア ミノ 酸 をpH 7.2の 生 理 的 レベ ル で 沈 殿 させ,中 酸 性 域 で グ ル タ チ オ ン を凝 集 し,強 酸 性 域 で グ リ シ ン と反 応 す る非 常 に 強 力 な 組 織 固 定 剤 で あ る こ と を証 明 した.さ ら に 本 研 究 は パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ドと タ ン ニ ン 酸 との 混 液 も ほ ぼ 同様 の 効 果 が 期 待 で き る こ と を 明 ら か に し た.私 達 は, 特 に脳 の透 過 電 顕 観 察 に お い て は, 2.5%グ ル タ ー ル ア ル デ ヒ ド・4.0%パ ラ ホル ムア ルデ ヒ ド・ 0.5%タ ン ニ ン酸 混 液 を 常 用 し て い る.こ の タ ン ニ ン 酸 を 含 む 固定 液 で は粗 面 小 胞 体 や ゴ ル ジ装 置 の 腔 内 物 質 や 神 経 細 胞 周 囲 の プ ロ テ オ グ リカ ン被 膜 が 明 瞭 に 可 視 化 さ れ る. タ ン ニ ン酸 の 組 織 活 性 へ の 影 響 に つ い て は十 分 に 検 討 さ れ て い な い.し か し,私 達 の最 近 の 関 節 フ イ ブ ロ ネ クチ ン金 コ ロ イ ド免 疫 染 色 で は, グ ル タ ー ル ア ル デ ヒ ド単 独 固 定 よ リ グ ル ター ル ア ル デ ヒ ド ・タ ン ニ ン酸 混 液 固 定 で従 来 の 所 見 を しの ぐ良 い 結 果 を得 て い る6).また 別 の実 験 で, ラ ッ トや マ ウ ス の 脳 を4%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド・0.5%タ ンニ ン酸 混 液 で 固 定 し て,レ ク チ ン 標 識 ・ヒア ル ロ ニ ダ ー ゼ 消 化 ・コ ン ドロ イ チ ナ ー ゼABC消 化 を行 っ た と こ ろ ,得 られ た所見 はタ ン ニ ン 酸 に よ る組 織 固 定 295 4%パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド単 独 固 定 に よ る所 見 に 劣 る こ と は な か っ た7).従 っ て,タ ン ニ ン酸 は, 低 濃 度 で使 用 す るか ぎ りで は,免 疫 反 応 ・レ ク チ ン標 識 ・酵 素 消 化 な どの 組 織 化 学 的 検 索 に 特 に障 害 に な ら な い と思 わ れ る.組 織 化 学 あ る い は免 疫 組 織 化 学 的 検 索 の た め に ホ ル ム ア ル デ ヒ ドが 単 独 で使 用 され る こ と が あ る8).この 場 合 で もタ ンニ ン 酸 との 混 用 が期 待 さ れ る.な お,タ ン ニ ン 酸 を含 む 固 定 剤 はpHに よ っ て 固 定 力 が 異 な るの で 実 際 の 使 用 に あ た っ て はpH値 を十 分 に 考 慮 す る必 要 が あ る.ま た,目 的 に よ っ て タ ン ニ ン 酸 の使 用 量 を適 宜 に 増 量 して もよ い と思 わ れ る. タ ン ニ ン酸 の 活 性 基 は ガ ロ イ ル 基 で あ りフ ェ ノー ル 性OHで あ る.グ ル タ ー ル ア ル デ ヒ ドや パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ドの 活 性 基 は ア ル デ ヒ ド基 で あ りア セ ター ルOHで あ る.こ れ ら の 二 種 のOH を介 して タ ン ニ ン 酸 とア ル デ ヒ ドが 単 味 の ア ミ ノ酸 の 間 に 入 っ て 巨 大 分 子 を形 成 し,沈 殿 をお こす と考 え られ る.こ の こ と と関 連 して,ペ プ トン,ア ル ブ ミン,ゼ ラ チ ンが タ ン ニ ン酸 単 独 処 理 で 沈 殿 し,グ ル タ ー ル ア ル デ ヒ ド単 独 で は 沈 殿 しな い こ と は 興 味 深 い.グ ル ター ル ア ル デ ヒ ドあ る い は パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド と タ ン ニ ン 酸 に よ る ア ル ギ ニ ン と グ ル タ チ オ ン の分 離 処 理 で も沈 殿 が 起 る こ と も面 白 い.す な わ ち,こ れ ら の 事 実 は タ ン ニ ン 酸 と ア ル デ ヒ ド とは,ア ミ ノ酸,ペ プ チ ドあ る い は 蛋 白の そ れ ぞ れ 異 な っ た部 位 に 作 用 して い る こ と を示 唆 して い る.な お,ア セ ター ルOHは ア ミノ 基 に 反 応 して メチ レ ン架 橋 を形 成 す る こ とは よ く知 ら れ て い る. タ ン ニ ン 酸 の糖 質 との 反 応 は 明 らか で な い. しか し,私 達 の 先 の 実 験 で は タ ン ニ ン酸 で処 理 した 澱 粉 は オ ス ミウ ム 酸 に染 ま り黒 変 した5).こ の 実 験 は,タ ン ニ ン 酸 は 糖 質 と静 電 的 に 結 合 す る こ と を示 唆 して い る. 