スライド 1

DNA

DNA

を用いた微生物

_{を用いた微生物}

分析の現場での活用

分析の現場での活用

平成18年10月5日

B会場・15:30～15:50

三井農林（株）食品総合研究所

微生物分析サービス

衛生管理手法の変化

衛生管理手法の変化

従来の方法・・・公定法に基づく微生物検査

従来の方法・・・公定法に基づく微生物検査

⇒

⇒

一般性菌数、大腸菌群の判定など

一般性菌数、大腸菌群の判定など

・HACCPやcGMPの導入

・大規模・大量生産

・流通の多様化・迅速化

・安全性追求意識の高まり…

実際は・・・

・より

・より

正確

正確

で

で

迅速

迅速

かつ

かつ

簡便

簡便

な微生物検査方法が必要

な微生物検査方法が必要

・複雑な製造工程を管理するためには菌数だけでなく、

・複雑な製造工程を管理するためには菌数だけでなく、

菌の名前

菌の名前

を決め（＝

を決め（＝

同定

同定

）、

）、

フローラを把握

フローラを把握

することが必要

することが必要

3

これからの微生物管理

これからの微生物管理

これからの微生物管理

菌数測定

菌数測定

＋同定検査

_{＋同定検査}

■

常在菌の把握

常在菌の把握

→ 原料管理、ライン管理、環境管理…

■

イレギュラー菌の把握

イレギュラー菌の把握

→ 的確な問題解決（殺菌・洗浄など）、出荷判定…

■

クレーム原因菌の特定

クレーム原因菌の特定

→顧客への迅速な対応、再発防止… → 信用回復

従来の微生物同定法

従来の微生物同定法

表現形質に基づく同定法

・形態的特徴・・・細胞やコロニーの色や形、その他の特徴

・生理・生化学的特徴・・・生育温度やpH、栄養要求性、酸素の要求性など

専門家でなければ困難

既知種

推定種数

真菌（カビ・酵母）

80,000種

＞1,000,000種

細菌

5,000種

＞50,000種

さらに年間数百種の割合で増加している

操作が煩雑、判定が主観的

長期間(～1ヶ月)を要する

再現性がない場合がある

従来の同定法は企業の

従来の同定法は企業の

ＴＰＯ

ＴＰＯ

にマッチしない

にマッチしない

しかし、

しかし、

DNA

DNA

検査法はその問題を克服

検査法はその問題を克服

微生物同定検査

5

A. niger

A. carbonarius

A. awamori

A. japonicus

MicroSeq

D2解析の結果

黒麹カビの一例

黒麹カビの一例

黒いコロニーが特徴

黒いコロニーが特徴

DNA

DNA

分析導入のハードル

_{分析導入のハードル}

三井農林（株）食品総合研究所

三井農林（株）食品総合研究所

微生物分析サービス

微生物分析サービス

微生物の簡易同定分析

微生物の簡易同定分析

・ 分析機器、試薬が高額

・ いつも使用するわけではない

・ 人的、スペース的に余裕がない

・ 同定した後の情報収集が難しい

・ 第三者に依頼しなければならない

オプション

オプション

・

_・

系統解析

系統解析

・

・

形態観察

形態観察

・

・

リボタイピング解析

リボタイピング解析

7

簡易同定分析（シークエンス法

簡易同定分析（シークエンス法

)

)

■ 部分塩基配列解析（MicroSeqキット使用）

■ 16S rDNA塩基配列1,500bp解析（MicroSeqキット使用）

遺伝子増幅装置

塩基配列解読装置

染色体ＤＮＡ

遺伝子増幅装置

PCR反応

微生物のコロニー

16S rDNAまたは28S rDNA

Bacillus subtilis

9

オプション

オプション

A. acidocaldarius

A. acidocaldarius

subsp.

subsp.

acidocaldarius

acidocaldarius

ATCC 27009

ATCC 27009

T

T

A. acidocaldarius

A. acidocaldarius

subsp.

subsp.

rittmannii

rittmannii

DSM 11297

DSM 11297

T

T

Alicyclobacillus

Alicyclobacillus

genomic species 1 DSM 11984

genomic species 1 DSM 11984

Alicyclobacillus

Alicyclobacillus

genomic species 2 MIH332

genomic species 2 MIH332

A. hesperidum

A. hesperidum

DSM 12489

DSM 12489

T

T

A. acidoterrestris

A. acidoterrestris

ATCC 49025

ATCC 49025

T

T

A. acidiphilus

A. acidiphilus

TA 67

TA 67

T

T

B. tusciae

B. tusciae

IFO 15312

IFO 15312

T

T

B. subtilis

B. subtilis

IAM 12118

IAM 12118

T

T

S. acidophilus

S. acidophilus

DSM 10332

DSM 10332

T

T

S.

