博 士 （ 理 学 ） 金 川 基
学位論文題名
Tyrosine Phosphorylation of the H7K‑ATPase in Gastric Parietal Cells
（胃壁細胞におけるH/K ・ATPase のチロシンリン酸化）
学位論文内容の要旨
胃 壁 細 胞 に 発 現 す る H/K‑ATPase は 胃酸 分泌 に 関与 する 酵 素で 、ATP の加 水 分解 と共 役 して 細胞 内 のH 十 （胃 酸 ）を 細胞 外 へ細 胞外 の でを 細胞 内 へと 能動 輸 送し 、酸 分 泌を 維持 す る。 本酵 素の調節異 常 は 消 化 性 潰 瘍 な ど の 疾 患 を も た ら す。 HJK‑ATPase は触 媒 活性 を有 す 10 回 膜貫 通 型の a 鎖と 、そ の 機能 的 発現 に必 須 のロ 鎖か ら 成る 。胃 酸 分泌 休止 時 にお いて 、 WK‑ATPase は細 胞 内小 胞に 局在する。
酸分 泌 の刺 激で 小 胞が 頂端 膜 と融 合し 、 H/KATPase が細 胞 膜ヒ に表 出 され 、胃 酸 分泌 が生 ずる。酸分 泌を 促 進す る内 因 性物 質としてヒ スタミン、アセチ ルコリン、ガスト リンが知られており 、これらは壁 細胞 上 に発 現す る 受容 体を 介 した 情報 伝 達経 路の ト リガ ーと な る。 ヒスタミンは細胞内 cAMP 濃度を上 昇さ せ pro 価 1k 血 aseA を 活性 化し 、 また 、ア セ チル コリ ン 、ガ スト リ ンは ホス フ ァチ ヂル イノシトー ル代 謝 回転 を促 進 し、 Ca 依存キ ナーゼを活性化す ることが知られて いる。しかし、リン 酸化の標的夕 ンパ ク 質や その 生 理機 能に関する 知見は少なく、酸 分泌調節の詳細な 分子機構については 不明の点が多 い 。 1995 年 、 H ′ KIArPase の ぱ 鎖 の B 一， ′I 如 10 と Ser27 が H 瓜 ・ AIPase 標 品 （G1 膜画 分 ）に 内在 す るキ ナ ーゼ 、ホ ス ファ ターゼによ って可逆的にりン 酸化されることが 発見され、酸分泌を 直接担う本酵 素の り ン酸 化が 酸 分泌 調節 機 構に 関与 す る可 能性 が 示唆 され た 。本 研究では、H ／KIATPa 艶d 鎖の可逆 的 リ ン 酸 化 の 生理 機 能を 理解 す るた めに 、 d 鎖 を りン 酸化 す るキ ナー ゼ の性 質と 胃 壁細 胞内 で H ／ KI 觚Pase の可逆的 リン酸化が生ずる か否かを研究した 。
ま ず 、 a 鎖 の り ン 酸 化 の モ デ ル タ ン パ ク 質 と し て 、 a 鎖 N 末端 領域 を maltoseb 血 dingprotein あ る い は glutatMolleStran 譱 rase と の融 合夕 ン パク 質と し て大 腸菌 内 で発 現さ せ 、人 工基 質 とし た。 G1 膜画 分 によ る人 工 基質 のりン酸化 は反応液中に界面 活性剤が存在する ことで大きく増加し た。野生型と 部位 特 異的 変異 体 融合 夕ン パ ク質 のり ン 酸化 の結果から、融 合夕ンパク質のり ン酸化部位はa 鎖のりン 酸化 部 位に 相当 す るこ とが示唆さ れた。以上より作 成した融合夕ンパ ク質は内在性キナー ゼの基質とな るこ と が示 され た 。ま た、 G1 膜画 分に よ る外 来性 基 質の ルン 酸 化は 、界面活性剤存在下 で増加したこ と よ り 、 内 在 性 キ ナ ー ゼ は 膜 中 に お い て 位 鎖 の N 末 端 領 域 近 傍 に 位 置 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。 次 に 、Gl 膜画 分 、融 合夕 ン パク 質を 用 いて a 鎖を ルン 酸 化す る内 在 性キ ナー ゼ の性 質を 検討した。
