ハクサイ（Brassica rapa subsp. pekinensis）の半数体育種に関する研究

ハクサイ（Brassica rapa subsp. pekinensis）の

半数体育種に関する研究

著者

佐藤 正紀

内容記述

学位授与大学: Osaka Prefecture University(大阪

府立大学), 学位の種類: 博士(応用生命化学）, 学

位記番号: 論生命第11号, 学位授与年月日:

2009-11-30, 指導教員: 小田 雅行.

大 阪 府 立 大 学 博 士 （ 応 用 生 命 科 学 ） 学 位 論 文

ハクサイ（

Brassica rapa

subsp.

pekinensis

）の

半 数 体 育 種 に関 する研 究

佐 藤 正 紀

2009 年

目 次

第 １ 章 緒 言 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・3 第 ２ 章 葯 お よ び 小 胞 子 培 養 に よ る 倍 加 半 数 体 の 作 出 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・1 4 第 １ 節 小 胞 子 培 養 に お け る 不 定 胚 形 成 率 に 対 す る 材 料 蕾 あ る い は 花 序 の 低 温 前 処 理 効 果 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・1 4 第 １ 項 共 通 の 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・1 5 第 ２ 項 花 序 あ る い は 蕾 の 低 温 前 処 理 の 効 果 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・1 9 第 ３ 項 蕾 の 0 , 3 , 7 , 1 0 , 1 5 お よ び 2 0 日 間 の 低 温 前 処 理 の 効 果 ・ ・ ・ 2 0 第 ４ 項 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・2 3 第 ２ 節 蕾 低 温 処 理 が 小 胞 子 の 発 達 に お よ ぼ す 影 響 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・2 4 第 １ 項 共 通 の 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・2 4 第 ２ 項 同 一 蕾 中 の 6 葯 の 中 の 小 胞 子 の 発 達 ス テ ー ジ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 2 5 第 ３ 項 低 温 処 理 中 の 小 胞 子 の 発 達 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・2 5 第 ４ 項 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・2 8 第 ３ 節 1 個 体 の 材 料 植 物 か ら 得 ら れ る 倍 加 半 数 体 数 の 推 定 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 2 9 第 １ 項 材 料 植 物 1 個 体 か ら の 小 胞 子 培 養 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 3 0 第 ２ 項 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・3 1 第 ４ 節 葯 お よ び 小 胞 子 培 養 由 来 の 不 定 胚 か ら の 再 分 化 植 物 の 作 出 と 倍 数 性 の 検 討 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・3 3 第 １ 項 共 通 の 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・3 4 第 ２ 項 培 養 法 が 再 分 化 植 物 の 倍 数 性 に 与 え る 影 響 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・3 6 第 ３ 項 品 種 ・ 系 統 が 小 胞 子 培 養 由 来 の 再 分 化 植 物 の 倍 数 性 に 与 え る 影 響 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・3 7 第 ４ 項 不 定 胚 の 倍 数 性 調 査 に よ る 自 然 倍 加 の 発 生 時 期 の 推 定 ・ ・ ・3 9 第 ５ 項 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・4 1

第 ３ 章 優 良 倍 加 半 数 体 系 統 の 育 成 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・4 8 第 １ 節 交 配 に 利 用 す る た め の 成 熟 花 粉 の 保 存 に 関 す る 検 討 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・4 8 第 １ 項 i n v i t r o で の 花 粉 発 芽 法 の 検 討 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 4 9 １ ． 共 通 の 材 料 お よ び 方 法 ２ ． 培 地 の p H の 影 響 ３ ． 湿 度 前 処 理 の i n v i t r o 花 粉 発 芽 へ の 影 響 ４ ． 湿 度 前 処 理 が 花 粉 の 形 態 に 与 え る 影 響 ５ ． 花 粉 発 芽 率 の 品 種 ・ 系 統 間 差 異 第 ２ 項 花 粉 の 保 存 条 件 の 検 討 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・5 8 １ ． 花 粉 保 存 時 の 湿 度 の 影 響 ２ ． 花 粉 保 存 時 の 温 度 の 影 響 第 ３ 項 長 期 保 存 花 粉 の 受 精 能 力 と 自 家 不 和 合 性 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・6 0 第 ４ 項 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・6 5 第 ２ 節 葯 お よ び 小 胞 子 培 養 に よ る 優 良 倍 加 半 数 体 系 統 の 作 出 と 品 種 育 成 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・7 1 第 １ 項 F1品 種 か ら の 倍 加 半 数 体 の 作 出 と 育 種 母 本 の 育 成 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・7 1 第 ２ 項 圃 場 選 抜 個 体 か ら の 倍 加 半 数 体 の 育 成 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・7 6 第 ３ 項 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・7 8 第 ４ 章 総 合 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・8 1 摘 要 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・8 8 S u m m a r y ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 9 3 謝 辞 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・1 0 0 引 用 文 献 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・1 0 1

第 １ 章 緒 言

ハ ク サ イ は ， 地 中 海 沿 岸 を 起 源 と し ， 中 国 に 伝 わ っ て 栽 培 さ れ ， 品 種 が 分 化 し た と 考 え ら れ て い る( 水 島 と 角 田 1 9 6 9 ) ． 現 在 で は ， 主 に 中 国 ， 朝 鮮 半 島 お よ び 日 本 等 の 極 東 ア ジ ア 地 域 で 栽 培 さ れ て い る ． 日 本 へ は1 8 6 6 年 ( 慶 応 2 年 ) に は じ め て 渡 来 し た と い わ れ ， 本 格 的 に 導 入 さ れ た の は 1 8 7 5 年 ( 明 治 8 年 ) で ， そ の 後 ， 愛 知 県 や 宮 城 県 で 育 種 や 採 種 が 行 わ れ る よ う に な り 普 及 し て い っ た ． そ し て ， 葉 菜 類 の 少 な い 冬 期 間 の 重 要 な 野 菜 と し て 生 産 量 も 伸 び 続 け た ． 現 在 で は ， ハ ク サ イ は 最 も 身 近 で 重 要 な 野 菜 の ひ と つ と し て ， 鍋 物 ， 煮 物 ， 加 工 品( 漬 物 ， 浅 漬 ， キ ム チ ) お よ び サ ラ ダ 用 と し て 幅 広 く 利 用 さ れ て い る ． 作 付 面 積 は ， 野 菜 の 中 で ダ イ コ ン ， キ ャ ベ ツ ， ス イ ー ト コ ー ン ， タ マ ネ ギ ， ホ ウ レ ン ソ ウ ， ネ ギ ， レ タ ス に 次 い で 第 8 位 ， 収 穫 量 は ダ イ コ ン ， キ ャ ベ ツ ， タ マ ネ ギ に 次 ぐ 第 4 位 ( 2 0 0 2 ～ 2 0 0 ７ 年 ) で あ る ． し か し ， 近 年 の 作 付 面 積 は 減 少 傾 向 に あ り ( Ta b l e 1 - 1 ) ， 2 0 0 5 年 以 降 2 0 , 0 0 0 h a を 下 回 り ， 収 穫 量 は 2 0 0 3 年 以 降 1 , 0 0 0 , 0 0 0 t 以 下 で 推 移 し て い る ． 作 付 面 積 や 収 穫 量 の 減 少 は ， 現 代 の 食 生 活 の 多 様 化 が 原 因 の 一 つ と 考 え ら れ る ． ハ ク サ イ は ， 同 一 産 地 で の 周 年 栽 培 は 成 り 立 た な い の で ， 全 国 の 北 か ら 南 ま で の 各 産 地 で 異 な る 作 型 で 栽 培 さ れ て い る ． す な わ ち ハ ク サ イ の 周 年 供 給 は ， 収 穫 季 節 の 違 い ， 品 種 の 早 晩 性 ， 育 苗 や 加 温 と い っ た 栽 培 技 術 の 組 み 合 わ せ に よ っ て 成 立 し て い る ． し か し ， 市 場 へ の 入 荷 状 況 は ，11 月 か ら 2 月 に ピ ー ク が 現 れ ， 5 月 か ら 8 月 は 激 減 し て い る ( 由 比 1 9 9 3 ) ． こ れ は ， ハ ク サ イ の 抽 苔 特 性 に よ り 高 温 期 の 栽 培 が 困 難 で あ る こ と ， 冬 季 の 鍋 物 へ の 利 用 と い っ た 消 費 者 側 の 利 用 頻 度 や ， 浅 漬 け や キ ム チ の 業 務 ・ 加 工 用 に 出 荷 さ れ て い る と い っ た 市 場 動 向 に よ る も の と 考 え ら れ る ． ハ ク サ イ が 日 本 に 導 入 さ れ ， 栽 培 が 普 及 し た 当 初 は ， そ の 種 子 が 遺 伝 的 に 雑 駁

Table 1-1. Cutivation area and harvest amount

par year of

Brassica rapa

subsp.

pekinensis

L.

(Chinese cabbage) in Japan.

Cultivation

Harvest

Year area (×10

3

ha) amount (×10

3

t)

1998

23.7

989.9

1999

23.5

1,079.0

2000

22.7

1,036.0

2001

22.0

1,038.0

2002

21.4

1,005.0

2003

20.7

964.5

2004

20.2

887.6

2005

19.8

924.3

2006

19.3

942.3

2007

18.7

917.5

E x t r a c t f r o m A g r i c u l t u r e - a n d - f o r e s t r y f i s h e r y s t a t i s t i c s i n f o r m a t i o n s y n t h e s i s d a t a b a s e .

