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IRUCAA@TDC : 歯周組織の再生を目指した間葉系幹細胞の研究

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Academic year: 2021

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Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/

Title

歯周組織の再生を目指した間葉系幹細胞の研究

Author(s)

中川, 種昭; 森川, 暁

Journal

歯科学報, 112(5): 624-630

URL

http://hdl.handle.net/10130/2946

Right

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はじめに 2002年に筆頭著者の中川が慶應義塾大学医学部に 異動後,従来から進めてきた歯周病原細菌に関する 研究に加え,以前から興味のあった失われた口腔組 織の再生についての研究を開始した。臨床応用には まだ道半ばであるが,現在までの成果の一部を報告 する。学術誌である事は承知の上で,専門ではない 先生,若い先生にも読んでいただきたく,散文的な 表現を含む事をお許しいただきたい。 1.研究開始前夜 歯周組織は,歯槽骨とセメント質に歯根膜(歯周 靭帯)線維が入り込んで,それを歯肉がカバーする という構造になっている(図1)。破壊された歯周組 織が再生するには,吸収した歯槽骨が再生するとと もに,歯の表面にはセメント質が再生し,そこに歯 根膜線維が両方の組織に入り込むという状況ができ ることが必要である。このように歯周組織は,硬組 織と軟組織がバランスよく配列しないといけないと いう,とてつもなく複雑な組織なのである。我々が 日常行うスケーリング・ルートプレーニング,フ ラップ手術のあとに生じる治癒は,上皮が歯の表面 に入り込んで付着する(長い上皮付着)のがほとんど であることが組織学的に明らかにされている(図 2)。臨床的には歯周ポケットが浅くなるので,そ れでもいいという考えも成り立つが,これは組織の 修復であり再生とは言いにくい。 1980年代に Lindhe のグループは,失われた歯周 組織が上皮付着ではなく歯槽骨,セメント質,歯根 膜の付着となるような組織再生をうまくいくように するには歯根膜由来の細胞が必要である事を発表 し,その実現のために歯周外科の際に他の組織の入 り込みを防ぐ膜を応用する事を提唱した1) 。これが かの有名な GTR(Guided tissue regeneration,組織 再 生 誘 導 法)で あ る(図3)。ま た1990年 代 後 半 に Hammastrom のグループは,歯の発生段階で歯周 組織が作られるときに出てくるエナメルマトリック スタンパク(EMD)を歯周外科の際 に 応 用 す る 事 で,歯周組織の再生が期待できる事を発表した。こ

歯周組織の再生を目指した間葉系

幹細胞の研究

Research on mesenchymal stem cells:Towards a novel therapy for periodontal regeneration

中川 種昭 慶應義塾大学医学部歯科・口腔外科学教室 教授 略歴 中川種昭:1985年東京歯科大学卒業,1989年同大学大学院修了(歯周療法 学),1990年歯周療法学講座助手,1996年同講座講師,1997年ワシントン大学訪 問講師,2002年より慶應義塾大学教授(歯科・口腔外科学教室)。研究テーマ:臨 床細菌学,再生医学 趣味:スポーツ観戦 森川 暁:2003年明海大学歯学部歯学科卒業後,4月より慶應義塾大学医学部歯 科・口腔外科学教室入局,2009年3月慶應義塾大学大学院医学研究科博士課程修 了後,歯科・口腔外科学教室助教。研究テーマ:幹細胞医学(間葉系幹細胞と組 織再生,炎症,免疫,がん) 趣味:テニス Taneaki Nakagawa 森川 Satoru Morikawa キーワード:歯周組織再生,間葉系幹細胞,予期的分離 (2012年3月2日受付,2012年6月12日受理,歯科学報 112:624∼630,2012.) 624 ― 28 ―

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れが現在歯周組織再生療法として臨床でもっとも多 く使用されているエムドゲインである(図4)2) 。こ れは,幼弱ブタの歯胚から抽出してくる物質で,エ ナメルマトリックスタンパクだけでなく,いくつか の成長因子も含んでいる事が報告されており,正確 な作用機序はまだ明らかにされ尽くしたとはいえな い。どちらも,状況が整えば歯周組織の再生は生じ るのであるが,組織を直す細胞が歯根膜部から移動 してくるのを待たないといけないことからその再生 量には限界がある。 図1:歯周組織の断面図:セメント質と歯槽骨の間に歯根膜が介在して一定の厚みを保ってい る。その上に歯肉が覆っているという複雑な組織のため,再生は容易ではない。 図2:長い上皮付着:SRP や歯周外科のあとの治癒は,上皮が歯根面に長く 入り込む状態になりやすいと考えられている。 歯科学報 Vol.112,No.5(2012) 625 ― 29 ―