プ夕 胃 G1 膜 画分 を M ヂ 、 h ‐82P1 觚 P 存在下 、（〕a2 ＋の有無で りン酸化した結果 、a 鎖のセ リンリン酸化 はCa2 十に依存して増加 したが（民5 ＝0 ．9 いM ）、チロシンルン酸化はCa2 十に依存しなかった。G1 膜画分、
ある い は界 面活 性 剤処 理し た G1 膜 画分 と 、′ I げと T 如10 をPlle に変異させた融 合夕ンパク質をCa2 十存
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在 下 、protein kinaseC(PKC)阻 害 剤 の 有 無 で り ン 酸 化 す る と 、a鎖 お よ び 融 合 夕 ン パ ク 質 の り ン 酸 化 量 はPKC阻 害 剤 に よ っ て 減 少 し た 。Gl膜 画 分 を チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ 阻 害 剤genistein、 又 はqueroetin 存 在 下 で り ン 酸 化 し た と こ ろ 、d鎖 の チ ロ シ ン リ ン 酸 化 が 阻 害 さ れ た 。 更 に 、 キ ナ ー ゼ に 対 す る 特 異 抗 体 を 用 い たWestern blottingに よ り 、Gl膜 画 分 中 に 抗PKCぱ 抗 体 、 抗PKCロn抗 体 と 反 応 す る80‑
kDaの タ ン パ ク 質 が 、 抗c・Src抗 体 と 反 応 す る50〜 60‑kDaの タ ン パ ク 質 が 倹 出 さ れ た 。 抗PKC抗 体 、 抗c‑Src抗 体 を 用 い た 可 溶 化Gl膜 画 分 か ら の 免 疫 沈 降 物 は 、 融 合 夕 ン パ ク 質 の セ リ ン 、 チ ロ シ ン 残 基 を そ れ ぞ れ ル ン 酸 化 し た 。 以 上 よ り 、a鎖 のSer27は 内 在 性PKCa、 ロIIに よ りCa2十 に 依 存 し て 、Tyrlo と′I'yr7は内 在性oSrcによ ってCa2十に依 存せずりン酸 化されること が示された。
次 にin vitroとin vivoの ば 鎖 の チ ロ シ ン リ ン 酸 化 を 比 較 す る た め に 、 ま ず 、 細 胞 レ ベ ル の 実 験 と の 比 較 が 可 能 な ラ ッ ト 、 ウ サ ギ のa鎖 のin vitroに お け る チ ロ シ ン リ ン 酸 化 を 検 討 し た 。 ラ ッ ト 、 ウ サ ギ の Gl膜 画 分 は プ 夕 標 品 の 場 合 と 同 様 に 内 在 性c‑Srcを 含 み 、a鎖 のTyr7とTyrl。 の り ン 酸 化 が 観 察 さ れ た 。 更 に 、 ば 鎖 の 壁 細 胞 内 に お け る チ ロ シ ン リ ン 酸 化 の 検 出 を 試 み た 。 細 胞 内 で チ ロ シ ン ホ ス フ ァ タ ー ゼ (PTPase)を 不 可 逆 的 に 阻 害 す るpervanadate￠ め で 、 ラ ッ ト 、 ウ サ ギ 、 プ タ そ れ ぞ れ の 胃 組 織 を 処 理 し た 後 、 膜 画 分 を 調 整 し 、 抗 チ ロ シ ン リ ン 酸 抗 体 を 用 い たWestern blottingを 行 っ た と こ ろ 、SDS‑ゲ ル 上 でd鎖 と 移 動 度 が 一 致 す る タ ン パ ク 質 を 含 む 種 々 の チ ロ シ ン リ ン 酸 化 夕 ン パ ク 質 が 検 出 さ れ た 。 こ の 膜 画 分 を 可 溶 化 し 、 抗 チ ロ シ ン ル ン 酸 抗 体 結 合 樹 脂 に 添 加 後 、 樹 脂 に 結 合 し た タ ン パ ク 質 を フ ェ ニ ル リ ン 酸 溶 液 、 つ い で グ ル シ ン ・ 塩 酸 緩 衝 液(pH 2.3)で 溶 出 し た と こ ろ 、 い ず れ の 溶 出 試 料 に お い て も チロ シ ン リ ン 酸 化 さ れ たa鎖 が 検 出 さ れ た 。 ま た 、PV処 理 し た 組 織 よ り 調 整 し たa鎖 の ア ミ ノ 酸 配 列 分 析 を 行 っ た と こ ろ 、 ′l'yr￣ 。 の 回 収 量 が未 処 理の 場合 に 比し 約50％ 減 少し た 。こ れら の 結果 は 、ば 鎖 のTyrlo が細胞内でチ ロシンリン酸 化されること示 す初めての証 拠である。