で あ っ た の で ， 結 球 し な い も の が 多 か っ た ． し た が っ て ， い か に し て 種 子 の 純 度 を 高 め て 結 球 率 の 高 い 品 種 を 育 成 す る か が 当 初 の 育 種 目 標 で あ っ た ． 中 国 か ら 導 入 し た 種 子 を 対 象 に し て ， 集 団 選 抜 ， 純 系 分 離 ， 母 系 淘 汰 に 交 配 固 定 の 手 法 も 組 み 入 れ ら れ ， 現 在 の 品 種 の 育 種 素 材 と な る 多 く の 品 種 が 育 成 さ れ た( 渡 辺 1 9 8 9 ) ． こ の よ う に し て 種 子 の 実 用 的 純 度 が 向 上 し ， 栽 培 が 安 定 し て 各 地 に 産 地 が 形 成 さ れ 市 場 出 荷 さ れ る よ う に な っ て か ら は ， 市 場 の 意 向 を 反 映 し て 結 球 形 態 ， 熟 期 ， 輸 送 性 に 着 目 し た 品 種 改 良 が 行 わ れ る よ う に な っ た ． 更 に1 9 3 0 年 代 中 頃 か ら は ， 耐 病 性 の 付 与 が 求 め ら れ る よ う に な り ， 軟 腐 病 ， ウ イ ル ス 病 の 抵 抗 性 育 種 が 進 め ら れ た ． こ の よ う に ， ハ ク サ イ 栽 培 の 普 及 ， 拡 大 と と も に 育 種 目 標 は 細 分 化 さ れ て 多 岐 に わ た り ， 結 球 形 態 ， 生 理 ･ 生 態 特 性 ， 作 型 ， 栽 培 適 地 ， 耐 病 性 ， 生 理 障 害 耐 性 と い っ た 多 数 の 形 質 に つ い て 選 抜 さ れ ， 育 種 が 行 わ れ て き た ． 現 在 で は ， 作 型 も 多 様 化 し ， 葉 質 の 硬 軟 ， 耐 暑 性 ， 耐 寒 性 ， 貯 蔵 性 ， 輸 送 性 ， 利 用 適 性( 浅 漬 け 用 ， 煮 物 用 ， キ ム チ 用 ) ， 収 量 ， 耐 病 性 ， と い っ た 多 く の 要 望 に 応 え る た め に ， 各 種 苗 会 社 で 新 品 種 の 開 発 が 続 け ら れ て い る ． 営 利 栽 培 を 行 う 上 で は 耐 病 性 は 非 常 に 重 要 な 形 質 で あ る ． 中 で も 土 壌 伝 染 性 病 害 の 根 こ ぶ 病 は ， 世 界 的 な 重 要 病 害 の 一 つ と し て 抵 抗 性 品 種 の 育 成 が 求 め ら れ て い る ． 根 こ ぶ 病 は ， ダ イ コ ン 以 外 の ア ブ ラ ナ 科 植 物 に 特 異 的 に 発 生 す る 病 害 で ， そ の 病 原 菌 は P l a s m o d i o p h o r a b r a s s i c a e Wo r. で あ る ． 根 に こ ぶ が 着 生 ， 肥 大 し て ， 導 水 性 が 損 な わ れ て 枯 死 に 至 り 収 穫 不 能 と な る ． 日 本 で も 1 9 7 0 年 代 初 期 に 全 国 的 な 発 生 が 認 め ら れ( 吉 川 1 9 7 5 ) ， 産 地 で 大 き な 被 害 を も た ら し た ． P C N B 剤 を 用 い た 土 壌 消 毒 に よ る 防 除 が 行 わ れ て き た が ， 連 作 に よ る 菌 密 度 の 増 加 に よ る と 考 え ら れ る 防 除 効 果 の 低 下 が 問 題 が 顕 在 化 し て き た ． 被 害 面 積 が 増 大 す る 中 で ， 根 こ ぶ 病 抵 抗 性 の 品 種 育 成 が 始 ま り ，1 9 8 2 年 に 野 菜 ・ 茶 業 試 験 場 で ヨ ー ロ ッ パ の 飼 料 用 カ ブ の 根 こ ぶ 病 抵 抗 性( C R ： C l u b r o o t R e s i s t a n c e ) 遺 伝 子 を 導 入 し た ハ ク サ イ の 根 こ ぶ 病 抵 抗 性 系 統 が 育 成 さ れ た( 吉 川 1 9 9 3 ) ．

そ の 後 ， ‘ 空 海 6 5 ’ ( タ キ イ 種 苗 ( 株 ) ， 京 都 ) ， ‘ ス ト ロ ン グ C R 7 5 ’ ( ( 株 ) 渡 辺 採 種 場 ， 宮 城) と い っ た C R 品 種 が 育 成 さ れ ， 現 在 で は ハ ク サ イ ， カ ブ ， ツ ケ ナ ， キ ャ ベ ツ ， ブ ロ ッ コ リ ー で 多 数 の C R 品 種 が 市 販 さ れ て い る ． C R 品 種 は 育 成 当 初 ， 高 い 抵 抗 性 を 示 し ， 根 こ ぶ 病 が 多 発 す る 圃 場 で も 栽 培 が 可 能 に な っ た ． し か し ，1 9 8 0 年 代 後 半 に は ， 根 こ ぶ 病 菌 の レ ー ス 分 化 が 原 因 と 考 え ら れ る C R 品 種 の 罹 病 化 が 認 め ら れ る よ う に な っ た ． 同 一 の C R 品 種 で も 栽 培 地 域 に よ り 罹 病 程 度 が 異 な る よ う に な っ た の で ， 様 々 な C R 品 種 の 育 成 と 栽 培 が 試 み ら れ た ． 新 品 種 の 育 成 に は ， C R 遺 伝 子 の 導 入 が 必 須 と な り ， 多 数 の C R 品 種 が 育 成 販 売 さ れ る に 至 っ た ． 一 方 ， 消 費 者 ニ ー ズ の 観 点 か ら は ， 近 年 の 健 康 志 向 に よ る 緑 黄 色 野 菜 へ の 関 心 が 高 ま り ， ハ ク サ イ で も 球 内 色 が 黄 色 の も の が 好 ま れ る よ う に な っ て き た ． 更 に 量 販 店 に お い て は ，1 / 2 ， 1 / 4 と い っ た カ ッ ト 包 装 し た 形 態 で の 販 売 が 一 般 的 に な り ， ハ ク サ イ の 球 内 の 外 観 形 質 も 重 要 に な っ た ． ま た 加 工 用( 浅 漬 け ) と し て も 同 様 に ， 球 内 色 が 黄 色 で あ る こ と が 求 め ら れ る よ う に な っ た ． こ う し た こ と か ら ， 球 内 色 が 黄 色 の 黄 芯 系 ハ ク サ イ が 現 在 の 品 種 の 主 流 と な っ て い る ． 雑 種 強 勢 を 利 用 し た 一 代 雑 種 育 種 法 は ， 多 く の 他 殖 性 作 物 種 に 適 用 さ れ ， 現 在 で は ， 野 菜 の 販 売 品 種 の ほ と ん ど が 一 代 雑 種( F1) 品 種 と な っ て い る ． ハ ク サ イ を 含 む ア ブ ラ ナ 科 作 物 も 同 様 にF1品 種 が 主 流 で あ る ． 自 殖 弱 勢 を 示 す ア ブ ラ ナ 科 作 物 で は ， 実 用 的 に 支 障 の な い 程 度 に 雑 種 性 を も た せ て 育 成 し た 固 定 種 の 品 種 が 利 用 さ れ た が ， 近 年 で は ほ と ん ど の 品 種 がF1品 種 に 替 わ っ て い る ．F1品 種 は 固 定 種 と 比 較 し て ， 雑 種 強 勢 に よ る 生 産 性 の 向 上 と 生 産 物 の 斉 一 性 が 高 い と い う 長 所 が あ る ．F1品 種 育 成 の た め に は ， そ の 両 親 と な る 遺 伝 的 に 固 定 し た 純 系 が 必 要 で ， 純 系 の 育 成( 固 定 化 ) に は 一 般 に 7 ～ 8 世 代 ， あ る い は そ れ 以 上 の 自 殖 が 必 要 と な る ． 例 え ば ，2 つ の 育 種 素 材 の そ れ ぞ れ か ら 2 つ の 目 的 形 質 を 導 入 し た 新 品 種 を 育 成 す る 場 合 に は ， 両 者 を 交 雑 し たF1の 自 殖 後 代 の 中 か ら 2

つ の 目 的 形 質 を 併 せ も つ も の を 選 抜 し な が ら 世 代 を 進 め て 固 定 度 を 高 め て い く こ と に な る ． こ の 場 合 に は ， 純 系 の 育 成 に は 7 ～ 8 年 以 上 を 要 す る ． こ の 後 ， 試 験 交 配 に よ るF１組 合 せ 検 定 能 力 試 験 を 行 っ て 有 望 なF1組 合 せ を 選 定 し ， 産 地 適 応 性 試 験 を 経 て 新 品 種 に 至 る ． つ ま り ， こ の よ う な 交 雑 育 種 に よ るF1品 種 の 育 成 に は 1 0 年 以 上 の 長 い 年 月 を 要 す る こ と に な る ． 一 方 ， 半 数 体 植 物 は ， コ ル ヒ チ ン を 用 い た 薬 剤 処 理 に よ り 染 色 体 を 人 為 的 に 倍 加 す る と ， 直 ち に ゲ ノ ム 全 体 が 遺 伝 的 に 同 型 接 合 の 純 系 で あ る 倍 加 半 数 体( 二 倍 体 ，2 n ) に な る ． す な わ ち ， 2 つ の 育 種 素 材 の 交 雑 F1も し く は そ の 後 代 の 選 抜 植 物 か ら 十 分 量 の 倍 加 半 数 体( 純 系 ， 2 n ) を 作 成 し て 目 的 形 質 を も つ 純 系 を 選 抜 す れ ば ， 短 期 間 に 異 型 接 合 個 体 を 遺 伝 的 に 固 定 で き る の で ， 育 種 年 限 の 大 幅 な 短 縮 が 可 能 に な る ． ま た ， 染 色 体 セ ッ ト を 1 組 し か 持 た な い 半 数 体 ( n ) は ， 遺 伝 解 析 や 突 然 変 異 の 選 抜 に も 有 効 利 用 で き る ． 半 数 体 は ， 半 数 性 の 細 胞 で あ る 減 数 分 裂 後 の 雌 性 あ る い は 雄 性 配 偶 子 を 再 分 化 さ せ て 作 出 す る ． 半 数 体 を 得 る た め の 主 要 な 手 法 と し て は ， 雄 性 配 偶 子 側 か ら は 葯 培 養 と，未 成 熟 な 花 粉 で あ る 小 胞 子 の み を 単 離 し て 培 養 す る 小 胞 子 培 養 が あ り ， 雌 性 配 偶 子 側 か ら は ， 未 受 精 胚 珠 培 養 ， 放 射 線 に よ り 不 活 化 し た 花 粉 を 交 配 し た 後 に 胚 珠 を 培 養 す る 偽 受 精 胚 珠 培 養 や ， オ オ ム ギ に お い て ， 遠 縁 種(H o r d e u m b u l s u m) の 花 粉 を 交 配 し た 後 に 胚 珠 を 培 養 す る バ ル ボ サ ッ ム 法 が あ る ． こ れ ら の う ち 多 く の 作 物 種 で 成 功 例 が 報 告 さ れ て い る の は 葯 培 養 で あ る ． 葯 培 養 は ，G u h a a n d M a h e s h w a r i ( 1 9 6 4 , 1 9 6 6 ) に よ り 初 め て 報 告 さ れ た ． 彼 ら は ， チ ョ ウ セ ン ア サ ガ オ (D a t u r a i n n o x i a) の 葯 培 養 を 試 み ， 小 胞 子 の 一 部 が 細 胞 分 裂 を 開 始 し て 不 定 胚 に 発 達 し ， や が て 半 数 体 が 得 ら れ る こ と を 報 告 し た ． 続 け て ， タ バ コ(N i c o i t i a n a t a b a c u m) と N i c o i t i a n a s y l v e s t r i s の 葯 培 養 に お い て も 小 胞 子 か ら 不 定 胚 を 形 成 さ せ て 半 数 性 の 植 物 体 を 得 ， こ の 倍 加 に よ っ て 同 型 接 合 体 が 得 ら れ る こ と が 確 認 さ れ た( B o u r g i n a n d N i t s c h , 1 9 6 7 ) ． こ