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1990年代後半 か ら2000年 代 か け て Vacanti の グ ループは組織工学(ティシューエンジニアリング・ Tissue engineering)という概念を提唱し,組織の 再生や再構築には細胞・足場・成長因子の存在が重 要である事を述べている(図5)3) 。それぞれの要素 に対しての研究は歯周病領域でも始まっており, 我々はゼロからのスタートとして,まず細胞と足場 に注目した。 注目するのはいいのだが,研究というのは人材, 施設,技術,お金が必要だと言う大変厳しい現実に 直面する事になった。まず人材を得るために大学院 研究科の設置に向けて努力をし,当時の医学部長北 島政樹教授のご高配をあおぎ異動後約3年で共著者 の森川を含む大学院生一期生を迎える事ができた。 また,幸運にも慶應義塾大学医学部は基礎と臨床の 垣根がとても低く,生理学の岡野栄之教授に相談し たところ,大変有り難い事に共同研究ということ で,施設借用と研究費用に加え,研究ノウハウにつ いても援助してくださることになった。そこで“組 織再生を成功に導くための幹細胞”をテーマに研究 を開始した。 2.幹細胞 1)間葉系幹細胞 提唱された組織工学という考えにおける細胞因子 の中で,成体に存在している組織幹細胞(体性幹細 胞)は,損傷を受けた組織を修復・再生する際にと ても重要で,再生医療への応用ができる細胞として 注目を集め,盛んに研究されている。我々のター ゲットである骨髄という組織に注目すると,血液を つくるための造血系幹細胞(HSCs)と,それらを支 持すると考えられている間葉系幹細胞(MSCs)に分 図3:GTR による再生治療:遮断膜をおくことで,上皮の侵入を防ぎ,歯根膜由来の細胞を欠損組織に誘導する事で歯周組 織の再生を目指す治療法である。 中川,他:歯周組織再生のための間葉系幹細胞の研究 626 ― 30 ―

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ける事ができる(図6)。幹細胞研究やその臨床応用 において,より先駆け的な役割を果たしているのが 造血幹細胞である。実際にその細胞治療が実現して いる例は白血病患者に対する骨髄移植で,移植骨髄 にわずかに含まれる造血幹細胞が患者の体内に生着 し,ほぼ一生にわたって造血能の維持を可能にす る。このことはまさに造血組織の再生であり,現在 確立されている組織幹細胞を用いた唯一の再生医療 である。一方,間葉系幹細胞(MSCs)は,先に述べ たように骨髄中に存在する細胞で,増殖能力に優 れ,間葉系組織への多様な分化能を持つ事から臓器 変性,退行性疾患に対する細胞治療を実現するため の有力な細胞として期待を集めている。骨髄細胞 は,すでに骨髄移植に使用されていることや,胚性 幹細胞(ES 細胞,ernbryonic stem cell)のように胎 児の胚から取ってくるといった倫理的な問題が生じ ない点,また自己細胞を用いることで免疫学的問題 を回避できることから臨床応用に適している。 しかし,細胞をその特徴によって分離精製できる 機械(フローサイトメーターと呼ばれる)を用いた細 図4:EMD による再生治療:発生期の歯周組織形成に似た状況を誘導する事で歯周組織の再生を目指す治療法である。 図5:組織工学の概念:Vacanti らは,組織再生には,細 胞,足場,成長因子の存在が重要である事を述べて いる。 歯科学報 Vol.112,No.5(2012) 627 ― 31 ―

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胞の分析や分離方法が確立されている造血系幹細胞 に比べ,間葉系幹細胞についてはその性状はほとん ど明らかにされていない。そこで,我々は組織再生 に重要な骨髄間葉系幹細胞を知るためにこの細胞を 同定・分離して詳しく調べることにした。 2)マウス骨髄間葉系幹細胞の分離 間葉系幹細胞は,骨髄から赤血球を取り除いた骨 髄単核球細胞を数日間培養し,数回継代した後,選 図6 図7 中川,他:歯周組織再生のための間葉系幹細胞の研究 628 ― 32 ―

