◆8種類の供試菌を下図のように，マンニット

(1)

微生物学実習 3日目

[計p.13] 3日目

^HT

供試菌の同定細菌汚染検査

[実験IIIA]

生化学的性状試験1 ブドウ球菌の判定 [実験IIIB]

生化学的性状試験2 大腸菌の判定

[実験IIA]

フードスタンプの観察 [実験IIC]

フードスタンプからの画線分離培養

[計p.4] ブドウ球菌の同定

供試菌A 供試菌B

供試菌C 供試菌D

供試菌E 供試菌F

供試菌G 供試菌H それぞれ2枚ずつ

◆8種類の供試菌を下図のように，マンニット

食塩寒天培地に画線する．

[実p.17] マンニット食塩寒天培地の特徴

１．食塩濃度(7.5％)が高いため、ブドウ球菌は強い食塩耐性によって他の菌群と明らかな生育の差を示す。

ＳａＳａ

食塩耐性汗が乾い

ても平気

ブドウ球菌以外にも食塩耐性の細菌種がある

[実p.17] マンニット食塩寒天培地の特徴

２．本培地はpH7.2〜7.6に調整されており、フェノールレッドにより赤色となる。培地が酸性になるとフェノールレッドは黄色を呈する。

３．マンニットは、天然に広く分布する糖アルコール。

４．マンニット分解性菌のコロニー周辺は、マンニットの分解で生じた酸によりフェノールレッドが黄変する。

[実p.17] マンニット発酵

黄色ブドウ球菌はマンニット分解酵素を持ち、表皮ブドウ球菌はマンニット分解酵素を持たない。

ＳａＳａ

有

Ｓe Ｓe

無

黄色ブドウ球菌表皮ブドウ球菌

[実p.17] マンニット寒天培地の色の変化

S.epidermidis S.aureus

培地にフェノールレッド（pH指示薬）が入っているので，酸性で黄色，中性〜アルカリ性で赤色になる．

マンニット分解能無し! 培地の色は変化無しか、より鮮やかな赤色になる。

マンニット分解能有り! 培地の色は黄色になる。

[実p.17] マンニット寒天培地の色の変化

糖代謝などによって生じる有機酸の酸性度よりも、ペプチドやアミノ酸の代謝により生じる塩基性物質の塩基性が強くなると、培地は塩基性となる。

糖有機酸

分解

アミノ酸塩基性物質

(アンモニアなど)

(2)

[実p.17] マンニット寒天培地の結果判定

コロニーの生育が観察された場合，耐塩性を保持する細菌種である．マンニット分解性細菌はコロニー周辺が黄色になるが，マンニット非分解性ブドウ球菌はコロニー周辺の色調に変化がない．

A 黄色ブドウ球菌：マンニット分解性ありのため．培地の色調変化が観察される．

B 表皮ブドウ球菌：マンニット非分解性のため．培地の色調変化が観察されない．

C 大腸菌：耐塩性がないため，本培地では生育できない．

[計p.6] ブドウ球菌の判定

◆画線培養の結果をスケッチする[Rep.

18]．

◆画線培養の結果から，供試菌が「マンニット」分解性か非分解性か判定する [Rep. 18]．

◆画線培養の結果から，供試菌が「耐塩性」であるか判定する[Rep. 18]．

[Rep.18] ブドウ球菌の判定

培養結果を色鉛筆を使って図示する．またコロニーの分離状態・大きさ・形・色・培地の色調などそれぞれの特徴を述べなさい．

[実p.13] 細菌の分離培養・純培養の観察培地に生じたコロニーを観察する。

ルーペで拡大

[Rep.18] 表の記入例

生育（耐塩性）

（あり・なし）マンニット分解性

（あり・なし）

特記事項 (実験の成功・失敗，

その他) 供試菌 A ありあり成功（黄色ブドウ球菌又は

枯草菌の可能性有り）

供試菌 B ありなし成功（表皮ブドウ球菌

の可能性有り）

供試菌 C なしなしその他（成功か失敗か

わからない）

供試菌 D ありあり/なし失敗（複数のコロニーが混在していた）

[Rep.18] 菌の混在

数種類の菌が混ざっている可能性があるので注意すること！・・・Rep.18 & 19

観察するときの注意点

コロニーの色・形・大きさ・周辺培地の色など．

[計p.4] 大腸菌の同定

◆8種類の供試菌を下図のように，XM-G寒天

培地に画線する．

[実p.18] XM-G寒天培地の特徴

食品や環境材料中の大腸菌および大腸菌群の検出に用いられる．

フードスタンプの大腸菌・大腸菌群判定用培地と同じ培地

(3)