う し て ， 葯 培 養 に よ る 小 胞 子 か ら の 半 数 体 作 出 が 確 実 な も の と な り ， 多 く の 有 用 作 物 に お い て 葯 培 養 に 関 す る 研 究 が 行 わ れ る よ う に な っ た ． さ ら に ， 葯 培 養 か ら 進 展 し て 葯 の 中 の 小 胞 子 を 単 離 し て 培 養 す る 小 胞 子 培 養 技 術 が ， タ バ コ(N . t a b a c u m) と N i c o i t i a n a r u s t i c a ( I m a m u r a e t a l. 1 9 8 2 ) ， 西 洋 ナ タ ネ (B r a s s i c a n a p u s; L i c h t e r 1 9 8 2 ) ， ト ウ モ ロ コ シ (Z e a m a y s; C o u m a n s e t a l. 1 9 8 9 , P e s c i t c l l i e t a l. 1 9 8 9 ) お よ び オ オ ム ギ （H o r d e u m v u l g a r e; H o e k s t r a e t a l. 1 9 9 3 ) で 開 発 さ れ て い る ． 小 胞 子 培 養 は ， 葯 培 養 と 比 較 し て 以 下 の よ う な 長 所 が あ る ．( 1 ) 培 養 操 作 の 簡 易 性 ： 材 料 と な る 蕾 の サ イ ズ が 小 さ い 場 合( ハ ク サ イ の で は 長 さ 2 ～ 3 m m ) ， 葯 培 養 で は ， 実 体 顕 微 鏡 下 で ピ ン セ ッ ト を 用 い て ， 蕾 の 中 か ら 葯 の み を 摘 出 す る 細 か い 操 作 が 必 要 で あ る ． 一 方 ， 小 胞 子 培 養 で は 蕾 を 培 養 液 中 で 押 し つ ぶ し て 小 胞 子 を 遊 離 さ せ る ． し た が っ て ， 葯 培 養 の よ う な 煩 雑 な 操 作 を 必 要 と し な い の で ， 作 業 性 と 培 養 処 理 能 力 が 格 段 に 向 上 す る ．( 2 ) 葯 壁 の 体 細 胞 由 来 の 組 織 か ら 再 分 化 植 物 が 混 入 す る 危 険 性 を 排 除 で き る ．( 3 ) 葯 組 織 内 に ， 不 定 胚 形 成 に 対 す る 阻 害 物 質 が あ る 場 合 に は ， こ れ を 排 除 で き ， ま た 培 地 成 分 を 直 接 作 用 さ せ る こ と が 可 能 に な る ．( 4 ) 小 胞 子 を 直 接 培 養 す る の で 観 察 が 容 易 で ， 不 定 胚 形 成 機 構 に 関 与 す る 要 因 の 研 究 に 有 効 で あ る ． 一 方 ， 小 胞 子 培 養 に は 次 の よ う な 短 所 も あ る ．( 1 ) 一 般 的 に 葯 培 養 に 比 べ て 成 功 例 が 少 な い ． ( 2 ) 葯 壁 に 保 護 さ れ て い な い の で ， 外 的 な 環 境 要 因 の 影 響 を 直 接 受 け る ． し た が っ て ， 単 離 操 作 や 培 養 の 環 境 条 件 に 高 い 精 度 が 要 求 さ れ る ．( 3 ) 一 度 に 大 量 の 材 料 の 培 養 が 可 能 だ が ， コ ン タ ミ ネ ー シ ョ ン が 生 じ た 場 合 に は ， 同 一 の 培 養 集 団 の 全 て が 無 駄 に な る 危 険 性 が あ る ． ア ブ ラ ナ 属(B r a s s i c a) 植 物 に お い て も ， 半 数 体 作 出 に 関 し て 多 く の 研 究 が 行 わ れ た ． 雌 性 配 偶 子 か ら の ア プ ロ ー チ と し て ， 偽 受 精 胚 珠 培 養 に よ る 半 数 体 作 出 が

キ ャ ベ ツ(B r a s s i c a o l e r a c e a) で 報 告 さ れ て い る ( D o r ë 1 9 8 9 ) が ， 雄 性 配 偶 子 か ら の ア プ ロ ー チ で あ る 葯 培 養 や 小 胞 子 培 養 に 関 す る 報 告 が 大 多 数 で あ る ． 葯 培 養 に よ る 半 数 体 の 作 出 が ， キ ャ ベ ツ(B r a s s i c a o l e r a c e a) で 最 初 に 報 告 さ れ た( K a m e y a a n d H i n a t a 1 9 7 0 ) 後 ， 西 洋 ナ タ ネ (B . n u p u s; T h o m a s a n d We n z e l , 1 9 7 5 , B . c a m p e s t r i s; K e l l e r e t a l. 1 9 7 5 ) で 報 告 さ れ た ． さ ら に ， 葯 培 養 に お い て 培 養 初 期 の 高 温 処 理( 3 5 ℃ ， 1 ～ 3 日 ) が 不 定 胚 形 成 を 著 し く 促 進 す る こ と が 報 告( K e l l e r a n d A r m s t r o n g 1 9 7 9 ) さ れ て 以 来 ， 西 洋 ナ タ ネ を 中 心 に し て ， 葯 培 養 に よ る 半 数 体 作 出 に お け る ， 品 種 ・ 系 統 間 差 ， 供 試 材 料 の 生 理 的 条 件 ， 培 地 ・ 培 養 条 件 に 関 す る 研 究 が 盛 ん に 行 わ れ た ． 西 洋 ナ タ ネ 以 外 で は ， ケ ー ル(B r a s s i c a o l e r a c e a； K e l l e r a n d A r m s t r o n g 1 9 8 1 ) ， キ ャ ベ ツ ( D o r e a n d B o u l i d a r d 1 9 8 8 ) ， ハ ク サ イ (B . r a p a; S a t o e t a l. 1 9 8 9 a ) ， ブ ロ ッ コ リ ー(B . o l e r a c e a； K e l l e r a n d A r m s t r o n g 1 9 8 3 , O r t o n a n d B r o w e r s 1 9 8 5 ) ， カ リ フ ラ ワ ー (B . o l e r a c e a；P h i p p e n a n d O c k e n d o n 1 9 9 0 ) ， コ モ チ カ ン ラ ン(B . o l e r a c e a；O c k e n d o n 1 9 8 4 ) ， ク ロ ガ ラ シ (B . n i g r a; G o v i l e t a l. 1 9 8 6 ) や ， カ ラ シ ナ(B . j u n c e a; G e o r g e a n d R a o 1 9 8 2 ) に つ い て 検 討 ・ 報 告 さ れ た ． 小 胞 子 培 養 に つ い て は ， L i c h t e r ( 1 9 8 2 ) が 西 洋 ナ タ ネ (B . n a p u s) で 最 初 に 報 告 し て 以 来 ， 不 定 胚 形 成 の 効 率 向 上 が 検 討 さ れ た( G l a n d e t a l. 1 9 8 8 , P e c h a n a n d K e l l e r 1 9 8 8 , K o t t e t a l. 1 9 8 8 ) ． 西 洋 ナ タ ネ 以 外 で も ， ハ ク サ イ ( S a t o e t a l . 1 9 8 9 b ) ， キ ャ ベ ツ ( L i c h t e r 1 9 8 9 , C a o e t a l. 1 9 9 0 ) ， ブ ロ ッ コ リ ー ( Ta k a h a t a a n d K e l l e r 1 9 9 1 ) や ， ラ フ ァ ナ ス 属 (R a p h a n u s) 植 物 の ダ イ コ ン (R a p h a n u s s a t i v u s; L i c h t e r 1 9 8 9 , Ta k a h a t a e t a l. 1 9 9 6 ) で 報 告 さ れ ， 半 数 体 作 出 技 術 は 葯 培 養 か ら 小 胞 子 培 養 へ と 進 展 し た ． 一 方 ， ハ ク サ イ で は ， 半 数 体 作 出 に 関 す る 報 告 は ナ タ ネ に 比 べ て 少 な い ． 松 本 と 長 瀬 ( 1 9 8 4 ) は ， ハ ク サ イ の 葯 培 養 に よ る 半 数 体 作 出 に つ い て 報 告 し た が ， そ の 不 定 胚 形 成 効 率 は 非 常 に 低 か っ た ． そ の 後 ，S a t o ら （ 1 9 8 9 a ） は ， 南 方 型 の 捲

心 群 の 中 に 高 い 不 定 胚 形 成 能 を も つ 品 種 が あ る こ と を 見 出 し た が ， 不 定 胚 か ら の 植 物 体 再 分 化 の 効 率 が 低 か っ た ． さ ら に ， 佐 藤 ら( 1 9 8 9 c ) は ， 再 分 化 条 件 の 改 良 に つ い て 報 告 し た ． ま た ，H a m a o k a ら は ， ハ ク サ イ の 葯 培 養 に お け る 不 定 胚 形 成 過 程 の 小 胞 子 の 分 裂 様 式( 1 9 9 1 a ) お よ び 再 分 化 植 物 の 倍 数 性 の 簡 易 な 識 別 方 法( 1 9 9 1 b ) に つ い て 報 告 し て い る ． ハ ク サ イ の 小 胞 子 培 養 に つ い て は ，S a t o ら （ 1 9 8 9 b ） が 最 初 に 報 告 し ， そ の 中 で 葯 培 養 と 同 様 に 高 い 不 定 胚 形 成 能 力 を 持 つ 品 種 を 見 出 し た が ， 不 定 胚 か ら の 植 物 体 再 分 化 効 率 が 低 く ， 半 数 体 の 作 出 効 率 は 低 か っ た ． そ の 後 ，K u g i n u k i ら( 1 9 9 7 ) は ， 不 定 胚 形 成 率 と 不 定 胚 か ら の 植 物 体 再 分 化 率 の 両 方 に 品 種 間 差 が あ る こ と を 報 告 し て い る ． 半 数 体 育 種 は ，N a k a m u r a ら ( 1 9 7 4 ) が ， タ バ コ で 最 初 に 葯 培 養 に よ り 実 用 品 種 を 育 成 し ， 同 グ ル ー プ は そ の 後 も ，5 つ の 品 種 を 育 成 し た （ 角 谷 ， 神 代 1 9 8 5 ） ． そ の 中 の １ 品 種 で あ る ‘ つ く ば 1 号 ’ は 現 在 で も 関 東 地 方 を 中 心 と し て 栽 培 さ れ て い る ． コ ム ギ( D e B u y s e r a n d H e n r y 1 9 8 6 ) や イ ネ ( 藤 田 1 9 8 7 ) お よ び オ オ ム ギ ( F o r o u g h i - We h r a n d F r i e d t 1 9 8 2 ) で も 半 数 体 育 種 法 に よ る 新 品 種 ・ 系 統 の 育 成 が 報 告 さ れ て い る ． 中 国 で も イ ネ お よ び コ ム ギ の 半 数 体 育 種 が 盛 ん に 行 わ れ ， 葯 培 養 に よ り 多 く の 品 種 が 育 成 ・ 栽 培 さ れ て い る( 島 田 1 9 9 1 ) ． ア ブ ラ ナ 属(B r a s s i c a) 植 物 に お い て も ， 倍 加 半 数 体 を 利 用 し た 育 種 が 盛 ん に 行 わ れ て お り ， 西 洋 ナ タ ネ( C h a r n e a n d B e v e r s d o r f 1 9 8 8 ) や ブ ロ ッ コ リ ー ( F a r n h a m e t a l . 1 9 9 8 ) ， ハ ク サ イ ( 湊 ら 1 9 8 8 ) で 品 種 育 成 の 可 能 性 が 示 さ れ た ． こ の よ う に 半 数 体 育 種 法 は ， 実 用 が 可 能 で 育 種 の 固 定 操 作 の 期 間 短 縮 の 点 で は 非 常 に 優 れ た 技 術 で あ る ． し か し ， い く つ か の 大 き な 問 題 点 が あ り ， そ の 普 及 を 困 難 に し て い る ． 葯 培 養 や 小 胞 子 培 養 の 実 用 化 を 妨 げ て い る 最 大 の 要 因 は ， 小