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択的に残った接着細胞として得られる(図7)。 そして現在,この細胞は「長期にわたり接着培養 系で増殖し,骨・軟骨・脂肪を含む間葉系組織への 分化能力をもつ細胞」と定義されている。従来から 間葉系幹細胞を得るための方法として,接着培養分 離法,すなわち“培地にくっついた細胞すべて”を 分離して幹細胞として用いる方法が取られてきた。 その理由は,比較的簡便な操作で細胞を得られるこ とにある。しかしこの方法は,得られる細胞が培養 によって性質変化を起こしたり,間葉系幹細胞以外 の接着細胞が混入したりする可能性があり,最終的 に得られるデータにばらつきが生じる問題を抱えて いる。さらに,現状では“この細胞は間葉系幹細胞 だ!”と定義する細胞表面の分子がまだ見つかって いない。そこで,培養による問題を避けるため,培 養しないで骨髄細胞中の間葉系幹細胞をそのまま選 択的に分離する「予期的同定・分離法」を用いるこ とが重要と考えた(図7)。この方法はフローサイト メーターという細胞分離装置を用いて,間葉系幹細 胞に特徴的な細胞表面分子のスクリーニングを行 い,培養を介することなく必要な細胞を分離できる ため,培養による性質変化や間葉系幹細胞以外の接 着能をもった細胞の混入を防げるほか,短時間で生 体内から直接間葉系幹細胞を分離することができ る。 このようにして,細胞表面に出ている分子マー カーを 約300種 類 も 調 べ て み た と こ ろ,PDGFRα (血小板由来成長因子受容体)と Sca‐1という分子 マーカーを細胞表面に発現していて,かつ,造血系 由 来 細 胞 に 見 ら れ る CD45と TER119と い う 分 子 マーカーが発現していない,すなわち PDGFRα+ Sca1+ CD45− TER119− 細胞が,単一細胞でこ れ ま での間葉系幹細胞の定義(=培地に付着,増殖し, 骨・軟骨・脂肪への分化能を有する)を満たすこと が明らかになった。このマーカーを使用すると,従 来の幹細胞分離が骨髄の細胞26万個から1個の確率 で得ていたものが,22個に1個という高い確率にな るのである。これは従来の幹細胞分離方法に比べ約 12万倍に濃縮できる事になり,今後の再生治療に有 望である可能性が示された4) 。 それを証明するために行った分化の実験では,幹 細胞の定義にある骨,軟骨,脂肪という細胞群に分 化する能力があるだけでなく,さらに末梢神経や筋 肉にも分化する力があることから,神経堤(外胚 葉,中胚葉,内胚葉のほかに第4の胚葉と呼ばれる 外胚葉性間葉という組織が作られるところで,歯槽 骨,セメント質,歯根膜,象牙質を作る細胞は外胚 葉性間葉由来と考えられている)とよばれる組織に 由来する細胞が含まれている事が 明 ら か に な っ た5) 。このことは,この間葉系幹細胞が,歯周組織 の再生にも活用できる可能性を示している。 この細胞が優秀である事の証として,分離してき た PDGFRα+ Sca1+ CD45− TER119− 細胞を,骨髄を 破壊する量の放射線を照射したマウスに造血幹細胞 と一緒に移植すると,これまで行われてきた従来の 間葉系幹細胞では不可能であった生体内への生着現 象が認められた。すなわち再生医療を行う上で,損 傷部位への局所投与という戦略の他に,骨異形成症 などの全身性疾患に対する幹細胞全身投与も可能な ポテンシャルを有していることが実験的に証明され たのである。 3)ヒト骨髄間葉系幹細胞分離の試み 間葉系幹細胞の研究はマウスよりもヒトの方がや や先行している。その理由は,ヒト骨髄はマウスと 比較し,in vitro(生体外の実験系)で増殖しやすく接 着培養分離が容易だからである。フローサイトメー ターを用いたヒト間葉系幹細胞の分離法,およびヒ ト間葉系幹細胞の表面抗原に関する報告は多数あ る。それらの報告の中でも,特に有用な細胞表面 マーカ ー と し て STRO‐1や CD105,CD146と 呼 ば れる分子が知られている。 しかしながらこれらのマーカーは単独で使用でき るほどの特異的なものではなく,このマーカーが陽 性の細胞は,幹細胞の特徴の1つである増殖能も決 して高くはない。以上のような背景を踏まえ,生理 学教室との共同研究として,我々は6年前からヒト 間葉系幹細胞特異的マーカーの探索に挑戦し始め, ついにその候補となるマーカーを同定し,現在論文 投稿中である。近い将来,この特異的マーカーを指 標に分離した間葉系幹細胞を破壊された歯周組織へ 応用することで,これまでにない画期的な歯周組織 再生療法が実現できることを夢みている。そのため には新たに分離可能となったこのヒト間葉系幹細胞 の性状解析(増殖能や分化能,生体内でのふるまい 歯科学報 Vol.112,No.5(2012) 629 ― 33 ―

