原
著
口腔カンジダ症における Candida albicans と Candida glabrata の
混合感染の臨床的検討
A Clinical Study of Candida albicans and Candida glabrata Co-infection of Oral Candidiasis
岡田 和隆，中澤誠多朗，横山亜矢子
柏崎 晴彦，小林 國彦，山崎
裕
Kazutaka Okada, Seitaro Nakazawa, Ayako Yokoyama, Haruhiko Kashiwazaki Kunihiko Kobayashi and Yutaka Yamazaki
抄録：口腔カンジダ症の起炎菌のなかで最近，Candida glabrata の割合が増加し，ア ゾール系抗真菌薬に耐性傾向であることから注目が集まっている。そこで，北海道大学 病院高齢者歯科（以下，当科）で治療を行った口腔カンジダ症における最近のカンジダ 検出状況を，C. glabrata を中心に検索した。 2013 年 8 月〜2015 年 12 月までの期間に当科を受診し，口腔カンジダ症を疑い舌背部 からのカンジダ培養検査で陽性と認められたのは 156 例であり，カンジダの検出率を算 定した。このなかから C. albicans 単独で検出された C. alb 群と，C. albicans と C. glabrata が同時に検出された C. alb＋C. glab 群を対象とし，2 群間で背景因子との関 連，抗真菌薬に対する効果を統計学的に解析した。
症例別では C. alb 群が 84 例（54%），C. alb＋C. glab 群が 36 例（23%）に認められ， 従来から報告されてきたよりも C. albicans 以外の菌が多く認められた。また，C. glab-rata は単独としてではなく，C. albicans とともに検出される場合が多くを占めていた。 2 群間で背景因子や抗真菌薬の効果を比較したところ，C. alb＋C. glab 群は C. alb 群に 対し有床義歯の使用者が有意に多く，抗真菌薬に対し有意に抵抗性を示した。
C. albicans に C. glabrata が混合感染すると義歯に対しての関連が強まり，抗真菌薬 に対しても抵抗性を示すことが示唆された。
キーワード：口腔カンジダ症，高齢者歯科，Candida glabrata，Candida albicans， 抗真菌薬 緒 言 口腔カンジダ症は Candida albicans を原因菌と する日和見感染とされてきたが，近年では口腔カン ジダ症の病態が変化してきている1,2)。カンジダの 菌種では，C. albicans 以外のカンジダ，なかでも C. glabrata の増加が報告されている2〜4)。C. glabra-ta は単独感染ではなく，C. albicans とともに混合 感染している場合で多く検出されている4〜6)。ま た，アゾール系の抗真菌薬に対して抵抗性を示す菌 が増えているため，治療への抵抗性や再燃を繰り返 すことも報告されている6〜8)。しかし本邦において は，口腔カンジダ症における C. glabrata に焦点を 絞った臨床研究はほとんど行われていない。 そこで今回，最近，北海道大学病院高齢者歯科 （以下，当科）で治療を行った口腔カンジダ症の菌 種の検出状況，背景因子，抗真菌薬に対する治療効 果を C. glabrata を中心に検討した。 研 究 方 法 ．対 象 2013 年 8 月から 2015 年 12 月までの 2 年 5 カ月 間に，当科外来を受診した患者のうち，口腔カンジ 北海道大学大学院歯学研究科口腔健康科学講座高齢者 歯科学教室
Gerodontology, Department of Oral Health Science, Gra-duate School of Dental Medicine, Hokkaido University
単独で検出された症例（C. alb 群）と，C. albicans と C. glabrata が同時に検出された症例（C. alb＋C. glab 群）を対象とした。性別，平均年齢±標準誤 差は，C. alb 群：男性 17 例，女性 67 例，70.7± 1.2 歳，C. alb＋C. glab 群：男性 4 例，女性 32 例， 72.3±1.7 歳であった。なお，入院患者，頭頸部に 放射線療法の既往のある患者，口腔癌患者は除外し た。 なお，培養検査を行うにあたっては，その結果を 研究発表に使用することを十分に説明し，全員から 同意を得た。 ．方 法 ）患者別と菌種別に分けて検出された菌の検出 率を検索した。
）C. alb 群と C. alb＋C. glab 群の 2 群間で種々 の因子（性，年齢，口腔内症状，全身疾患，常用薬 剤，義歯の有無），ならびに抗真菌薬に対する効果 に関して統計学的に解析し，p＜0.05 を有意差あり と し た（t 検 定，Fisherʼs exacttestま た は χ2検 定）。口腔内症状は自覚症状としての舌痛の有無， 味覚異常の有無，口腔乾燥の有無に関して検索し た。全身疾患は内科的疾患の有無，常用薬剤は内服 薬の服用の有無に関して検索した。なお，本研究の 対象者は後ろ向き調査と前向き調査による者が含ま れている。上記項目について，後ろ向き調査では対 象者の診療録の記載から検索した。また，前向き調 査では対象者への問診，口腔内診査，お薬手帳など によりデータを収集した。 ．