細 胞 内 で のa鎖 の チ ロ シ ン リ ン 酸 化 の 機 能 を 調 ぺ る た め に 、PTPase阻 害 剤 あ る い はc‑Src阻 害 剤 の 細 胞 内 チ ロ シ ン リ ン 酸 化 と 酸 分 泌 に 及 ぼ す 効 果 を 検 討 し た 。 酸 分 泌 は 壁 細 胞 へ の[14C]aminopyrine (AP) の 蓄 積 量 を 指 標 と し て 評 価 し た 。 ラ ッ ト 胃 壁 細 胞 をPVで 処 理 す る と 、d鎖 の チ ロ シ ン リ ン 酸 化 が 検 出 さ れ た が 、APの 蓄 積 量 は 著 し く 阻 害 さ れ た 。PVはH/K‑ATPase活 性 も 阻 害 す る こ と か ら 、 リ ン 酸 化 と 酸 分 泌 の 関 連 を 検 討 す る の に 不 適 当 だ と 考 え ら れ た 。 そ こ で 、c‑Src family選 択 的 阻 害 剤 で あ る4・ am血o．5．（奉methylphenyl）．7．（t．bu衂1）yr孤：010卩，4，dい卩imid血e（PP1）の効果を検討した。壁細胞をPP1、 次 い でPVで 処 理 し た と こ ろ 、luM以 下 のPP1に よ り ば 鎖 の チ ロ シ ン リ ン 酸 化 が 阻 害 さ れ た 。 壁 細 胞 をlいM以 上 のPP1で 処 理 す る と 、dbc觚 佃 で 促 進 さ れ るAP蓄 積 量 の 増 加 が 観 察 さ れ た 。 こ の 実 験 条 件 に お い てd鎖 の チ ロ シ ン リ ン 酸 化 とcAMPに よ っ て 促 進 さ れ るAP蓄 積 量 と の 関 連 性 は 直 接 示 唆 さ れ な か っ た が 、 血W珊 に お い て もc・Smがa鎖 を チ ロ シ ン リ ン 酸 化 す る こ と が 示 さ れ 、c．Src活 性 がcAMP によって促進 される酸分泌 に関与する可能 性が示唆され た。
本 研 究 に よ り 、H/K‑ATPasea鎖 のN末 端 領 域 近 傍 にPKCば 、 ロII、 及 びc‑Srcが 存 在 し 、d鎖 の Ser2r、 及 び ′Iい ￣ 。 とTyr7を そ れ ぞ れ り ン 酸化 す るこ と が示 され た 。更 に チロ シ ンホ スフ ァ ター ゼ 阻害 剤 を 用 い る こ と で 、I‑UK‑ATPaseゼ 鎖 の 胃 壁 細 胞 内 で の チ ロ シ ン リ ン 酸 化 が 初 め て 検 出 さ れ た 。
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学位論文審査の要旨 主査 教授 谷 口和弥 副査 教授 菊池九二三 副査 教授 矢 澤道生 副査 助教授 嘉屋俊二
学位論文題名
Tyrosine Phosphorylation of the H7K‑ATPase in Gastric Parietal Cells
（胃壁細胞におけるH/K‑ATPase のチロシンリン酸化）