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など)をしっかり行い,安全に応用できるように準 備していくつもりである。 おわりに 我々は,この幹細胞の研究を,失われた歯周組織 の再生に実用できる段階まで進めたいと考えてい る。セメント質,歯根膜,歯槽骨へバランスよく分 化,増殖してくれるためには,こういった細胞をど のような環境で使用したら良いのかなどを解決して 行く必要がある。本稿では触れる事ができなかった が,今回得られた間葉系幹細胞から人工多能性細胞 (induced pluripotent stem cell:iPS 細胞と呼ばれ

ている)を効率よく得る研究6) や,足場としての光重 合型ゼラチンの開発に関する研究7) ,成長因子とし て 塩 基 性 線 維 芽 細 胞 増 殖 因 子(fibroblast growth factor,b‐FGF,FGF‐2)の臨床研究8) ,口腔外科分 野では同じ幹細胞でも口腔がんに特徴的ながん幹細 胞に作用し,がん治療に期待できる標的治療薬の研 究なども進めている。また機会をいただく事があれ ばお伝えしたい。 謝 辞 研究遂行にあたり,多大なるご指導とご協力をいただいた 慶應義塾大学医学部生理学教室,岡野栄之教授ならびに松崎 有未准教授に深謝申し上げます。 文 献

1)Gottlow J, Nyman S, Karring T, Lindhe J. New attach-ment formation as the result of controlled tissue regen-eration. J Clin Periodontol, 11:494−503,1984. 2)Hammarström L. Enamel matrix, cementum

develop-ment and regeneration. J Clin Periodontol, 24:658− 668,1997.

3)Langer R, Vacanti JP. Tissue engineering. Science, 14:920−926,1993.

4)Morikawa S, Mabuchi Y, Kubota Y, Nagai Y, Niibe K, Hiratsu E, Suzuki S, Miyauchi-Hara C, Nagoshi N, Sunabori T, Shimmura S, Miyawaki A, Nakagawa T, Suda T, Okano H, Matsuzaki Y. Prospective identifica-tion, isolaidentifica-tion, and systemic transplantation of multipo-tent mesenchymal stem cells in murine bone marrow. J Exp Med, 206:2483−2496,2009.

5)Morikawa S, Mabuchi Y, Niibe K, Suzuki S, Nagoshi N, Sunabori T, Shimmura S, Nagai Y, Nakagawa T, Okano H, Matsuzaki Y. Development of mesenchymal stem cells partially originate from the neural crest. Biochem Bio-phys Res Commun, 379:1114−1119,2009.

6)Niibe K, Kawamura Y, Araki D, Morikawa S, Miura K, Suzuki S, Shimmura S, Sunabori T, Mabuchi Y, Nagai Y, Nakagawa T, Okano H, Matsuzaki Y. Purified mesenchy-mal stem cells are an efficient source for iPS cell induc-tion. PLoS One, 6:e17610,2011.

7)Fukaya C, Nakayama Y, Murayama Y, Omata S, Ishikawa A, Hosaka Y, Nakagawa T. Improvement of hy-drogelation abilities and handling of photocurable gelatin-based crosslinking materials. J Biomed Mater Res B Appl Biomater, 91:329−336,2009.

8)Kitamura M, Akamatsu M, Machigashira M, Hara Y, Sakagami R, Hirofuji T, Hamachi T, Maeda K, Yokota M, Kido J, Nagata T, Kurihara H, Takashiba S, Sibutani T, Fukuda M, Noguchi T, Yamazaki K, Yoshie H, Ioroi K, Arai T, Nakagawa T, Ito K, Oda S, Izumi Y, Ogata Y, Yamada S, Shimauchi H, Kunimatsu K, Kawanami M, Fu-jii T, Furuichi Y, Furuuchi T, Sasano T, Imai E, Omae M, Yamada S, Watanuki M, Murakami S. FGF-2 stimulates periodontal regeneration : results of a multi-center ran-domized clinical trial. J Dent Res, 90:35−40,2011. 別刷請求先:〒160‐8582 東京都新宿区信濃町35

慶應義塾大学医学部歯科・口腔外科学教室 中川種昭 中川,他:歯周組織再生のための間葉系幹細胞の研究

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参照

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