カンジダ培養検査 デンタルミラーで舌背を 10 回擦過し，検体を舌 前方部に寄せ集めてデンタルミラーにすくい取り， それを直接クロモアガー培地（クロモアガーカンジ ダ®，関東化学，東京)9)に塗抹し，35℃，48 時間培 養 後 の 菌 種 ご と の コ ロ ニー 数（Colony Forming Units：CFU）を検索した。クロモアガー培地はカ ンジダの選択培地で，コロニーの色調と形態からカ ンジダの菌種が同定可能である。緑色，紫色，白 C. krusei である。各菌種の CFU が 10 個以上をカ ンジダ陽性とした。 カンジダの菌数は Grade を用いて Grade 0：0〜9 （CFU），Grade 1：10〜99（CFU），Grade 2：100〜 999（CFU），Grade 3：1,000（CFU）以上の 4 つに分 類した。 ．抗真菌薬の投与方法 義歯使用者には義歯粘膜面にも塗布するため，ミ コナゾールゲルを第一選択薬としたが，ワルファリ ンやトリアゾラム，アゼルニジピンなどの併用禁忌 薬を服用中の患者，多種薬剤服用患者に対しては， 代わってアムホテリシン B を投与した。ミコナ ゾールゲルは，1 日 5 g を毎食後 3 回に分割して口 腔内粘膜全体に塗布し，1 時間はそのままに保って から吐き出させた。アムホテリシン B は 1 回 1 ml を 20 倍希釈し，1 日 4 回，口腔内にできるだけ長 く保ってから吐き出させ，30 分は飲食させなかっ た。両抗真菌薬とも投与期間は 2〜4 週間とした。 ．抗真菌薬の効果判定 抗真菌薬の投与終了後に，再度カンジダ培養検査 を施行し，① Grade 0 の場合，または②菌種別菌量 の Grade が 1 段階以上減少し，実際の菌数も 1 割 以下に減少した場合をそれぞれ有効とした。C. alb ＋C. glab 群では，両方の菌種に対して効果が得ら れた場合を有効と判定した。それを基に，両群間に おける抗真菌薬に対する効果，ならびに各群におけ る Grade と抗真菌薬の効果の関連をそれぞれ統計 学的に解析した。 ．統計学的分析 両群間における比較では，関連因子の平均年齢の み t検定を用い，その他の因子や，菌数，抗真菌薬 の効果に関しては Fisherʼs exacttestまたはχ2検定 で解析した。いずれの検定も，p＜0.05 を有意差あ りとした。
結 果 ．カンジダの検出状況 ）症例別（図 1） 156 例中，単独菌種群が 104 例（67%），混合菌 種群が 52 例（33%）であった。単独菌種群 104 例 の内訳は，C. albicans：84 例（54%），C. glabrata： 11 例（7%），C. tropicalis：5 例（3%），C. parapsi-losis：3 例（2 %），C. species：1 例（1 %）で あっ た。混合菌種群 52 例の内訳は，C. albicans＋C. glabrata：36 例（23%），それ以外の組み合わせが 16 例（10%）であった。 ）菌種別（図 2） 156 例中，217 件のカンジダが検出された。内訳 は，C. albicans：135 件（62%），C. glabrata：54 件 （25 %），C. parapsilosis：12 件（6 %），C. tropica-lis：9 件（4%），C. krusei：2 件（1%），C. species： 5 件（2%）であった。
．C. alb 群と C. alb＋C. glab 群における種々の関 連因子との比較（表 1）
C. alb 群 84 例と C. alb＋C. glab 群 36 例の 2 群間 における性別，年齢，舌痛の有無，味覚異常の有 無，口腔乾燥の有無，全身疾患の有無，常用薬剤の 有無，有床義歯使用の有無を比較した。有意差が認 められたのは，有床義歯使用の有無だけであった （p＜0.001）。C. alb 群は 63%の有床義歯使用率で あったが，C. alb＋C. glab 群は 36 人中 1 人を除い てはすべて有床義歯使用者であった（97%）。 ．C. alb 群と C. alb＋C. glab 群におけるカンジダ
の菌数の比較
C. alb 群は Grade 1 が 42 例（50%），Grade 2 が 35 例（42%），Grade 3 が 7 例（8%）であったのに 対し，C. alb＋C. glab 群はそれぞれ，7 例（19%）， 15 例（42%），14 例（39%）と C. alb＋C. glab 群の ほうが有意に菌数が多く認められた（p＜0.001）。 ．C. alb 群と C. alb＋C. glab 群における抗真菌薬
の効果の比較（表 2，3）
治療として抗真菌薬を投与し，その治療効果の判 定が可能であったのは，C. alb 群は 43 例，C. alb＋ C. glab 群は 26 例であった。有効率は C. alb 群で
79%（34/43），C. alb＋C. glab 群で 46%（12/26） と，C. alb＋C. glab 群は C. alb 群に比べ有意に抗真 菌薬に対する効果が低下していた（p＜0.01）（表 2）。C. alb＋C. glab 群で抗真菌薬に対し無効であっ た 14 例の内訳は C. albicans のみが 1 例，C. glab-rata のみが 7 例，C. albicans と C. glabglab-rata ともに が 6 例であった。C. alb＋C. glab 群のほうが C. alb 群よりもカンジダの菌数が有意に多かったため，そ の影響の有無を確認した。結果は両群ともに，カン ジダの菌数（Grade）と抗真菌薬に対する効果との 間に関連は認めなかった（表 3）。 図 カンジダの症例別検出率 単独菌種群が 67%，混合菌種群が 33%であった。混合 菌種群のなかの約 7 割は，C. albicans＋C. glabrata で あった。 図 カンジダの菌種別検出率 C. albicans が 62%，C. albicans 以外のカンジダが 38% であり，そのなかで一番多いのが C. glabrata であっ た。