[実p.16] 大腸菌と大腸菌群大腸菌群は衛生上の用語で、大腸菌群の存在は製造工程中の加熱不足等や環境衛生上の汚染指標となる。Escherichia属，Klebsiella属，

Citrobacter属，Enterobacter属，Proteus属などの細菌がふくまれる．

大腸菌は分類学上の細菌種である「Escherichia coli」を示す。大腸菌の存在は食品や飲料水の糞便性汚染の指標として重要である。

[実p.16] 大腸菌と大腸菌群

大腸菌

大腸菌群食品・調理器具

重要

やや重要

糞便汚染を示す

環境等からの汚染を示す

[実p.19] XM-G寒天培地の特徴

大腸菌・大腸菌群の鑑定用培地

β-グルクロニダーゼ X-GLUC

（無色）

大腸菌

培地成分

分解産物

（青色）

青色〜青緑色

[実p.19] XM-G寒天培地の特徴

大腸菌・大腸菌群の鑑定用培地

β-ガラクトシダーゼ

MAGENTA-GAL

（無色）

大腸菌群

培地成分

分解産物

（赤色）

ピンク色〜赤紫色

グルコース

ガラクトース

[実p.19] βーガラクトシダーゼ β-ガラクトシダーゼは、乳糖を加水分解し、グルコースとガラクトースを生成する。

(ラクトース) 乳糖

β-ガラクトシダーゼ

β-ガラクトシダーゼは、菌種同定の指標に用いられる。

重要

[実p.19] βーガラクトシダーゼ

大腸菌

大腸菌群

βーガラクトシダーゼ βーグルクロニダーゼ

βーガラクトシダーゼ

青緑〜濃紺色コロニー

コロニー赤色

大腸菌はβ-ガラクトシダーゼとβーグルクロニダーゼを持つ。

注：酵素の生産量によって発色に違いが出る

[Rep.14] XM-G培地による供試菌の判定

細菌種 β-グルクロニ

ターゼ活性 β-ガラクトシ

ダーゼ活性分類大腸菌ありあり＊大腸菌

プロテウス菌なしあり大腸菌群

サルモネラ菌なしなしその他

緑膿菌なしなしその他

＊大腸菌の菌株によって違いがある

[計p.6] 大腸菌の判定

◆画線培養の結果をスケッチする（Rep.

19）．

◆画線培養の結果から，供試菌が「βーグルクロニダーゼ」活性，「βーガラクトシダーゼ」活性の有無を判定する（Rep.

19）．

(4)

[Rep.19] 大腸菌・大腸菌群の判定

培養結果を色鉛筆を使って図示する．またコロニーの分離状態・大きさ・形・色・培地の色調などそれぞれの特徴を述べなさい．

[Rep.19] 表の記入例

(あり・なし) 生育

β-グルクロニダーゼ活性

β-ガラクトシダーゼ活性

特記事項 (実験の成功・失敗，

その他)

供試菌 A ありありなし成功（大腸菌の可能性有り）

供試菌 B ありなしあり成功（大腸菌群の可能性有り）

供試菌 C なしなしなしその他（成功か失敗かわからない）

供試菌 D ありなしなし失敗（複数のコロニーが混在していた）

[計p.7] 細菌汚染検査・フードスタンプ 2日目までの確認：

食品や調理器具などの検査材料にフードスタンプを軽く押しつけた．ふらん器に入れて，一定時間培養した．

RK

[実p.12-16] フードスタンプ検査フードスタンプに生じたコロニーの数と培地の色の変化から、各種食中毒菌による汚染の有無を検討する(判定基準はp.16参照)。

食肉のトレイ１．サンプリング

２．培養３．判定

○○菌のコロニー17個

□□菌のコロニー９個その他のコロニー４個

食中毒発生の恐れ有り！

[実p.16] フードスタンプ検査と判定

サルモネラ用のフードスタンプ

黒色のコロニー，培地の色が紫色から黄色に変化：サルモネラ菌の可能性大．

その他の色のコロニー：サルモネラ菌以外のその他の菌に分類される．

サルモネラ菌

その他の菌

[実p. 16] フードスタンプ検査と判定

サルモネラ用のフードスタンプ

サルモネラ菌は硫化水素を産生する細菌であるため，培地中のクエン酸鉄アンモニウムと反応することによりコロニーが黒くなる．他にもシトロバクターなど硫化水素をする細菌があるので鑑別試験の併用が必要．