結 論 タ ン ニ ン 酸 と グ ル タ ー ル ア ル デ ヒ ドな い しパ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド との 混 液 は 単 味 の 塩 基 性 ア ミ ノ酸 で あ る ア ル ギ ニ ン,オ リ ゴペ プ チ ドで あ る グ ル タ チ オ ン を沈 殿 さ せ る強 力 な 組 織 固定 剤 で あ る.こ の タ ン ニ ン ・ア ル デ ヒ ドで 固 定 され た組 織 は 免 疫 反 応,レ ク チ ン標 識,酵 素 消 化 等 の組 織 化 学 的 検 索 に よ く反 応 す る. 謝 辞 草 野博 通,楢 崎正 博,溝 口久 夫 技 官 の協 力 に深 謝 します.
文
献
1) Schuberg A: Uber die Farbung von Schnittpraparation
mit der Giemsaschen Azur-Eosin-Methode.
Deutsche med Wochenschrift
(1909), S 2106.
2) Romeis B: Tannin-Silber-Methoden;
in Mikroskopische
Technik,
B. Romeis ed, R. Oldenbourg
Verlag, Munchen・Wien (1968) pp 383-387.
3) Mizuhira V, Nakamura
H and Fujioka T: New staining method for the elastic fibers using tannic
acid-glutaraldehyde
mixture. J Electron Microsc (1972) 21, 240.
4) Murakami T: A metal impregnation
method of biological specimens for scanning electron micros
copy. Arch Histol Jpn (1973) 35, 323-326.
5) Murakami T: A revised tannin-osmium method for non-coated scanning electron microscope speci
mens. Arch Histol Jpn (1974) 36, 189-193.
6) Nishida K, Inoue H and Murakami
T: Immunohistochemical
demonstration
of fibronectin in the
most superficial layer of normal rabbit cartilage. Ann Rheum Dis (1995) 54, 995-998.
7) Murakami T, Ohtsuka A, Taguchi T and Piao DX: Perineuronal sulfated proteoglycans and dark
neurons in the brain and spinal cord: a histochemical and electron microscopic study of newborn and
adult mice. Arch Histol Jpn (1995) 58, 557-565.
8) Puchtler, H and Meloan SN: On the chemistry of formaldehyde fixation and its effects on immunohis
tochemical reactions. Histochemistry
(1985) 82, 201-204.
296 村 上 宅 郎:他3名
Tannic acid as a tissue fixative, with special reference
to mixed use with glutaraldehyde
and paraformaldehyde
Takuro MURAKAMI,
Da Xun PIAO,
Aiji OHTSUKA
and Keiichiro NISHIDA
Section of Human Morphology,
Department of Anatomy,
Okayama University Medical School,
Okayama 700, Japan
(Director: Prof. T. Murakami)
Tannic acid mixed with glutaraldehyde or paraformaldehyde is a strong fixative, which can precipitate amino acids and oligopeptides such as arginine and glutathione. Tissue specimens fixed with this tannin-aldehyde mixture are useful for histochemical studies, including lectin labeling, immunological staining and tissue enzyme digestion.
