氏 名
やました かねふみ山下 兼史
学 位 の 種 類
博士（医学）
報
告
番
号
甲第
1581 号
学位授与の日付
平成 27 年 9 月 13 日
学位授与の要件
学位規則第４条第１項該当（課程博士）
学 位 論 文 題 目
Pancreatic fistulae secondary to trypsinogen activation by
pseudomonas aeruginosa infection after pancreatoduodenectomy
(膵頭十二指腸切除後膵液瘻における細菌感染とトリプシノーゲン活性
化についての検討)
論文審査委員
(主 査)
福岡大学
教授
山下 裕一
(副 査)
福岡大学
教授
向坂 彰太郎
福岡大学
教授
松井 敏幸
福岡大学
准教授
髙田 徹
1
博士学位申請論文内容の要旨
博士学位申請論文名
Pancreatic Fistulae Secondary to Trypsinogen Activation by
Pseudomonas Aeruginosa
and Infections after Pancreatoduodenectomy
（日本語訳）
膵頭十二指腸切除後膵液瘻における細菌感染と
トリプシノーゲン活性化についての検討
博士学位申請論文キーワード
膵頭十二指腸切除術
膵液瘻
トリプシノーゲン
緑膿菌
エンテロバクター
博士学位申請者氏名
山下 兼史
（平成 27 年 4 月 2 日提出）
2 【背景】膵頭十二指腸切除術(PD)は腹部手術の中で高難易度の術式であり、その合併症発 生率は 12～60%と他臓器手術と比較して未だに高率である。その中でも膵液漏は、腹腔内 膿瘍や出血を来たし手術関連死につながる非常に重篤な合併症である。 【目的】近年、 膵液漏と細菌感染との関連が示唆されているが、そのメカニズムについ ては不明である。今回我々は、 膵液漏患者より分離された細菌株を用いて、膵液漏の key enzyme であるトリプシノーゲンの活性化についての実験を行った。 【対象と方法】2009 年 1 月から 2013 年 3 月までに当院で施行した膵頭十二指腸切除術 82 症例を膵液漏の Grade 別に分類した。ドレーン排液を培養し、膵液漏の起因菌の検索を行 った。分離された細菌培養上清とトリプシノーゲンを 37℃で共培養し、そのサンプルを SDS-PAGE にて電気泳動を行い、トリプシノーゲン活性化の有無を確認した。その後、 SDS-PAGE で得られたペプチドを質量分析で解析した。Trypsinogen-Zymography を用いて トリプシノーゲンを活性化するプロテアーゼを検索した。 【結果】当科で感染対策を行う以前の 2013 年 3 月までの PD 施行症例 50 例中、Grade B/C の膵液漏は 9 症例(18。0%)に認めた。Enterobacter cloacae と Pseudomonas aeruginosa は
Grade B/C の患者より分離され、これらの細菌の培養上清はトリプシノーゲンをトリプシ
ンへ活性化した。また、この現象はプロテアーゼ阻害薬によって阻害された。
Trypsinogen-Zymography では、Pseudomonas aeruginosa の培養上清中のトリプシノーゲン活
性化バンドを 50kDa に認めた。
【結語】これまでに細菌によるトリプシノーゲンの活性化の報告はない。本実験では
Pseudomonas aeruginosa と Enterobacter cloacae の培養上清によりトリプシノーゲンが活性化
されることを明らかにした。PD の周術期管理においてこれらの細菌を中心とした感染の コントロールは重要であると思われる。
1 審 査 の 結 果 の 要 旨 1. 斬新さ 膵 頭 十 二 指 腸 切 除 術 後 の 膵 液 瘻 と 細 菌 感 染 の 関 連 に つ い て の 報 告 は 散 見 さ れ る が 、 実 際 に 、 ど の よ う な 機 序 で 細 菌 感 染 が 膵 液 瘻 を 起 こ し て い る か 、 細 菌 感 染 が 膵 液 を 活 性 化 す る か と い う こ と を 明 確 に 示 し た 論 文 は 未 だ な い 。 本 論 文 は 、 細 菌 感 染 に よ る 膵 液 の 活 性 化 を 世 界 で 初 め て 明 ら か に し た 。 ま た 、 実 験 手 法 に つ い て も 、zymography で は 通 常 カ ゼ イ ン や ゼ ラ チ ン を 用 い る 。 プ ロ テ ア ー ゼ の 活 性 化 物 質 検 索 の た め に 、 目 的 プ ロ テ ア ー ゼ を 基 質 蛋 白 と し て 用 い た zymography を行った報告も未だなく、実験手 法 自 体 も 斬 新 で あ る 。 2. 