胞 子 か ら の 不 定 胚 形 成 率 の 低 さ で あ る ． タ バ コ で は 高 い 頻 度 で 小 胞 子 由 来 の 不 定 胚 が 得 ら れ ， 通 常 の 栽 培 品 種 ・ 系 統 間 で も 不 定 胚 形 成 率 に 極 端 な 差 は 認 め ら れ な い が ， 他 の 多 く の 作 物 で は 非 常 に 低 い 頻 度 で し か 不 定 胚 は 得 ら れ ず ， 作 業 効 率 も 低 い( S a n g w a n a n d S a n g w a n - N o r r e l 1 9 9 0 ) ． ま た ， 同 一 作 物 で も 小 胞 子 か ら の 不 定 胚 形 成 に は 品 種 や 系 統 間 で 著 し い 差 が 生 じ ， 同 一 品 種 で も 材 料 植 物 の 生 育 環 境 や 生 理 状 態 に よ り 変 動 す る こ と （K e l l e r e t a l. 1 9 8 7 ） が 問 題 で あ る ． 他 に も 小 胞 子 か ら 不 定 胚 や カ ル ス か ら の 植 物 体 再 分 化 が 困 難 で あ る こ と ( K e l l e r e t a l. 1 9 8 4 ） ， 異 数 体 が 出 現 す る こ と ( C h e n 1 9 8 6 ) ， ア ル ビ ノ や 小 型 化 と い っ た ， 好 ま し く な い 形 質 の 突 然 変 異 が 生 じ る 場 合 が あ る こ と( O i n u m a a n d Yo s h i d a 1 9 7 4 , B u r k a n d M a t z i n g e r 1 9 7 6 ) ， 遺 伝 的 に 純 系 で あ る は ず の 倍 加 半 数 体 系 統 の 中 で 変 異 が 生 じ る 場 合 が あ る こ と( K u m a s h i r o a n d O i n u m a 1 9 8 5 ) も 実 用 化 を 妨 げ て い る 要 因 で あ る ． こ の よ う に ， 半 数 体 育 種 法 を 実 用 化 す る た め に は ， 小 胞 子 か ら の 不 定 胚 形 成 頻 度 を 向 上 さ せ る こ と が 最 大 の 課 題 と な る ． 西 洋 ナ タ ネ の 場 合 ， 小 胞 子 培 養 に よ る 不 定 胚 形 成 は ， 不 定 胚 形 成 能 の 高 い 品 種 ・ 系 統 を 材 料 に す る こ と( C h u o n g e t a l. 1 9 8 8 ) ， 培 地 組 成 の 改 良 ( C h a r n e a n d B e v e r s d o r f 1 9 8 8 ) ， お よ び 培 養 に 適 し た 発 達 ス テ ー ジ の 小 胞 子 を 含 む 蕾 を 正 確 に 選 定( K o t t a n d B e v e r s d o r f 1 9 8 8 ) す る こ と に よ り 大 幅 に 改 善 さ れ ， 実 用 的 な 技 術 レ ベ ル に 達 し て い る と 思 わ れ る ． し か し ， ハ ク サ イ で は ， 西 洋 ナ タ ネ に 比 べ て 小 胞 子 か ら の 不 定 胚 形 成 率 が 低 い と い っ た 問 題 が 残 さ れ て い る ． 不 定 胚 が 全 く 得 ら れ な い 品 種 が 供 試 2 5 品 種 中 1 2 品 種 で あ っ た( K u g i n u k i e t a l. 1 9 9 7 ) と い う 事 実 か ら ， 不 定 胚 形 成 に は 著 し い 品 種 ・ 系 統 間 差 が 存 在 す る こ と も 問 題 で あ る ． 一 部 に は 不 定 胚 形 成 率 が 非 常 に 高 い ハ ク サ イ 品 種 が 見 出 さ れ て い る も の の ， 日 本 で 主 に 栽 培 さ れ て い る 品 種 群 と は 生 理 的 ， 形 態 的 特 性 が 大 き く 異 な る の で ， 品 種 育 成 に 直 接 利 用 す る こ と は で き な い ． ハ ク サ イ の 葯 培 養 を 用 い た 新 品 種 育 成 が 報 告 さ れ た( 湊 ら 1 9 8 8 ) 中 で も ， 不

定 胚 形 成 率 は 低 く( 葯 当 た り の 不 定 胚 形 成 率 0 ～ 7 ％ ) ， 育 種 方 法 の ひ と つ と し て 一 般 的 に 利 用 で き る 段 階 に は ま だ 達 し て い な い ． 本 研 究 で は ， ハ ク サ イ の 半 数 体 育 種 法 の 効 率 化 を 目 的 と し て ， １ ． 葯 ・ 小 胞 子 培 養 を 用 い た 倍 加 半 数 体 作 出 効 率 の 向 上 ， ２ ． 交 配 育 種 を 行 う 上 で 必 要 と な る 成 熟 花 粉 の 保 存 技 術 に つ い て 検 討 ， ３ ． 倍 加 半 数 体 を 用 い た 半 数 体 育 種 法 の 実 用 性 を 検 証 す る た め ， 目 的 の 形 質 を も つ 選 抜 系 統 か ら 優 良 品 種 の 育 成 を 行 っ た ． 育 種 目 標 は ， 根 こ ぶ 病 抵 抗 性( C R ) を 有 し 球 内 色 が 既 存 品 種 よ り も 黄 色 が 強 く ， 鮮 や か に 拡 が る と い う 特 性 を も つ 品 種 の 育 成 で あ る ． 倍 加 半 数 体 作 出 の 過 程 は ，1 ) 小 胞 子 か ら の 不 定 胚 形 成 ， 2 ) 不 定 胚 か ら の 再 分 化 ， 3 ) 発 根 ， 4 ) 順 化 ， 5 ) 倍 数 性 確 認 と 倍 加 処 理 ， お よ び6 ) 自 殖 に よ る 採 種 と 主 要 な 6 つ の 段 階 か ら な る ． 本 章( 緒 言 ) に 続 く 第 ２ 章 で は ， 葯 ・ 小 胞 子 培 養 に よ る 倍 加 半 数 体 の 作 出 に つ い て 検 討 し た ． 第 １ 節 で は ， 小 胞 子 培 養 に お け る 不 定 胚 形 成 率 に 対 す る 材 料 蕾 あ る い は 花 序 の 低 温 前 処 理 の 効 果 を 検 討 し ， 第 ２ 節 で 蕾 の 低 温 処 理 中 の 蕾 の 中 に 含 ま れ る 小 胞 子 の 発 達 に つ い て 調 査 す る こ と に よ り ， 低 温 前 処 理 の 効 果 発 現 メ カ ニ ズ ム を 検 討 し た ． 第 ３ 節 で は ， 品 種 育 成 途 中 の 選 抜 個 体 か ら 倍 加 半 数 体 獲 得 を 目 指 す 場 合 を 想 定 し ， 温 室 で 栽 培 し た 1 個 体 の 材 料 植 物 か ら ， 獲 得 で き る 不 定 胚 数 を 確 認 し た ． 第 ４ 節 で は ， 葯 ・ 小 胞 子 培 養 に よ り 得 ら れ る 再 分 化 植 物 体 の 倍 数 性 を 調 査 し ， 培 養 法 や 品 種 ・ 系 統 に よ っ て 自 然 倍 加 頻 度 が 異 な る こ と を 明 ら か に す る と と も に ， 自 然 倍 加 の 発 生 時 期 を 探 っ た ． 第 ３ 章 で は ， 優 良 倍 加 半 数 体 系 統 の 育 成 に つ い て 検 討 し た ． 第 1 節 で は 半 数 体 育 種 の 実 用 場 面 で の 技 術 と し て ， 花 粉 の 保 存 に 関 す る 検 討 を 行 っ た ． こ れ は ， 開 花 期 の 異 な る 系 統 間 の 交 配 を 可 能 に す る 技 術 で あ り ， 葯 ･ 小 胞 子 培 養 に よ っ て 得 ら れ る 再 分 化 植 物 の 開 花 時 期 が 個 体 ご と に 非 常 に 変 動 す る の で ， こ れ ら の 間 で 交 配 を 試 み る 場 合 に は 必 要 な 技 術 で あ る ． 第 １ 項 で は i n v i t r o で の 花 粉 発