考 察 従来，口腔カンジダ症は C. albicans による真菌 感染症とされ，口腔カンジダ症患者から検出される カンジダの 70〜80%を占めるとされてきた1,2)。し か し，近 年，C. albicans 以 外 の カ ン ジ ダ（non-albicans），そのなかでも C. glabrata の増加が多く の論文2〜4)で報告されている。C. glabrata は従来， 感染力が弱く注目されるような菌種ではなかった が，最近，頭頸部がん10)や HIV11)などの免疫抑制 状態の患者や，カンジダ性の義歯性口内炎4)におけ る重要な起炎菌として指摘されだした。また，ミコ ナゾールゲルやイトラコナゾールなどのアゾール系 表 両群における抗真菌薬の効果の比較
抗真菌薬に対して，抵抗性を示す菌が増え難治性で あることも報告されている7,8)。しかし，本邦にお いては Kamikawa ら6)が 2014 年に，鹿児島大学病 院の口腔カンジダの検出状況を 2006〜2007 年と 2012〜2013 年で比較し，アゾール系抗真菌薬に抵 抗性を示す C. glabrata が 14.1%から 32.1%に増加 したことを報告した論文のみである。カンジダの菌 種には地域差があることが報告12)されており，今 回，北海道においてもこの傾向が認められるか否か を検討するために，当科での最近のカンジダ検出状 況を検索した。 結果は，C. albicans の検出率は症例別で 54%， 菌数別で 62%と従来から指摘されている1,2)より低 下し，non-albicans が増加していることが確認され た。non-albicans のなかでは C. glabrata が一番多 く検出されたが，C. glabrata は単独としてよりも， C. albicans とともに混合感染として検出された症 例 が 3 倍 以 上 に 認 め ら れ た。Coco ら3)，Pathak ら5)も Candida の混合感染のなかでは C. albicans と C. glabrata の組み合わせが一番多いことを報告 している。Kamikawa ら6)の研究でも，2012〜2013 年で C. glabrata が検出された症例はすべて C. albi-cans とともに検出されており，海外だけではなく 本邦においても同様の傾向を示している。 カンジダの増殖形態は 2 形性で，保菌状態では酵 母型で，口腔粘膜上皮表面に付着しているだけで付 着力は弱く，含嗽や唾液の自浄作用で容易に剝がれ る。しかし，付着が持続すると粘膜上皮と酵母の間 に唾液タンパクや血液タンパクを介してより強固に 付着するようになる。さらにそれが持続すると，カ ンジダから仮性菌糸が粘膜上皮下に垂直に侵入し， 粘膜と強固に付着するようになる13)。こうなると抗 真菌薬を使用しないとカンジダは除去できない。こ のように口腔カンジダ症では，カンジダの形態が保 菌状態の酵母型から増殖状態の仮性菌糸型へ変化す ることで生じる。実際，カンジダの確定診断は，鏡 検でカンジダの菌糸タイプが検出されることで決定 される。しかし，C. glabrata は，2 形性を示さず， 増殖期であっても酵母タイプを維持する唯一のカン ジダである14)。大きさは C. albicans の 4〜6 μm よ りも小さく 1〜4 μm であり，さまざまな点で C. albicans と は 異 な る 生 物 学 的 特 性 を 有 し て い る1〜3,14)。Silva ら15)は，RHOE という口腔粘膜上 皮モデルを用い，C. albicans と C. glabrata のコロ ニー形成能と粘膜上皮内への浸潤能を検索した。結 果は C. albicans はコロニー形成能と上皮内への浸 潤能は高いが，C. glabrata は軽度のコロニー形成 能だけで，浸潤能は認めなかった。しかし，これら を混合感染させると C. glabrata の浸潤能の増強が 認められた。したがって C. glabrata は単独での感 染力は弱いが，C. albicans と混合感染することで 感染力が増強することが示唆された。 カンジダに関連する因子を，C. alb 群と C. alb＋ C. glab 群で比較したところ，有床義歯使用の有無 に明らかな差を認めた。従来より口腔カンジダ症患 者，ならびにカンジダ保菌者では義歯との関連が指 摘されている16〜18)が，C. albicans 以外の菌種での 評価はほとんど検討されていなかった。今回の結果 は，C. albicans 単独以上に C. albicans と C. glabra-ta が混合感染すると義歯との関連が深まることが 示唆された。Luo ら1)によれば，C. glabrata は C. albicans よりも細胞表面の疎水性が 4 倍，アクリル レジンとの付着能が 2 倍高いことから，C.glabrata は C. albicans よりも義歯に付着しやすいことを報 表 両群におけるカンジダの菌数と抗真菌薬の効果の比較