重要性 当 科 の 加 藤 ら の 研 究 に よ り 膵 頭 十 二 指 腸 切 除 術 後 の 閉 鎖 式 ド レ ー ン の 導 入 に よ り 膵 液 瘻 が 減 少 す る と の 新 し い エ ビ デ ン ス が 生 ま れ た 。(Drain selection reduces pancreatic fistulae risk: a propensity-score matched study. Hepato-Gastroenterology 2015; 62:73-80)閉鎖式ドレーンを用いることによりドレーン関連の逆行性感染が減少すると 言 わ れ て い る 。 し か し 、 こ れ ま で に 細 菌 感 染 と 膵 液 瘻 と の 関 連 を 明 確 に 示 し た 論 文 は な く 、 本 論 文 で 、 細 菌 感 染 が 膵 液 を 活 性 化 さ せ る こ と を 明 確 に 示 し た 。 こ の こ と に よ り 、 膵 頭 十 二 指 腸 切 除 後 の 膵 液 瘻 予 防 の た め に 感 染 の コ ン ト ロ ー ル が 重 要 で あ る こ と が 実 証 さ れ た 。 3. 研究方法の正確性 本 研 究 で は 福 岡 大 学 病 院 で 膵 頭 十 二 指 腸 切 除 術 を 施 行 さ れ た 患 者 の 十 分 に 蓄 積 さ れ た 臨 床 デ ー タ ー を 用 い て 行 っ た 。 ま た 、 実 験 に 関 し て は 、 福 岡 大 学 医 学 部 微 生 物 免 疫 学 講 座 に て 行 い 、 実 験 結 果 に つ い て は 逐 一 、 微 生 物 免 疫 学 講 座 の デ ー タ ー 検 討 会 で 正 確 性 を 確 認 し た 。 ま た 、 神 戸 大 学 質 量 分 析 セ ン タ ー と 共 同 研 究 を 行 い 、 神 戸 大 学 質 量 分 析 セ ン タ ー の 豊 富 な 経 験 を も と に 、 ペ プ チ ド の 同 定 を 行 っ た 。 4. 表現の明確性 目 的 ・ 方 法 ・ 結 果 ・ 結 論 に つ い て 明 確 か つ 詳 細 に 表 現 さ れ て い る 。 ま た 、 本 研 究 は 、 福 岡 大 学 医 学 部 外 科 学 講 座 消 化 器 外 科 ・ 福 岡 大 学 医 学 部 微 生 物 免 疫 学 講 座 ・ 神 戸 大 学 質 量 分 析 セ ン タ ー と 3 施設で共同研究を行っており、それぞれ専門 家 を 交 え て そ の 表 現 に つ い て 検 討 を 重 ね て き た た め 、 表 現 の 明 確 性 が 担 保 さ れ た 。 5. 主な質疑応答 Q:膵頭十二指腸切除術において、幽門輪は温存しているか？ A:基本的には幽門輪を温存していますが、幽門輪周囲のリンパ節廓清が必要な症例に つ い て は 、 幽 門 輪 を 含 め た 胃 切 除 を 行 っ て お り ま す 。 Q:術式による膵液瘻発生の差異はあるか？ A:報告されている論文によると幽門輪を温存するか し な い か で は 、 差 異 は な い と い う
2 報 告 が 多 い で す 。 ま た 、 膵 液 瘻 に お い て 一 番 重 要 で あ る 、 膵 管 空 腸 吻 合 に つ い て は 、 膵 管 胃 吻 合 の 方 が 、 膵 液 瘻 が 少 な い と の 報 告 も あ り ま す が 、 こ こ に 関 し て は ま だ 一 定 の 見 解 が 得 ら れ て お り ま せ ん 。 当 科 で は 膵 管 空 腸 吻 合 術 を 第 一 選 択 と し て い ま す 。 Q:膵液瘻の判断基準であるドレーンは、どこのドレーンか？また、膵液瘻の時は膿性 の 排 液 は あ る か ？ 術 後 、 ど の 時 期 に 膵 液 瘻 が 多 い か ？ A:当科では、膵管空腸吻合部後面・肝尾状葉下面・胆管空腸吻合部後面の 3 カ所にド レ ー ン を 挿 入 し て い ま す 。 術 後 、 膵 液 瘻 の 判 断 と な る 排 液 中 の ア ミ ラ ー ゼ が 高 値 と な る ド レ ー ン は 、 膵 管 空 腸 吻 合 部 後 面 の ド レ ー ン が 一 番 多 い で す 。 ま た 、 膵 液 瘻 発 生 時 に は 、 ド レ ー ン よ り 膿 性 の 排 液 が 認 め ら れ る 症 例 が 多 い で す 。 膵 液 瘻 発 生 が 一 番 多 い 時 期 は 、 術 後 1 週間前後です。 Q:膵液活性化に関する胆汁の影響はあるか？ A：胆汁も膵液を活性化しますが、当科では術後、胆管チューブと膵管チューブを挿 入 し て い る た め 、 膵 液 と 胆 汁 の 流 れ は 別 々 に し て い ま す 。 