芽 能 を 指 標 と す る 花 粉 の 活 性 検 定 法 を 確 立 し ， 第 ２ 項 で は こ の 検 定 法 を 用 い て 花 粉 の 保 存 条 件 に つ い て 検 討 し た ． ま た ， 第 ３ 項 に お い て 保 存 花 粉 の 受 精 能 力 と 自 家 不 和 合 性 の 保 持 に つ い て 確 認 し た ． そ し て 第 ２ 節 で は ， 開 発 し た 半 数 体 育 種 の 実 用 化 に つ い て 検 討 す る た め に ， 材 料 植 物 の 選 定 か ら 倍 加 半 数 体 の 作 出 と 選 抜 ， そ し て 選 抜 さ れ た 倍 加 半 数 体 系 統 を 用 い た 品 種 育 成 を 試 み た ． 第 １ 項 で は 市 販F1品 種 を 材 料 に し た 葯 培 養 に よ る 倍 加 半 数 体 の 作 出 とF1新 品 種 の 育 成 を 行 い ， 第 ２ 項 で はF1品 種 の 自 殖 後 代( F2) を 栽 培 し て 目 的 形 質 を も つ 個 体 を 選 抜 し ， こ の 選 抜 個 体 を 材 料 に し た 倍 加 半 数 体 を 作 出 し てF1新 品 種 を 育 成 し た ． 最 後 に 第 ４ 章 に お い て 本 研 究 の 結 果 を 科 学 性 ， 実 用 性 ， 将 来 性 の 面 か ら 総 合 的 に 考 察 し た ．

第 ２ 章 葯 お よ び 小 胞 子 培 養 に よ る 倍 加 半 数 体 の 作 出

第 １ 節 小 胞 子 培 養 に お け る 不 定 胚 形 成 率 に 対 す る 材 料 蕾 あ る い は 花 序 の 低 温 前 処 理 効 果 半 数 体 育 種 で は ， 倍 加 半 数 体 を で き る だ け 効 率 よ く 多 数 獲 得 で き る こ と が 望 ま し い ． 倍 加 半 数 体 の 獲 得 に お い て 最 も 不 確 定 で 困 難 な 過 程 は 葯 ・ 小 胞 子 培 養 に お け る 不 定 胚 形 成 で あ る ． 不 定 胚 形 成 は ， 材 料 植 物 の 遺 伝 子 型 ， 生 育 条 件 ， 小 胞 子 の 発 達 ス テ ー ジ ， 培 養 す る 培 地 の 組 成 ， 培 養 条 件 な ど の 多 数 の 要 因 に よ り 影 響 を 受 け る ． ア ブ ラ ナ 属 (B r a s s i c a) 植 物 で は ， 培 養 開 始 時 に 3 0 ～ 3 5 ℃ で 1 ～ 3 日 間 ヒ ー ト シ ョ ッ ク 処 理 後 ， 2 5 ℃ に 移 し て 培 養 す る と ， 不 定 胚 形 成 が 著 し く 促 進 さ れ る こ と が 報 告 さ れ て い る （ K e l l e r a n d A r m s t r o n g 1 9 7 9 , 1 8 8 3 , C o n s t a n t i n e e t ａ ｌ ． 1 9 9 6 , Ｔ ａ ｋ ａ ｈ ａ ｔ ａ 1 9 9 7 ） ． ハ ク サ イ （B r a s s i c a r a p a s u b s p . p e k i n e n s i s L . ） に お け る 葯 ・ 小 胞 子 培 養 中 の ヒ ー ト シ ョ ッ ク 処 理 は ， 一 般 的 な 標 準 法 に な っ て い る （S a t o e t a l. 1 9 8 9 a , K u g i n u k i e t a l. 1 9 9 7 , Z h a n g a n d Ta k a h a t a 1 9 9 9 ） ． 一 方 ， 培 養 前 の 植 物 体 ， 花 序 や 蕾 に 対 す る 各 種 の 前 処 理 も ま た ， 不 定 胚 形 成 に 影 響 を 与 え る こ と が 知 ら れ て い る ． ア ブ ラ ナ 属 (B r a s s i c a) 植 物 で は ， 培 養 前 の 蕾 へ の 減 圧 処 理 （ K l i m a s z e w k a a n d K e l l e r 1 9 8 3 ） ， 低 線 量 の ガ ン マ 線 処 理 （ M a c D o n a l d e t a l. 1 9 8 8 ） ， コ ル ヒ チ ン 処 理 （Z e k i a n d D i c k i n s o n 1 9 9 1 ） お よ び エ タ ノ ー ル 処 理 ( P e c h a n a n d K e l l e r 1 9 8 9 ) 等 が ， 不 定 胚 形 成 に 効 果 が あ る と 報 告 さ れ て い る ． 採 取 し た 穂 へ の 低 温 前 処 理 は ， オ オ ム ギ や コ ム ギ の 葯 ・ 小 胞 子 培 養 で は 一 般 的 に 用 い ら れ て い る （C o n s t a n t i n e e t a l. 1 9 9 6 ） が ， ア ブ ラ ナ 属 (B r a s s i c a) 植 物 で は ， そ の 効 果 は 明 確 で は な く ， ナ タ ネ や ハ ク サ イ で は 一 般 的 に は 用 い ら れ て い な い （K e l l e r 1 9 8 4 ） ． そ こ で 本 節 で は ， ハ ク サ イ の 小 胞 子 培 養 に お け る ， 不 定 胚 形 成 率 に 対 す る 材 料 蕾 あ る い は 花 序 の 低 温 前 処 理 の 効 果 に つ い て 調 査 し た ．

第 １ 項 共 通 の 方 法 材 料 植 物 の 栽 培 播 種 約 2 週 間 後 の 実 生 を 4 ℃ の 低 温 室 に 移 し ， 連 続 照 明 下 （ 白 色 蛍 光 灯 ， 約 2 0 μ m o l m -2 _{s -}1_{） で ， 約 3 0 日 間 の 春 化 処 理 を 行 っ た ． そ の 後 ， 1 / 2 0 0 0 ワ グ} ネ ル ポ ッ ト に 移 植 し ， 昼 温 2 3 ℃ ， 夜 温 1 7 ℃ の 温 室 内 で 栽 培 し た ． 抽 台 開 花 後 の 植 物 体 か ら 花 序 を 順 次 採 取 し て 供 試 し た ． 小 胞 子 培 養 採 取 し た 花 序 か ら ， 幅 1 . 5 ～ 2 . 0 m m の 蕾 を 集 め ， 蕾 内 の 葯 長 と 花 弁 長 の 比 が ， 0 . 5 ～ 0 . 7 の 蕾 ( F i g u r e 2 - 1 . ) を 選 定 し た ． こ れ ら の 蕾 の 中 に 含 ま れ る 小 胞 子 の 発 達 ス テ ー ジ は 主 に 一 細 胞 期 後 期 で あ る が ， 材 料 植 物 の 生 育 状 態 に よ っ て 大 き さ の 異 な る 栄 養 細 胞 と 生 殖 細 胞 の 2 つ か ら な る 二 細 胞 期 前 期 の 小 胞 子 が 含 ま れ る こ と も あ る( F i g u r e 2 - 2 . ) ． 予 備 的 な 試 験 か ら ， 一 細 胞 期 後 期 の ス テ ー ジ の 小 胞 子 が 高 い 不 定 胚 形 成 能 を 持 つ こ と を 確 認 し た ． 小 胞 子 培 養 は S a t o ら ( 1 9 8 9 c ) の 方 法 に 若 干 の 変 更 を 加 え て 行 っ た ． 培 養 に 用 い た す べ て の 培 地 は ，0 . 2 2 μ m メ ッ シ ュ の 滅 菌 フ ィ ル タ ー で ろ 過 し た ． 選 定 し た 蕾 は 0 . 1 % 塩 化 ベ ン ザ ニ ル コ ウ ニ ウ ム （ オ ス バ ン ） 液 に 3 0 秒 間 浸 漬 後 ， 1 ％ サ ラ シ 粉 溶 液 に1 5 分 間 浸 漬 し て 表 面 殺 菌 し ， そ の 後 ， 滅 菌 水 で 3 回 洗 浄 し た ． 殺 菌 し た 蕾 を ，1 3 ％ シ ョ 糖 を 含 み ， L - グ ル タ ミ ン ， L - セ リ ン と 植 物 成 長 調 節 物 質 を 含 ま な い 修 正 B 5 培 地 （ K e l l e r a n d A r m s t r o n g 1 9 7 9 ） に 置 床 し た ． 以 下 m B 5 - 1 3 培 地 ( Ta b l e 2 - 1 ) と 称 し ， 滅 菌 シ ャ ー レ （ 径 6 c m ， 高 さ 1 . 5 c m ） に 5 m l ず つ 分 注 し た ． 注 射 筒 の 内 筒 を 用 い ， 蕾 を ゆ っ く り と 押 し つ ぶ し て 小 胞 子 を 遊 離 さ せ た 後 ，4 0 μm の ナ イ ロ ン メ ッ シ ュ で ろ 過 し て 残 渣 を 除 い た ． 小 胞 子 懸 濁 液 は ， 1 2 0 g ， 3 分 間 の 遠 心 分 離 後 ， 沈 殿 し た 小 胞 子 を m B 5 - 1 3 培 地 に 再 懸 濁 し て 洗 浄 す る 操 作 を 3 回 繰 り 返 し た ． 小 胞 子 は ， N L N - 1 3 培 地 （ L i c h t e r 1 9 8 2 ； Ta b l e 2 - 1 の

F i g u r e 2 - 1. F l o w e r b u d s o f B r a s s i c a r a p a s u b s p . p e k i n e n s i s L . o f w h i c h p e t a l a n d a n t h e r l e n g t h r a t i o ( P / A ) i s a b o u t 0 . 5 . W h o l e b u d ( t o p r i g h t ) , r e m o v e d c a l y x ( t o p l e f t ) a n d s i x a n t h e r s f r o m t h e s a m e b u d ( b o t t o m ) .

F i g u r e 2 - 2 . M i c r o s p o r e s o f B r a s s i c a r a p a s u b s p . p e k i n e n s i s a t a l a t e u n i c e l l u l a r s t a g e ( 1 C L , l e f t ) a n d a b i c e l l u l a r s t a g e ( 2 C U , r i g h t ) .

Table 2-1. Composition of culture media for microspore culture (mg/l).

Component

mB5-13

NLN-13

KNO

3

2500

125

NaH

2

PO

4

･

H

2

O

150

(NH

4

)

2

SO

4

134

MgSO

4

･

7H

2

O

250

125

CaCl

2

･2H

2

O

750

Ca(NO

3

)･4H

2

O

5

MnSO

4

･

H

2

O

10

ZnSO

4

･

7H

2

O

2

CuSO

4

･

5H

2

O

0.025

0.025

CoCl

2

･

6H

2

O

0.025

0.025

KI

0.75

0.75

H

3

BO

3

3

10

Na

2

MoO

4

･2H

2

O

0.25

0.25

FeSO

4

･7H

2

O

27.8

27.85

Na

2

-EDTA

37.3

37.25

Inositol

100

100

Nicotinic acid

1

5

Prydoxin-HCl

1

0.5

Thiamine-HCl

10

0.5

Folic acid

0.5

Glycine

2

Biotin

0.05

Glutamine

800

Serine

100

Glutathione

30

Sucrose

130,000

130,000

6-benzyladenine (BA)

0.3

The medium was adjusted to pH 6.0 and sterilized by filteration.