胃 壁 細 胞 に 発 現 す るH/K‑ATPaseは 胃 酸 分 泌 に 関 与 し 、ATPの 加 水 分 解 と 共 役 し て 細 胞 内 のH゛ を 細胞 外 へ、 細 胞外 の でを 細胞 内 へと 能 動輸 送 し、 適切 な 酸分 泌 を維 持 する 。 胃酸 分泌 休 止時 に おい て 、I‑UK‑ATPase は 細 胞 内 小 胞 に 局 在 す る 。 酸 分 泌 の刺 激 で小 胞 が頂 端 膜と 融合 し 、I‑UK‑ATPaseが 細胞 膜上 に 表出 さ れ、 胃 酸 分 泌 が 生 ず る 。1995年 、H／K‐ 觚Paseのd鎖 の 町r，Bぽ10とSepがm〈 −ATP8se標 品 （G1膜 画 分 ） の 内 在 性 キ ナ ーゼ 、 ホス フ ァ夕 一ゼ に よっ て 可逆 的 にり ン酸 化 され る こと が 発見 さ れ、 酸分 泌 を直 接 担う 本 酵 素 の 可 逆 的 リ ン 酸 化 と 酸 分 泌 調 節 機 構 の 関 連 が 示 唆 され た 。本 研 究で は 、H儀‐ 觚Pased鎖 の可 逆 的リ ン 酸 化 の 生 理 機 能 を 理 解 す る た め に 、a鎖 を り ン 酸 化 す る キ ナ ー ゼ の 性 質 と 胃壁 細 胞内 でH／K―ATPaseの 可 逆的 ル ン酸 化 が生 ずる か 否か を 研究 し た。
ま ず 、n鎖 の り ン 酸 化 の モ デ ル タ ン パ ク 質 と し て 、d鎖N末 端 領 域 とmaltosebin血gproteinあ る い は glutathionSbansferaseと の 融 合 夕 ン パ ク 質 を 作 成 、 人 工 基 質 と し た 。 こ れを 用 いた 結果 融 合夕 ン バク 質 の り ン 酸 化 部 位 はd鎖 の り ン 酸 化 部 位 に 相 当 す る こ と が 示 さ れ た 。G1膜 画 分に よ る外 来性 基 質の り ン酸 化 は 、 界 面 活 性 剤 存 在 下 で 顕 著 に 増 加 し た こ と よ り 、 内 在 性 キ ナ ー ゼ は 膜 中 に お い てd鎖 のN末 端 領 域近 傍 に位 置 する こ とが 示唆 さ れた 。
プ 夕 胃G1膜 画 分 をMヂ 、h‐ ° や ］ATP存 在 下 、Ca2゛ の 有 無 で ル ン 酸 化 し た 結果 、d鎖の セ リン リ ン酸 化 はCa2゛ に 依 存 し て 増 加 し た が （協5 0．9脚 ） 、チ ロ シン リン 酸 化はCa2゛ に依 存 しな かっ た 。G1膜 画分 、 あ る い は 界 面 活 性 剤 処 理 し たGl膜 画 分 と 、B〆 とB雷10をPheに 変 異 さ せ た 融 合 夕 ン パ ク 質 をCa2十 存 在 下 、prote血ldnaseC￠KC） 阻 害 剤 の 有 無 で り ン 酸 化 す ると 、d鎖 およ び 融合 夕 ンパ ク質 の りン 酸 化量 はPKC 阻 害 剤 に よ っ て 減 少 し た 。G1膜 画 分 を チ ロ シ ン キ ナ ー ゼ 阻 害 剤genistem、 又 はquercetm存 在 下 で りン 酸 化 し た と こ ろ 、a鎖 の チ ロ シ ン リ ン 酸 化 が 阻 害 さ れ た 。 更 に 、Gl膜 画 分 中 に 抗PKCa抗 体 、 抗PKC口u 抗 体 と 反 応 す る80−kDaの タ ン パク 質 が、 抗c‐Sm抗 体 と反 応す る50〜60−kDaの タ ンバ ク質 が 検出 さ れた 。 抗PKC抗 体 、 抗cーSrc抗 体 を 用 い た 可 溶 化G1膜 画 分 か ら の 免 疫 沈 降 物 は 、 融 合 夕 ン パ ク 質 の セ リ ン 、 チ 口 シ ン 残 基 を そ れ ぞ れ り ン 酸 化 し た 。 以 上 よ り 、 ば 鎖 のSepは 内 在 性PKCd、 ロuに よ りCa2゛ に 依 存 し
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て 、TyrioとTyr7は 内 在 性c‑Srcに よ っ てCa卦 に 依 存 せ ず り ン 酸 化 さ れ る こ と が 示 さ れ た 。 ねV VOの ば鎖 の チ口 シ ンリ ン 酸化 を研 究 する た めに 、 まず 、 細胞 レペ ル の実 験 との 比 較が 可能 な ラッ ト 、 ウ サ ギ のd鎖 の 而vitroに お け る チ ロ シ ン リ ン 酸 化 を 検 討 し た 。 ラ ッ ト 、 ウ サ ギ のGl膜 画 分は プ 夕標 品 の 場合と 同様に内在性c‑Srcを含み、 ば鎖のTyr7とTyrl0をりン酸 化した。