→来週，生化学的性状試験で鑑別を行う．

硫黄を含む

有機物

硫化水素

＋

クエン酸鉄アンモニウム

硫化鉄

代謝サルモネラ菌培地成分

培地成分

[実p. 16] フードスタンプ検査と判定

セレウス用のフードスタンプセレウス菌

培地の色赤色〜鮮やかな赤色

コロニー扁平状で、白みがかった赤色（ロウソクの色に似る)

コロニー周辺白濁する(卵黄反応陽性) その他（枯草菌など）

培地の色黄色〜赤色

コロニー多様（大小ありで、白〜黄色・オレンジ色）

コロニー周辺白濁する場合としない場合がある

[実p. 16] フードスタンプ検査と判定

セレウス用のフードスタンプ

レシチナーゼ卵黄レシチン

（可溶性=透明）

セレウス菌

培地成分

分解産物

（不溶性=白濁）

マンニット培地成分代謝しない

(培地が酸性にならないので、フェノールレッドは赤色を呈す)

卵黄反応 (レシチナーゼ反応)

(5)

[実p.16] フードスタンプ検査と判定

赤色のコロニー：大腸菌群青色のコロニー：大腸菌

その他の色のコロニー：大腸菌・大腸菌群ではないその他の菌に分類される．

検査目的以外の細菌も生じているので，注意事項をよく読み，レポートを書くこと[Rep.

15-18]．

大腸菌・大腸菌群用のフードスタンプ

[Rep.15] フードスタンプ検査

サンプル写真 XM-G寒天（大腸菌・大腸菌群用）

大腸菌のコロニー数：...

大腸菌群のコロニー数：...

その他の菌のコロニー数：...

検査対象物（） XM-G寒天（大腸菌・大腸菌群用）

大腸菌のコロニー数：...

大腸菌群のコロニー数：...

その他の菌のコロニー数：...

コロニー・培地の色に注意してスケッチする

サンプル写真と各自のサンプルをよく観察し比較すること

まな板記入例

[Rep.15-17] フードスタンプ検査

レポートを書くときの注意事項

自分のフードスタンプにコロニーが検出されなかった場合，同じ班の人のフードスタンプを借りてスケッチしてください．スケッチしたところに，○○さんのを借りたと書いておいてください．考察は，自分のフードスタンプの考察と

借りてスケッチをしたフードスタンプについても考察を行ってください．

[Rep.17] フードスタンプ検査

XM-G寒天 CERE寒天 MLCB寒天

大腸菌大腸菌群その他セレウス菌その他サルモネラ菌その他

自分の結果

( ○・Ｘ )

^○ ^○ ^○ ^○ ^○

班の検出数検査数：

件 0 5 8 4 4 0 8

クラス検出数検査数：

件

次回予定 [実p.20] 生化学的性状試験 3

食中毒の代表的な原因菌であるサルモネラ属細菌のTSI寒天培地による生化学的性状試験による確認試験．

目的

フードスタンプとは別の鑑別培地(TSI寒天)を用いた試験法を学びます。

[計p.7] TSI試験の検体純培養

◆MLCB寒天で確認した「サルモネラ属細菌」のコロニーを，画線分離培養法で普通寒天平板培地1枚に植菌する．

＊培地の底面に，班名・試験者名・『TSI検体』と書くこと．

--- 配布物：

【実験IIIB】普通寒天平板培地：各自「1」枚

[計p.7] TSI試験検体の画線分離培養

＊サルモネラ用フードスタンプに何も生えなかった場合は，大腸菌＆大腸菌群用フードスタンプに生じた大腸菌か大腸菌群のコロニーを植菌する．

フードスタンプ

サルモネラ寒天普通寒天培地画線分離培養：分離状態の良い，単一のコロニーを選んで画線する．

[計p.7] TSI試験の検体純培養

サルモネラ用フードスタンプ

大腸菌・大腸菌群用フードスタンプ

１．サルモネラ菌(黒色コロニー) ２．それ以外の菌

優先順位

３．大腸菌(青色コロニー) ４．大腸菌群(赤色コロニー) ５．それ以外の菌

(6)