00

25

10

N L N 培 地 を 基 本 と し た も の ) に ， 5 × 1 04 _{/ m l の 密 度 に な る よ う に 調 整 し ， 滅 菌 シ} ャ ー レ （ 径 6 c m ， 高 さ 1 . 5 c m ） に 2 m l ず つ 分 注 し た ． こ れ を 暗 黒 下 3 3 ℃ の イ ン キ ュ ベ ー タ ー 内 で 2 4 時 間 静 置 し た ( 高 温 処 理 ) 後 ， 2 5 ℃ 暗 黒 下 で 培 養 し た ． 培 養 を 開 始 し て か ら 約 4 週 間 後 に 不 定 胚 の 発 生 数 を 調 査 し た ． 各 処 理 区 2 5 蕾 以 上 か ら 小 胞 子 を 単 離 し ，5 シ ャ ー レ に 分 け て 培 養 し ， そ れ ら の 結 果 を 平 均 値 で 示 し た ． 低 温 前 処 理 花 序 の 前 処 理 ： 材 料 植 物 か ら 採 取 し た 花 序 を 長 さ 1 0 c m 程 度 に 切 り 揃 え ， 蒸 留 水 を 約 3 c m の 深 さ に 入 れ た ビ ー カ ー に 花 茎 を 挿 し ， 0 ， 3 も し く は 1 0 日 間 ， 4 ℃ 暗 黒 下 に 静 置 し た ． そ の 後 ， 花 序 か ら 幅 1 . 5 ～ 2 . 0 m m ， 花 弁 長 / 葯 長 が 0 . 5 ～0 . 7 の 蕾 を 集 め て 小 胞 子 培 養 に 供 試 し た ． 蕾 の 前 処 理 ： 材 料 植 物 か ら ， 幅 1 . 5 ～ 2 . 0 m m ， 花 弁 長 / 葯 長 が 0 . 5 ～ 0 . 7 の 蕾 を 集 め ， 前 述 の 通 り 表 面 殺 菌 後 5 m l の ｍ B 5 - 1 3 培 地 を 含 む 滅 菌 シ ャ ー レ に 入 れ ，0 , 3 , 7 , 1 0 , 1 5 も し く は 2 0 日 間 ， 4 ℃ 暗 黒 下 に 静 置 し た ． そ の 後 ， 小 胞 子 培 養 に 供 試 し た ． 第 ２ 項 花 序 あ る い は 蕾 の 低 温 前 処 理 の 効 果 材 料 お よ び 方 法 品 種 ‘ つ ば め ’( （ 株 ） ト ー ホ ク ） を 実 験 材 料 に 供 試 し ， 花 序 あ る い は 蕾 を 0 , 3 お よ び 1 0 日 間 低 温 前 処 理 後 に 小 胞 子 培 養 を 行 い ， 不 定 胚 形 成 を 調 査 し た ． ま た ， 品 種 間 に よ る 差 異 を 調 査 す る た め ， 品 種 ‘W 111 6 ’ ( ( 株 ) 渡 辺 採 種 場 ） ， ‘ 春 さ か り ’ （ ( 株 ) 渡 辺 採 種 場 ） ， ‘ C R - 歓 呼 ’ ( ( 株 ) 日 本 農 林 社 ） お よ び ‘ 春 楽 ’ （ ( 株 ) 日 本 農 林 社 ） を 実 験 材 料 と し ， 花 序 あ る い は 蕾 を 低 温 前 処 理 し た 後 に 小 胞 子 培 養 を 行 い ， 不 定 胚 形 成 を 調 査 し た ．

結 果 品 種 ‘ つ ば め ’ の 花 序 と 蕾 の 0 日 ， 3 日 お よ び 1 0 日 間 の 低 温 前 処 理 の 結 果 を 示 し た( Ta b l e 2 - 2 ) ． 花 序 ， 蕾 と も に 低 温 前 処 理 期 間 が 長 い ほ ど ， 小 胞 子 か ら の 不 定 胚 形 成 率 が 向 上 し た ． 花 序 の 1 0 日 間 処 理 と 蕾 の 3 日 間 お よ び 1 0 日 間 処 理 に お い て ， 無 処 理 区 と 有 意 な 差 が 認 め ら れ た ． 花 序 の 処 理 よ り も 蕾 の 処 理 の 方 が 低 温 前 処 理 に よ る 不 定 胚 形 成 率 の 向 上 効 果 は 大 き か っ た ． 低 温 前 処 理 は ， 他 の 品 種 ， ‘W 111 6 ’ ， ‘ は る さ か り ’ ， ‘ C R 歓 呼 ’ お よ び ‘ 春 楽 ’ で も 不 定 胚 形 成 に 効 果 が あ る こ と を 確 認 し た( デ ー タ 省 略 ) ． 第 ３ 項 蕾 の 0 , 3 , 7 , 1 0 , 1 5 お よ び 2 0 日 間 の 低 温 前 処 理 の 効 果 材 料 お よ び 方 法 品 種 ‘ つ ば め ’ を 供 試 し ， 花 序 あ る い は 蕾 を 0 , 3 , 7 , 1 0 , 1 5 も し く は 2 0 日 間 低 温 前 処 理 し た 後 に 小 胞 子 培 養 を 行 い ， 不 定 胚 形 成 を 調 査 し た ． 結 果 蕾 の 低 温 前 処 理 の 期 間 の 長 さ の 影 響 に つ い て 調 査 し た 結 果 ，7 日 間 以 上 の 低 温 前 処 理 に よ っ て ， 不 定 胚 形 成 率 が 向 上 し た( Ta b l e 2 - 3 ) ． 低 温 前 処 理 を し な い 場 合 に は ， 不 定 胚 形 成 率 は 実 験 ご と に 大 き く 変 動 し た が ( Ta b l e 2 - 2 , 3 ) ， い ず れ の 場 合 で も ， 低 温 前 処 理 に よ り 不 定 胚 形 成 率 の 向 上 効 果 が 認 め ら れ た ． 以 上 の 結 果 か ら ， ハ ク サ イ の 小 胞 子 培 養 に お け る ， 蕾 あ る い は 花 序 の 低 温 前 処 理 は ， い ず れ も 不 定 胚 形 成 率 を 向 上 さ せ た が ， そ の 効 果 は 蕾 処 理 の 方 が 大 き く ， 複 数 の 品 種 で も 同 様 の 効 果 が 認 め ら れ た ． 蕾 処 理 で は ，7 ～ 2 0 日 間 の 前 処 理 効 果 が 最 も 大 き か っ た ．

Table 2-2. Effect of low temperature (4℃) pretreatment

of buds or inflorescence on embryo formation in microspore

culture of

B. rapa

subsp.

pekinensis

L. (Chinese cabbage) cv.

'

Tsubame'

Duration of 4℃

No. of embryos

pretreatment (days)

/ petri dish

No treatment

0

2.0 a

1)

3

3.2 a

10

6.2 b

3

8.2 b

10

31.5 c

In each treatment, microspores were cultured in five petri dishes

at a density of 5 × 10

5

/ ml.

1)

Values followed by the same letters are not significantly

different at 5% level by multiple range test.

Treated organ

Inflorescence

Bud

Table 2-3. Effect of duration of low temperature (4℃)

pretreatment for flower buds on embryo formation in

microspore culture of

B. rapa

subsp.

pekinensis

L.

(Chinese cabbage) cv. 'Tsubame'

Duration of 4℃

No. of embryo

pretreatment (days)

/ petri dish

0

14.8 a

1)

3

14.5 a

7

30.3 b

10

20.4 ab

15

37.5 c

20

32.5 c

1)

Values followed by the same letters are not

第 ４ 項 考 察 ハ ク サ イ の 小 胞 子 培 養 に お い て ， 蕾 ま た は 花 序 の 低 温 前 処 理 は 小 胞 子 か ら の 不 定 胚 形 成 の 効 率 を 向 上 さ せ た ． ア ブ ラ ナ 属 (B r a s i c a ) 植 物 の 葯 ・ 小 胞 子 培 養 に お け る ， 蕾 ま た は 花 序 の 低 温 前 処 理 の 効 果 は ， こ れ ま で の 報 告 で は ， 相 反 す る 結 果 が 示 さ れ て い る ． B . n a p u s ( ナ タ ネ ， L i c h t e r ( 1 9 8 2 ） ，B . j u n c e a ( カ ラ シ ナ ，G e o r g e a n d R a o 1 9 8 2 ) お よ び B . o l e r a c e a ( キ ャ ベ ツ ， O s l i n k e t a l. 1 9 9 3 ） で は ， 低 温 前 処 理 が 小 胞 子 か ら の 胚 形 成 を 促 進 す る と 報 告 さ れ た ． し か し ，B . r a p a （ K e l l e r e t a l. 1 9 8 2 ） と B . n a p u s （ D u n w e l l e t a l. 1 9 8 5 ） で は ， 蕾 の 低 温 前 処 理 が 小 胞 子 か ら の 不 定 胚 形 成 に 阻 害 的 で あ る こ と も 報 告 さ れ て い る ． こ の よ う な 矛 盾 す る 結 果 は ， 低 温 処 理 の 方 法 に 起 因 す る と 推 察 さ れ る ． 阻 害 的 で あ っ た 報 告 で は ， 前 処 理 中 の 蕾 は 密 封 瓶 の 中 （D u n w e l l e t a l. 1 9 8 5 ） ， あ る い は ビ ニ ー ル 袋 に 入 れ ら れ て い た （ K e l l e r e t a l. 1 9 8 2 ） ． 一 方 ， 促 進 効 果 を 示 し た 報 告 で は 前 処 理 中 の 蕾 は 湿 ら せ た 綿 の 上 （O s l i n k e t a l. 1 9 9 3 ） ， あ る い は 液 体 培 地 中 （ L i c h t e r 1 9 8 2 ） に 置 か れ て い た ． 本 節 の 実 験 で は ， 蕾 は 液 体 培 地 に 浮 遊 し た 状 態 で 処 理 し た の で ， 蕾 に 水 分 が 補 給 さ れ て ， 小 胞 子 の 活 性 が 保 持 さ れ た と 考 え ら れ る ． 小 胞 子 培 養 に お け る 不 定 胚 形 成 率 は ， 蕾 の 低 温 前 処 理 を 2 0 日 間 ま で 延 長 し て も 高 く 保 持 さ れ た ． こ れ は ， 蕾 を 3 週 間 程 度 ， 保 存 で き る こ と を 示 唆 し て い る ． 材 料 の 保 存 は ， 小 胞 子 培 養 を 利 用 し た 半 数 体 育 種 で は 極 め て 有 用 で あ る ． 育 種 の 実 際 場 面 お い て ， 培 養 に 供 試 す る 材 料 植 物 は ， 同 時 期 に 一 斉 に 抽 苔 開 花 し て く る 場 合 が 多 い ． そ の 一 方 で ， 小 胞 子 培 養 を 行 う 作 業 量 と 培 養 施 設 に は 制 限 が あ る の で ， 同 時 に で き る 材 料 蕾 の 処 理 数 は 限 定 さ れ る ． こ の よ う な 場 合 ， 材 料 の 保 存 が 可 能 で あ れ ば ， 作 業 の 平 準 化 が 可 能 に な り ， 培 養 作 業 の 効 率 が 向 上 す る こ と に な る ． こ の よ う な 観 点 か ら も ， 低 温 前 処 理 は 有 効 な 技 術 と 判 断 さ れ る ． 実 際 ， 後 述 す る 品 種 育 成 の た め の 倍 加 半 数 体 の 作 出 過 程 に お い て ， こ の 処 理 が 日 常