Q鎖 の 壁 細 胞 内 に お け る り ン 酸化 の検 出 を試 み た。 細 胞内 で チロ シン ホ スフ ァ ター ゼ(PTPase)を 不可 逆 的 に 阻 害 す るpervanadate￠ り で 、ラ ット 、 ウサ ギ 、プ タ それ ぞ れの 胃組 織 を処 理 した 後 、膜 画分 を 調整 し 、 抗 チ ロ シ ン リ ン 酸 抗 体 を 用 い たWestem blottingを 行 っ た と こ ろ 、SDS‑ゲ ル 上 でd鎖 と 移 動度 が 一致 す る タ ンパ ク 質を 含 む種 々 のチ ロシ ン リン 酸 化夕 ン パク 質 ガも 険出 さ れた 。 この 膜画分を可溶 化し、抗チ口 シンリ ン 酸 抗 体 結 合 樹 脂 に 添 加 後 、樹 脂 に結 合し た タン バ ク質 を 溶出 した と ころ 、 チロ シ ンリ ン 酸化 され たd鎖 が 検 出 さ れ た 。 ま た 、PV処 理 し た 組 織 よ り 調 整 し たa鎖の ア ミノ 酸配 列 分析 を 行っ た とこ ろ 、Tyrloの回 収 量 が 未処 理 の場 合 に比 し 約50％減 少 した 。 これ ら の結 果 は、n鎖 の1｀:yrloが 細胞 内 でチ ロシ ン リン酸化 される ことを 初めて示した ものである。
d鎖 の チ 口 シ ン リ ン 酸 化 の 機 能 を 調 べ る た め に 、PTPase阻 害 剤 あ る い はclrc阻 害 剤 の 細 胞 内 チ ロ シ ン リ ン酸 化 と酸 分 泌に 及 ぽす 効果 を 検討 し た。 酸 分泌 は 壁細 胞へ のr℃ 】趾 血op卩血e（AP冫 の蓄積量を指 標とし て 評 価 し た 。 ラ ッ 卜 胃 壁 細 胞 をPVで 処 理 す る と 、d鎖 の チ ロ シ ン リ ン 酸 化 が 検 出 さ れ た が 、H爪 ‐ATPase 活性とAPの蓄積量は 著しく阻害さ れた。c‐Srcfamdy選択的阻 害剤である4‐amiDo‐5‐（4‐methylphenyl冫−7‐
（tlbutyl冫pyrazolop，4d］p卩imid泣e田Pl） の効 果 を検討し た。壁細胞をPP1、次いでPVで処理したと ころ、
1川 以 下 のPPlに よ りd鎖 の チ ロ シ ン リ ン 酸 化 が 阻 害 さ れ た 。 壁 細 胞 を1いM以 上 のPPlで 処 理 す る と 、 db鹸MPで 促 進 さ れ るAP蓄 積 量 の 増 加 が 観 察 さ れ た 。 こ の 実 験 条 件 に お い てd鎖 の チ ロ シ ン リ ン 酸 化 と cAMPに よ っ て 促 進 さ れ るAP蓄 積 量 と の 関 連 性 は 直 接 示 唆 さ れ な か っ た が 、 わdv0に お い て もcSrcがd 鎖 を チ ロ シ ン リ ン 酸 化 す る こ と が 示 さ れ 、c‐Src活 性 がcAMPによ って 促 進さ れ る酸 分 泌に 関与 す る可 能 性 が示唆 された。
本 研 究 に よ り 、H/K‑ATPased鎖 のN末 端 領 域 近 傍 にPKCd、 ロn、 及 びc‑Srcが 存 在 し 、d鎖 のSe r27、 及 びTyrioとTyr7を そ れ ぞ れ り ン 酸化 す るこ とが 示 され た 。更 に チロ シン ホ スフ ァ ター ゼ 阻害 剤 を用 いる こ と で 、H/K‑ATPased鎖 の 胃 壁 細 胞 内で の チロ シン リ ン酸 化 が初 め て検 出さ れ ，こ れ ら分 野 の研 究 の発 展の 突 破 口 と な っ た 。 よ っ て 著 者 は 北 海 道 大 学 博 士 （ 理 学 ） の 学 位 を 授 与 さ れ る 資 格 あ る も の と 認 め る ．
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