[計p.7] セレウス菌の画線分離培養

◆セレウス寒天で確認した「セレウス菌」のコロニーを，画線分離培養法で普通寒天平板培地1枚に植菌する．

＊セレウス菌用フードスタンプに何も生えなかった場合は，誰かのフードスタンプを借りて植菌する．

＊培地の底面に，班名・試験者名・『セレウス

検体』と書くこと．

[計p.7] セレウス菌の画線分離培養

フードスタンプセレウス寒天

普通寒天培地画線分離培養：分離状態の良い，単一のコロニーを選んで画線する．

[計p.7] コロニーの選び方２つ以上のコロニーを釣菌すると、純培養は失敗です。

分離状態が良く、確実に１つだけ釣菌できるコロニーを選ぶ。

[計p.7] 純培養の秘技Ｑ．コロニーが密集している場合の釣菌は？

Ａ．白金線を用いて、なるべく分離状態の良いコロニーを慎重に釣菌します。

白金線で慎重に釣菌する

白金線先端の細菌を新しい培地の表面につける

細菌をつけた部分から白金耳で画線培養する。

[計p.7] 画線分離培養の方法

1. 培地の 1/4に画線する

2．次の1/4 に画線する

3. 次の1/4に

画線する 4. 最後の1/4

に画線する

釣菌は１回だけで、続けて画線する。

[計p.7] 画線分離培養について

悪い例良い例

１枚平板法の場合、画線する距離をできるだけ長くし、

細菌が確実に分離するよう心がける。

重要

成功の秘訣

[計p.7] 純培養・画線分離培養の評価

1.   目的とする細菌が増殖しており、その他の微生物の混入が認められない。

2.   コロニーが分離している部分がある。

3.   ２つのサンプルが上記の条件を満たしている。

評価のポイント

2種類のフードスタンプのサンプル

◆8種類の供試菌を下図のように，マンニット

微生物学実習 3日目

[計p.13] 3日目

供試菌の同定 細菌汚染検査

[計p.4] ブドウ球菌の同定

◆8種類の供試菌を下図のように，マンニット

[実p.17] マンニット食塩寒天培地の特徴

食塩耐性 汗が乾い

ても平気

ブドウ球菌以外にも食塩耐性の細菌種がある

[実p.17] マンニット食塩寒天培地の特徴

[実p.17] マンニット発酵

有

無

[実p.17] マンニット寒天培地の色の変化

[実p.17] マンニット寒天培地の色の変化

糖 有機酸

分解

アミノ酸 塩基性物質

[実p.17] マンニット寒天培地の結果判定

[計p.6] ブドウ球菌の判定

◆画線培養の結果をスケッチする[Rep.

18]．

◆画線培養の結果から，供試菌が「マン ニット」分解性か非分解性か判定する [Rep. 18]．

◆画線培養の結果から，供試菌が「耐塩 性」であるか判定する[Rep. 18]．

[Rep.18] ブドウ球菌の判定

[実p.13] 細菌の分離培養・純培養の観察 培地に生じたコロニーを観察する。

[Rep.18] 表の記入例

[Rep.18] 菌の混在

観察するときの注意点

[計p.4] 大腸菌の同定

◆8種類の供試菌を下図のように，XM-G寒天

[実p.18] XM-G寒天培地の特徴

[実p.16] 大腸菌と大腸菌群 大腸菌群は衛生上の用語で、大腸菌群の存在は 製造工程中の加熱不足等や環境衛生上の汚染指 標となる。Escherichia属，Klebsiella属，

Citrobacter属，Enterobacter属，Proteus属 などの細菌がふくまれる．

大腸菌は分類学上の細菌種である「Escherichia coli」を示す。大腸菌の存在は食品や飲料水の糞 便性汚染の指標として重要である。

[実p.16] 大腸菌と大腸菌群

重要

[実p.19] XM-G寒天培地の特徴

β-グルクロニダーゼ X-GLUC

（無色）

分解産物

（青色）

[実p.19] XM-G寒天培地の特徴

β-ガラクトシダーゼ

（無色）

分解産物

（赤色）

[実p.19] βーガラクトシダーゼ β-ガラクトシダーゼは、乳糖を加水分解し、グ ルコースとガラクトースを生成する。

β-ガラクトシダーゼは、菌種同定の指標に用い られる。

[実p.19] βーガラクトシダーゼ

大腸菌はβ-ガラクトシダーゼとβーグルクロニ ダーゼを持つ。

[Rep.14] XM-G培地による供試菌の判定

[計p.6] 大腸菌の判定

◆画線培養の結果をスケッチする（Rep.