的 に 利 用 さ れ た ． 第 ２ 節 蕾 低 温 処 理 が 小 胞 子 の 発 達 に お よ ぼ す 影 響 前 節 で は ， ハ ク サ イ 小 胞 子 培 養 の 供 試 蕾 を ，4 ℃ の 低 温 で 3 週 間 程 度 の 保 存 す る こ と が 可 能 な う え ， 不 定 胚 形 成 率 が 向 上 す る こ と を 明 ら か に し た ． 各 種 の シ ョ ッ ク 処 理 が 小 胞 子 の 発 達 に 及 ぼ す 影 響 の ひ と つ と し て ， 高 温 処 理 は 注 目 さ れ て い て ， ハ ク サ イ の 葯 培 養 ( H a m a o k a e t a l. 1 9 9 1 a ) と ナ タ ネ の 小 胞 子 培 養 ( F a n e t a l. 1 9 8 8 , S i m m o n d s e t a l. 1 9 9 9 ) で 報 告 さ れ て い る ． し か し ， ハ ク サ イ で は ， 低 温 処 理 下 で 小 胞 子 が ど の よ う に 発 達 す る か を 報 告 し た 例 は な い ． そ こ で 本 節 で は ， 低 温 前 処 理 が 不 定 胚 形 成 の 向 上 効 果 を も た ら す メ カ ニ ズ ム を 解 明 す る た め に ， 低 温 処 理 中 の 小 胞 子 の 発 達 を 組 織 学 的 に 観 察 し た ． 第 １ 項 共 通 の 方 法 材 料 品 種 ‘ つ ば め ’ を 供 試 し た ． 小 胞 子 の 細 胞 学 的 観 察 低 温 処 理 の 小 胞 子 の 発 達 に 及 ぼ す 影 響 を 調 査 す る た め ，F a n ら ( 1 9 8 8 ) と H a m a o k a ら ( 1 9 9 1 a ) の 方 法 に 従 い ， 小 胞 子 の 発 達 ス テ ー ジ を 観 察 し た ． 低 温 処 理 を ，0 , 7 , 9 , 1 4 , 2 2 ま た は 2 9 日 行 っ た 蕾 か ら 葯 を 取 り 出 し ， 固 定 液 ( エ タ ノ ー ル ： 酢 酸 ＝3 ： 1 ， v / v ) に 浸 漬 し て 固 定 後 ， 5 6 m M ク エ ン 酸 と 8 8 m M リ ン 酸 か ら な る 緩 衝 液 （p H 4 . 4 ） に 浸 漬 し て 平 衡 化 し た ． こ の 葯 を ス ラ イ ド ガ ラ ス の 上 に 置 き ，4 , 6 - d i a m i n o - 2 - p h e n y l i n d o l ( D A P I ) 溶 液 （ 同 緩 衝 液 中 ， 0 . 2 5 m g / l ） を 1 0 μ l 滴 下 し ， ピ ン セ ッ ト を 用 い て 葯 を 押 し つ ぶ し て 小 胞 子 を 遊 離 さ せ た 後 ， 葯 残 渣 を 除 き ， カ バ ー グ ラ ス を か け て 落 射 蛍 光 顕 微 鏡( オ リ ン パ ス B H - ２ ， U V ) で 観 察 し た ． そ れ ぞ れ の 葯 に つ い て 1 0 0 以 上 の 小 胞 子 を 観 察 し た ．

第 ２ 項 同 一 蕾 中 の 6 葯 の 中 の 小 胞 子 の 発 達 ス テ ー ジ 方 法 小 胞 子 培 養 に 用 い る 材 料 1 0 蕾 に つ い て ， 蕾 内 の 葯 長 と 花 弁 長 の 比 が 0 . 5 ～ 0 . 7 の 1 つ の 蕾 内 の 6 葯 に 含 ま れ る 小 胞 子 の 発 達 ス テ ー ジ を 調 査 し た ． 結 果 1 つ の 蕾 内 の 6 葯 中 に 含 ま れ る 小 胞 子 の 発 達 ス テ ー ジ は す べ て 一 細 胞 期 後 期 で 非 常 に 良 く 同 調 し て い た( デ ー タ 省 略 ) ． 第 ３ 項 低 温 処 理 中 の 小 胞 子 の 発 達 方 法 蕾 を 0 ， 7 ， 9 ， 1 4 ， 2 2 お よ び 2 9 日 間 処 理 し た 後 の ， 蕾 中 の 小 胞 子 の 各 発 達 ス テ ー ジ を 観 察 し た ． 結 果 蕾 を 0 か ら 2 9 日 間 低 温 処 理 し た 後 の ， 小 胞 子 の 各 発 達 ス テ ー ジ を 観 察 し た ( Ta b l e 2 - 4 ) ． 低 温 処 理 前 の 小 胞 子 の 発 達 ス テ ー ジ は ， す べ て 一 細 胞 期 後 期 （1 C L ) の 発 達 ス テ ー ジ で あ っ た が ， 7 ～ 2 9 日 間 の 低 温 処 理 期 間 中 に 1 C L の 小 胞 子 の 割 合 は 減 少 し ， 小 胞 子 第 一 分 裂 に よ っ て 生 じ た ， 大 き さ の 異 な る 生 殖 核 と 栄 養 核 を も つ ， 二 細 胞 期 の 小 胞 子( 2 C U ) の 割 合 が 増 加 し た ． ま た ， 低 温 処 理 区 に お い て ， わ ず か で は あ る が 均 等 な 大 き さ の ，2 つ の 核 を も つ 二 細 胞 期 の 小 胞 子 ( 2 C E ， F i g u r e 2 - 3 ) が 観 察 さ れ た ． 低 温 処 理 2 9 日 間 で は ， 生 殖 細 胞 が さ ら に 分 裂 し て ，2 つ の 生 殖 細 胞 と 1 つ の 栄 養 細 胞 か ら な る 三 細 胞 期 の 小 胞 子 （ 3 C ； 成 熟 花 粉 ，F i g u r e 2 - 3 ） も 観 察 さ れ た ． 低 温 処 理 前 後 の 花 弁 の 長 さ と 葯 の 長 さ の 比 （P / A ） は ， 処 理 前 が 0 . 5 ～ 0 . 7 で あ っ た の 対 し ， 処 理 2 9 日 後 に は 0 . 9 ～ 1 . 0 に 増 大 し た ．

Table 2-4. Percentage of developmental stage of microspores before and after low temperature pretreatment of buds in B. rapa subsp. pekinensis L. (Chinese cabbage) cv. 'Tsubame'

Duration of 4℃ Developmental stage of microspores (%)

treatment (days) 3C4) 0 100.0 ± 0 7 86.9 ± 9.1 10.6 ± 7.0 2.5 ± 2.1 0 9 54.4 ± 22 44.5 ± 22.0 1.0 ± 0.5 0 14 59.1 ± 23.9 40.4 ± 23.6 0.5 ± 0.4 0 22 63.8 ± 9.0 30.5 ± 8.2 5.7 ± 1.2 0 29 29.6 ± 4.1 56.3 ± 3.8 9.2 ± 0.6 4.9 ± 3.0 1) _{unicellular late stage microspore.}

2) _{bicellular stage microspore with two unequal size nuclei.} 3) _{bicellular stage microspore with two equal size nuclei.}

4) _{tricellular stage microspore with two generative cells and one vegetative cell.} Each value represents mean ± SE of 10 anthers.

2CE3) 2CU2)

F i g u r e 2 - 3 . M i c r o s p o r e s o f B r a s s i c a r a p a s u b s p . p e k i n e n s i s a t a b i c e l l u l a r s t a g e w i t h t w o e q u a l s i z e n u c l e i ( 2 C E , l e f t ) a n d a t r i c e l l u l a r s t a g e ( 3 C , r i g h t ) .

第 ４ 項 考 察 4 ℃ の 低 温 下 に お い て ， 蕾 の 中 の 小 胞 子 は ， 不 均 等 な 大 き さ の 核 を 持 つ 二 細 胞 期( 2 C U ) と 均 等 な 大 き さ の 核 を 持 つ 二 細 胞 期 ( 2 C E ) の ， 2 種 類 の 異 な る 発 達 過 程 が 観 察 さ れ た ． ア ブ ラ ナ 属(B r a s s i c a) 植 物 で は ， 一 細 胞 期 後 期 の 小 胞 子 は 小 胞 子 不 均 等 サ イ ズ 二 分 裂 を し て ， 栄 養 細 胞 と こ れ よ り 小 さ な 生 殖 細 胞 か ら な る 二 細 胞 期 の 小 胞 子 と な る ． 生 殖 核 は 更 に 分 裂 し て 2 つ に な り ， 三 細 胞 期 の 成 熟 花 粉 に な る ． 一 方 ， 小 胞 子 か ら の 不 定 胚 形 成 で は ， 一 細 胞 期 後 期 の 小 胞 子 は 均 等 サ イ ズ 二 分 裂 を し ， 同 じ 大 き さ の 2 つ の 核 か ら な る 二 細 胞 期 の 小 胞 子 と な り ， そ の 後 も 分 裂 を 続 け て 不 定 胚 形 成 へ と 向 か う こ と が 知 ら れ て い る （F a n e t a l. 1 9 8 8 ， H a m a o k a e t a l. 1 9 9 1 a ） ． 低 温 処 理 期 間 の 進 行 と と も に ， 一 細 胞 期 の 小 胞 子 は 減 少 し ， そ の 減 少 分 の 大 部 分 は ， 大 き さ の 異 な る 2 つ の 核 か ら な る 二 細 胞 期 の 小 胞 子 に 発 達 し た ． し か し ， 僅 か で は あ る が ， 同 じ 大 き さ の 2 つ の 核 か ら な る 二 細 胞 期 の 小 胞 子 へ 発 達 す る も の も 観 察 さ れ た( Ta b l e 2 - 3 ) ． つ ま り ， 低 温 処 理 中 に ， 小 胞 子 は ゆ っ く り と 成 熟 花 粉 へ と 三 つ の 不 均 等 サ イ ズ の 細 胞 を 発 達 さ せ る と 同 時 に ， ご く 一 部 の 小 胞 子 か ら は 脱 分 化 し た 均 等 サ イ ズ の 二 細 胞 が 形 成 さ れ 不 定 胚 形 成 に 向 か う と 推 察 さ れ る ． こ れ が ， 低 温 前 処 理 が 不 定 胚 形 成 を 促 進 す る 一 因 と 考 え ら れ る ． 低 温 処 理 に よ り 通 常 の 小 胞 子 発 達 か ら 逸 脱 し ， 栄 養 細 胞 と 生 殖 細 胞 の 区 別 が な く な り 均 等 サ イ ズ 二 分 裂 を 行 う メ カ ニ ズ ム は 現 段 階 で は 不 明 で あ る が ， 以 下 の よ う な 仮 説 が 考 え ら れ て い る ．Z h a o e t a l. ( 1 9 9 6 a ) は ， ナ タ ネ の 小 胞 子 培 養 に お い て ，2 5 μ M の コ ル ヒ チ ン 処 理 が 不 定 胚 形 成 に 有 効 で あ る こ と か ら ， コ ル ヒ チ ン 処 理 に よ り ， 小 胞 子 内 の 微 小 管 が 脱 重 合 し た 結 果 ， 細 胞 骨 格 が 崩 壊 し て ， 初 期 分 裂 が 不 均 等 サ イ ズ 二 分 裂 か ら 均 等 サ イ ズ 二 分 裂 へ と 変 化 す る と 推 定 し て い る ． ま た ， タ バ コ の B Y- 2 培 養 細 胞 で は ， 低 温 処 理 に よ っ て 微 小 管 が 崩 壊 す る こ と が 報 告 さ れ て お り （H a s e z a w a e t a l . 1 9 9 7 ） ， ハ ク サ イ の 小 胞 子 培 養 で も ， 低 温 前 処