そ の た め 、 膵 頭 十 二 指 腸 切 除 後 の 膵 液 瘻 に 対 す る 胆 汁 の 影 響 は 少 な い と 考 え ら れ ま す 。 Q:リパーゼに対する膵液漏の影響はあるか？ A:リパーゼも膵液中の重要なプロテアーゼです。一般的には、急性膵炎等においても ト リ プ シ ノ ー ゲ ン の 活 性 化 が 非 常 に 重 要 で あ る と 言 わ れ て い ま す 。 今 回 の 研 究 で リ パ ー ゼ に よ る 膵 液 瘻 の 直 接 的 な 影 響 は 確 認 し て お り ま せ ん が 、 ト リ プ シ ノ ー ゲ ン が 活 性 化 し た ト リ プ シ ン に よ っ て も リ パ ー ゼ は 活 性 化 さ れ る た め 、 膵 液 瘻 に お い て も リ パ ー ゼ は 何 ら か の 影 響 を 及 ぼ し て い る 可 能 性 が あ る と 思 わ れ ま す 。 今 回 の 実 験 で は 、 膵 液 の 活 性 化 に 一 番 重 要 で あ る ト リ プ シ ノ ー ゲ ン の 活 性 化 に つ い て 注 目 し ま し た 。 Q:このようなデータが出た場合に、臨床的にはどのように注意すればいいか？ A:膵頭十二指腸切除術の対象疾患では、術前に黄疸や胆管炎を認め、胆道ドレナージ が 必 要 と な る 症 例 が あ り ま す 。 こ の 時 に 、 胆 汁 細 菌 培 養 を 提 出 し 、 も し 、 緑 膿 菌 を 認 め た ら 、 術 前 に 完 全 に 緑 膿 菌 を コ ン ト ロ ー ル し て か ら 手 術 を 行 う よ う に し て い ま す 。 ま た 、 術 前 、 緑 膿 菌 の 感 染 を 認 め た 症 例 に 関 し て は 、 周 術 期 も 緑 膿 菌 の 監 視 培 養 を 行 い 、 状 況 に よ っ て は 、 周 術 期 に 術 前 の 細 菌 感 受 性 を 元 に 抗 生 剤 の 選 択 を 行 っ て お り ま す 。 Q:この研究を行った時のドレーンは全部閉鎖式ドレーンか？ A:初期はほとんど開放式ドレーンで後期の症例に関しては閉鎖式 ドレーンを使用して い ま す 。 本 研 究 に は 両 方 の ド レ ー ン の 症 例 が 含 ま れ て い ま す 。 Q:緑膿菌は外因性でエンテロコッカスやエンテロバクターは内因性の感染によるもだ が 、 感 染 経 路 は ど の よ う に 違 う か ？ ま た 、 検 体 の 採 取 は い つ 行 っ て い る か ？ A:膵頭十二指腸切除術の切除範囲は広範囲に及びます。よって、術中に腸管を切除し た 時 等 に 、 腸 管 中 の 細 菌 が 術 野 を 汚 染 す る 可 能 性 も あ り ま す 。 緑 膿 菌 に 関 し て は 、 術 前 に 胆 管 炎 を 併 発 し て お り 抗 生 剤 治 療 を 行 っ た 症 例 等 に 多 く 認 め ら れ ま す が 、 こ の 場 合 も 、 術 中 に 胆 管 切 除 し た 時 に 、 胆 汁 中 の 緑 膿 菌 が 術 野 を 汚 染 し た 可 能 性 が 考 え ら れ ま す 。 検 体 の 採 取 は 、 術 後 1、3、5、7 日目に行っております。 Q:50kDa のバンドの特定をするために、バンドを切り出して特定できる可能性はある か ？
3 A:実際に、Zymography で認めた 50kDa のバンドを切り出して、再度質量分析を行い ま し た 。 し か し 、SDS-PAGE と異なり Zymography においては、ゲル中にトリプシノ ー ゲ ン の 蛋 白 が 多 く 含 ま れ て い ま す 。 こ の た め 、 恐 ら く 緑 膿 菌 の 培 養 上 清 中 の ト リ プ シ ノ ー ゲ ン を 活 性 化 す る プ ロ テ ア ー ゼ の 蛋 白 量 よ り 、 切 り 出 し た ゲ ル 中 の ト リ プ シ ノ ー ゲ ン の 蛋 白 量 の 方 が 多 か っ た た め 、50kDa のバンドのペプチドを検出することがで き ま せ ん で し た 。 Q:腹腔内にプロテアーゼ阻害薬を注入する等の治療方法はある か？ A:膵液瘻が発生した時に、フサンや FOY 等のプロテアーゼ阻害薬で洗浄するという報 告 も あ り ま す が 、 こ の 効 果 に つ い て は ま だ 一 定 の 見 解 が 得 ら れ て お り ま せ ん 。 Q:ドレーン自体が膵液瘻を感知するようなシステムの 開発可能か？ A:貴重なご意見ありがとうございます。今後の検討課題とさせて頂きます。 本 論 文 は 、 上 記 の 内 容 を 踏 ま え 主 査 ・ 副 査 で 協 議 し た 結 果 、 学 位 論 文 に 値 す る と 評 価 さ れ た 。