19）．

◆画線培養の結果から，供試菌が「βーグ ルクロニダーゼ」活性，「βーガラクト シダーゼ」活性の有無を判定する（Rep.

19）．

[Rep.19] 大腸菌・大腸菌群の判定

[Rep.19] 表の記入例

[計p.7] 細菌汚染検査・フードスタンプ 2日目までの確認：

食品や調理器具などの検査材料にフードスタン プを軽く押しつけた．ふらん器に入れて，一定 時間培養した．

[実p.12-16] フードスタンプ検査 フードスタンプに生じたコロニーの数と培地の 色の変化から、各種食中毒菌による汚染の有無 を検討する(判定基準はp.16参照)。

[実p.16] フードスタンプ検査と判定

[実p. 16] フードスタンプ検査と判定

硫化水素

硫化鉄

[実p. 16] フードスタンプ検査と判定

[実p. 16] フードスタンプ検査と判定

レシチナーゼ 卵黄レシチン

（可溶性=透明）

分解産物

（不溶性=白濁）

[実p.16] フードスタンプ検査と判定

検査目的以外の細菌も生じているので，注意事 項をよく読み，レポートを書くこと[Rep.

15-18]．

[Rep.15] フードスタンプ検査

[Rep.15-17] フードスタンプ検査

[Rep.17] フードスタンプ検査

次回予定 [実p.20] 生化学的性状試験 3

供試菌の同定細菌汚染検査

食塩耐性汗が乾い

糖有機酸

アミノ酸塩基性物質

◆画線培養の結果から，供試菌が「マンニット」分解性か非分解性か判定する [Rep. 18]．

◆画線培養の結果から，供試菌が「耐塩性」であるか判定する[Rep. 18]．

[実p.13] 細菌の分離培養・純培養の観察培地に生じたコロニーを観察する。

[実p.16] 大腸菌と大腸菌群大腸菌群は衛生上の用語で、大腸菌群の存在は製造工程中の加熱不足等や環境衛生上の汚染指標となる。Escherichia属，Klebsiella属，

Citrobacter属，Enterobacter属，Proteus属などの細菌がふくまれる．

大腸菌は分類学上の細菌種である「Escherichia coli」を示す。大腸菌の存在は食品や飲料水の糞便性汚染の指標として重要である。

[実p.19] βーガラクトシダーゼ β-ガラクトシダーゼは、乳糖を加水分解し、グルコースとガラクトースを生成する。

β-ガラクトシダーゼは、菌種同定の指標に用いられる。

大腸菌はβ-ガラクトシダーゼとβーグルクロニダーゼを持つ。

◆画線培養の結果から，供試菌が「βーグルクロニダーゼ」活性，「βーガラクトシダーゼ」活性の有無を判定する（Rep.

食品や調理器具などの検査材料にフードスタンプを軽く押しつけた．ふらん器に入れて，一定時間培養した．

[実p.12-16] フードスタンプ検査フードスタンプに生じたコロニーの数と培地の色の変化から、各種食中毒菌による汚染の有無を検討する(判定基準はp.16参照)。

レシチナーゼ卵黄レシチン

検査目的以外の細菌も生じているので，注意事項をよく読み，レポートを書くこと[Rep.

食中毒の代表的な原因菌であるサルモネラ属細菌のTSI寒天培地による生化学的性状試験による確認試験．

フードスタンプとは別の鑑別培地(TSI寒天)を用いた試験法を学びます。

◆セレウス寒天で確認した「セレウス菌」のコロニーを，画線分離培養法で普通寒天平板培地1枚に植菌する．

＊セレウス菌用フードスタンプに何も生えなかった場合は，誰かのフードスタンプを借りて植菌する．

[計p.7] コロニーの選び方２つ以上のコロニーを釣菌すると、純培養は失敗です。

分離状態が良く、確実に１つだけ釣菌できるコロニーを選ぶ。

[計p.7] 純培養の秘技Ｑ．コロニーが密集している場合の釣菌は？

Ａ．白金線を用いて、なるべく分離状態の良いコロニーを慎重に釣菌します。

1.   目的とする細菌が増殖しており、その他の微生物の混入が認められない。

2.   コロニーが分離している部分がある。

3.   ２つのサンプルが上記の条件を満たしている。