S.

thermosulfidooxidans

thermosulfidooxidans

DSM 9293

DSM 9293

T

T

Arthrobacter

Arthrobacter

globiformis

globiformis

JCM 1332

JCM 1332

T

T

A. herbarius

A. herbarius

CP 1

CP 1

T

T

S. disulfidooxidans

S. disulfidooxidans

DSM 12064

DSM 12064

T

T

A. cycloheptanicus

A. cycloheptanicus

DSM 4006

DSM 4006

T

T

分離株

分離株

100

100

65

65

95

95

99

99

94

94

100

100

98

98

99

99

56

56

0.02

0.02

■ 形態観察（オプション）

■ 系統解析

芽胞菌

芽胞菌

麹カビの一種

麹カビの一種

カビ分生子

カビ分生子

MMID

MMID

利用例

利用例

①

①

■ リボタイピング解析

リボタイピング解析は、複数の菌株間の類縁性を評価するのに有効な手法であり、菌株レベルの同一

性を判定（個体識別）することが可能です。

加熱殺菌後

製品原料

16S rDAN部分配列に基づくフローラ調査の結果

A

Bacillus coagulans

Bacillus licheniformis

Bacillus pumilus

Bacillus

sp. (近縁種B. oleronius

)

Bacillus subtilis

B

Bacillus megaterium

Bacillus

sp. (近縁種B. circulans

)

Klebsiella

sp.

Paenibacillus glycanilyticus

Paenibacillus

sp.

どのパーツに由来しているのか？

加熱前の原料にいた菌が生残したのか？

どうすれば改善されるのか？

Bacillus fusiformis

Bacillus megaterium

Bacillus pumilus

Bacillus

sp.

Paenibacillus favisporus

Paenibacillus

sp.

Paenibacillus

sp. (近縁種P. chibensis

)

C

リボタイピング解析

11

A1

Bacillus

sp. (近縁種B. oleronius

)

a

A2

Bacillus

sp. (近縁種B. oleronius

)

b

c

d

e

f

g

h

i

j

k

C1

Bacillus

sp.

A3

Bacillus subtilis

l

B1

Bacillus

sp. (近縁種B. circulans

)

A4

Bacillus coagulans

C2

Bacillus megaterium

C3

Bacillus fusiformis

A5

Bacillus pumilus

m

C4

Bacillus pumilus

B2

Bacillus megaterium

B3

Klebsiella

sp.

B4

Paenibacillus glycanilyticus

A6

Bacillus licheniformis

A7

Bacillus licheniformis

A8

Bacillus licheniformis

A9

Bacillus subtilis

n

o

A10

Bacillus subtilis

C5

Paenibacillus

sp. (近縁種P. stellifer

)

C6

Paenibacillus favisporus

C7

Paenibacillus

sp. (近縁種P. chibensis

)

C8

Paenibacillus

sp.

B5

Paenibacillus

sp.

C9

Paenibacillus

sp. (近縁種P. curdlanolyticus

)

加熱殺菌後に検出された菌は

①製品原料中のパーツAに由来する

②検出された多くの株が

Bacillus sp. (近縁種B. oleronius)

であり、耐熱性が高いと推察される

③パーツAのみ殺菌温度を高く

設定し、他の原料は現状のまま

使用することが可能

同一菌種であって

も、リボパターンは

個体レベルで異

なっている

VS

乳製品および原料の

乳製品および原料の

大腸菌群検査

大腸菌群検査

BGLB法

(－）

特定酵素

基質培地法

（＋）

MMID

MMID

利用例

利用例

②

②

試験方法によって結果が違うのは何故か?

＜

＜

BGLB

BGLB

法＞

法＞

大腸菌群の中には

大腸菌群の中には

β

β

-

-

ガラクトシダーゼを産生しても透

ガラクトシダーゼを産生しても透

過酵素を欠くため乳糖を発酵しない菌がいるため、

過酵素を欠くため乳糖を発酵しない菌がいるため、

陰

陰

性

性

となる場合がある。

となる場合がある。

＜特定酵素基質反応法＞

＜特定酵素基質反応法＞

Bacillus

Bacillus

属などの一部の菌は

属などの一部の菌は

β

β

-

-

ガラクトシダーゼを産

ガラクトシダーゼを産

生するため、大腸菌群以外の菌も陽性となる場合がある。

生するため、大腸菌群以外の菌も陽性となる場合がある。

ラウリル酸ナトリウム等の

ラウリル酸ナトリウム等の

グラム陰性菌の選択剤が培地

中に添加

されている。

されている。

13

特定酵素

基質培地

（＋）

16S rDNAによる同定の結果、

グラム陽性細菌

Enterococcus faecium

β-ガラクトシダーゼ（＋）

フィルター滅菌

フィルター滅菌

した乳成分

した乳成分

＋

＋

純粋培養

純粋培養

したコロニー

_{したコロニー}

純粋培養

純粋培養

したコロニー

_{したコロニー}

乳成分が菌の生育

乳成分が菌の生育

力を増進させてしま

力を増進させてしま

い、擬陽性となった

い、擬陽性となった

特定酵素

特定酵素

基質培地

基質培地

（＋）

特定酵素

特定酵素

基質培地

基質培地

（－）

（＋）

（－）

■ 研究実績

2003

2003

年

年

10

10

月

月

全国清涼飲料研究会

全国清涼飲料研究会

会長賞受賞

会長賞受賞

「

「

Alicyclobacillus

Alicyclobacillus

属細菌のグアイアコール生産性とその検査方法」

属細菌のグアイアコール生産性とその検査方法」

2006

2006

年

年

6

6

月

月

日本微生物資源学会奨励賞

日本微生物資源学会奨励賞

受賞

受賞

「好気性有胞子細菌の分類学的研究とその遺伝情報および生物資源の産業界での活用」

「好気性有胞子細菌の分類学的研究とその遺伝情報および生物資源の産業界での活用」

現場に通じ、学術の知識を

現場に通じ、学術の知識を

兼ね揃えたスタッフが皆様の

兼ね揃えたスタッフが皆様の

ご要望にお応えします

ご要望にお応えします

http://www.mitsui