定したところ，C. albicans と C. glabrata の組み合 わせが一番量が多かったことを報告した。このよう に粘膜上皮のみならず，義歯表面においても C. albicans 単独より C. glabrata と共生することで， より強固に義歯表面に付着しバイオフイルムを形成 することが示唆された。 現在，口腔カンジダ症に対し，本邦で使用可能な 抗真菌薬には，ミコナゾール，アムホテリシン B， イトラコナゾールの 3 種類がある。どれも有効性が 高いとされているが，特にミコナゾール19)や，イト ラコナゾール20)では，80％以上の有効性が報告され ている。本研究では，C. alb 群の有効率は 79%と同 様であったが，C. alb＋C. glab 群では 46%と有意に 低下していた。C. alb＋C. glab 群で無効であった 14 例中，13 例は C. glabrata が無効な症例であっ た。このことより薬剤感受性検査は行っていない が，C. glabrata の抗真菌薬に対する感受性の低下 が示唆された。Kamikawa ら6)も，C. glabrata に対 するミコナゾールの MIC90は，2006〜2007 年の 4 μg/ml から 2012〜2013 年には 16 μg/ml と 4 倍に上 昇したことを報告している。しかし，この耐性傾向 は，アゾール系のミコナゾールやイトラコナゾール に対してであり，アムホテリシン B では報告され ていない6,8)。本研究で，アムホテリシン B も無効 な症例が多く認められた理由は不明だが，症例数が 少なく，今後，症例数を重ね薬剤感受性試験も行っ たうえで検討したい。 結 論 当科における最近の口腔カンジダ症患者からのカ ンジダ検出状況を検索したところ，C. albicans 以 外のカンジダ，なかでも C. glabrata が 25%に認め られ，その多くは C. albicans と混合感染していた。 この混合感染群は，C. albicans だけが検出された 群に比べ有床義歯の使用が有意に多く，抗真菌薬に 対する抵抗性も有意に高いことが示された。 本論文の要旨は，第 26 回日本老年歯科医学会学術大 会（2015 年 6 月，横浜）において発表した。
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Kazutaka Okada, Seitaro Nakazawa, Ayako Yokoyama, Haruhiko Kashiwazaki
Kunihiko Kobayashi and Yutaka Yamazaki
Gerodontology, Department of Oral Health Science, Graduate School of Dental Medicine, Hokkaido University
Candida glabrata as an oral candidiasis pathogen is a growing concern with increasing prevalence rates and its reduced susceptibility to azoles. We assessed the prevalence rates of Candida species among oral candidiasis in gerodontology outpatients of Hokkaido University Hospital.
We examined oral mycological flora of 156 patients, from August2013 to December 2015, in whom culture tests from tongue dorsa were positive. Candida glabrata isolated concomitantly with Candida albicans were designated as a mixed group, and Candida albicans alone as a single group. Background variables and susceptibility to antifungal agents were compared between the two groups by statistical analysis.
The single group was isolated from 84（54%）and the mixed group from 36（23%）of patients. There were many other species of Candida without C. albicans, unlike in previous reports. A number of C. glabrata were notisolated as a single species but found in combination with C. albicans. Regarding background variables and susceptibility to antifungal agents, the mixed group was significantly more prevalentin patients with dentures and showed higher resistance to antifungal drugs than the single group.
Our results indicate that C. albicans and C. glabrata concomitant infection of oral candidiasis is strongly associated with the wearing of dentures and higher resistance to antifungal drugs.