理 が 1 細 胞 期 後 期 の 小 胞 子 の 微 小 管 を 崩 壊 さ せ て 不 均 等 サ イ ズ 二 分 裂 か ら 均 等 サ イ ズ 二 分 裂 に 変 化 し た 可 能 性 が 考 え ら れ る ． 前 節 に お い て ， 花 序 は 蕾 に 比 べ て 低 温 前 処 理 に よ る 不 定 胚 形 成 の 向 上 効 果 は 低 か っ た ． こ の 原 因 の ひ と つ と し て ， 小 胞 子 培 養 に 用 い た 蕾 の 選 定 時 期 の 違 い が 考 え ら れ る ． 蕾 処 理 で は ， 選 定 し た 蕾 を 低 温 処 理 後 そ の ま ま 培 養 す る の に 対 し ， 花 序 処 理 で は ， 処 理 後 の 花 序 か ら 選 定 し た 蕾 を 培 養 し た ． 選 定 の 際 の P / A の 割 合 は ， そ の 蕾 中 の 小 胞 子 の 発 達 ス テ ー ジ の 指 標 の 1 つ と し て 用 い て お り ， P / A が 0 . 5 ～ 0 . 7 の 無 処 理 の 蕾 は ， そ の 大 部 分 は 不 定 胚 形 成 能 が 高 い 一 細 胞 期 後 期 の 小 胞 子 で あ る こ と を 確 認 し て い る ． 一 方 ， 蕾 の 低 温 処 理 2 9 日 に は ， P / A の 割 合 が 0 . 5 ～ 0 . 7 か ら 0 . 9 ～ 1 . 0 へ 増 大 し て い た ． こ れ は ， 低 温 処 理 中 に ， 小 胞 子 が 成 熟 花 粉 に 向 か っ て 徐 々 に 発 達 し た こ と を 示 す ． 実 際 に ， 蕾 の 処 理 を 更 に 続 け る と ， シ ャ ー レ の 中 で 開 花 す る こ と を 確 認 し た ． 花 序 の 低 温 処 理 後 に ，P / A が 0 . 5 ～ 0 . 7 を 指 標 に し て 蕾 を 選 定 し た の で ， 高 い 胚 発 生 能 力 を も つ 小 胞 子 を 含 む 蕾 を 選 定 で き な か っ た 可 能 性 が あ る ． ま た ， 蕾 処 理 で は ， 蕾 が 培 養 液 中 に あ り ， 養 分 供 給 が 可 能 で あ る の に 対 し ， 花 序 処 理 で は ， 水 差 し の 状 態 に あ り ， 養 分 は 供 給 さ れ な い と い う 養 分 条 件 の 違 い が あ っ た ． こ れ ら の 理 由 か ら ， 低 温 処 理 は 花 序 よ り も 蕾 で ， 不 定 胚 の 形 成 効 果 が 高 か っ た と 考 え ら れ る ． 第 ３ 節 1 個 体 の 材 料 植 物 か ら 得 ら れ る 倍 加 半 数 体 数 の 推 定 半 数 体 育 種 で は ， 育 種 目 標 に 合 致 す る 遺 伝 子 型 の 個 体 を 選 抜 ・ 獲 得 で き る か 否 か が 育 種 の 成 否 を 決 定 す る ． 例 え ば ， ヘ テ ロ 性 の 高 いF1品 種 を 材 料 と す る と ， n 個 の 遺 伝 子 座 に つ い て ， そ れ ぞ れ ， 対 立 遺 伝 子 を 共 通 セ ッ ト で 有 す る 半 数 体 が 出 現 す る 確 率 は ， 材 料 植 物 が ｎ 個 の 遺 伝 子 座 の す べ て が ヘ テ ロ の 場 合 ，( 1 / 2 )ｎ と な る ． し た が っ て ， 目 的 と す る 遺 伝 子 型 を 有 す る 半 数 体 を 確 実 に 1 個 体 以 上 獲 得 す る た め に は 莫 大 な 数 の 半 数 体 を 作 出 し な け れ ば な ら な い ． こ れ が 半 数 体 育 種

上 の 一 つ の 問 題 点 で あ る ． 一 方 ，F2分 離 世 代 で 一 度 個 体 選 抜 し た も の を 材 料 と す る と ， ホ モ 化 に 必 要 な 個 体 数 はF1植 物 の 場 合 と 比 べ て 大 幅 に 減 少 す る ． し か し ， こ の 場 合 で も 複 数 の 遺 伝 子 座 に つ い て 導 入 し た い 対 立 遺 伝 子 を 共 通 セ ッ ト で 有 す る 個 体 を 確 実 に 得 る た め に は ，F2世 代 で 選 抜 し た 特 定 1 個 体 か ら 出 来 る だ け 多 数 の 倍 加 半 数 体 を 効 率 的 に 作 出 す る こ と が 必 要 と な る ． 本 節 で は ， 圃 場 で 選 抜 し た 1 個 体 の 材 料 か ら 倍 加 半 数 体 を 作 出 す る 場 合 を 想 定 し ， 温 室 で 栽 培 し た 1 個 体 か ら 開 花 期 間 中 に 得 ら れ る 材 料 蕾 の 数 や 倍 加 半 数 体 数 の 検 討 を 行 っ た ． 第 １ 項 材 料 植 物 1 個 体 か ら の 小 胞 子 培 養 材 料 お よ び 方 法 植 物 材 料 ハ ク サ イF1品 種 ‘W 111 6 ’ を 植 物 材 料 と し て 用 い ， 第 １ 節 と 同 様 に 栽 培 し た ． 抽 苔 開 花 し た 植 物 体 か ら 任 意 に 1 個 体 を 選 定 し ， 開 花 期 間 中 に こ の 個 体 か ら 得 ら れ る す べ て の 花 序 を 採 集 し ， 一 細 胞 期 後 期 の 小 胞 子 を 含 む 蕾 を 選 定 し て 小 胞 子 培 養 に 供 試 し た ． な お ， こ こ で は ， 低 温 前 処 理 を 実 施 し な か っ た ． 小 胞 子 培 養 小 胞 子 培 養 は 第 １ 節 の 方 法 に 若 干 の 変 更 を 加 え て 行 っ た ． 花 序 を 採 取 し て ， 共 通 の 方 法 と 同 様 に 蕾 を 選 定 し ， 小 胞 子 を 単 離 し て 収 量 を 調 査 後 ， 培 養 密 度 は1 × 1 0５ _{/ m l に な る よ う に 調 整 し ， 滅 菌 シ ャ ー レ （ 径 6 c m ， 高 さ 1 . 5 c m ） に 1 . 6 m l} ず つ 分 注 し て 培 養 し た ． 培 地 の 6 - b e n z y l a d e n i n e ( B A ) 濃 度 を 0 . 1 , 0 . 5 , ま た は 1 . 0 m g / l と し ， 濃 度 ご と に 3 シ ャ ー レ ， 合 計 9 シ ャ ー レ の 培 養 を 行 っ た ． 4 週 間 後 に 形 成 し た 不 定 胚 数 ( 魚 雷 型 胚 お よ び 子 葉 型 胚 ) の 調 査 を 行 っ た ．

結 果 培 養 開 始 か ら の 日 数 ， 採 取 花 序 数 ， 培 養 蕾 数 ， 単 離 小 胞 子 の 収 量 ，1 蕾 当 た り の 小 胞 子 数 ， 形 成 し た 不 定 胚 数 を 調 査 し た( Ta b l e 2 - 5 ) ． 1 個 体 か ら 抽 苔 開 花 以 降 ，1 月 1 4 日 か ら 6 月 7 日 ま で の 1 4 3 日 間 に 2 7 回 に わ た っ て 花 序 を 採 取 す る こ と が で き ，1 , 1 3 5 蕾 か ら 6 2 1 × 1 05_{個 の 小 胞 子 を 培 養 に 供 試 し た ． こ れ 以 降} は 植 物 体 が 消 耗 し ， 培 養 に 供 試 可 能 な 蕾 は 採 取 で き な か っ た ． 合 計 2 4 3 シ ャ ー レ の 小 胞 子 培 養 に よ り 5 5 9 の 不 定 胚 を 得 た ． 単 離 し た す べ て の 小 胞 子 を 培 養 し た 場 合 に 得 ら れ る 推 定 獲 得 不 定 胚 数 は 9 7 0 で ， 培 養 蕾 当 た り の 平 均 不 定 胚 形 成 数 は 0 . 8 5 個 で あ っ た ． た だ し ， 1 蕾 当 た り に 含 ま れ る 小 胞 子 の 数 は ， 材 料 採 集 の 後 期 に お い て 減 少 す る 傾 向 に あ っ た ． 第 ２ 項 考 察 品 種 ‘W 111 6 ’ の 1 個 体 の 実 生 か ら ， 可 能 な 限 り 蕾 を 採 取 し た と こ ろ ， 材 料 蕾 は 4 ヶ 月 以 上 に 渡 り 採 取 可 能 で ， そ れ ら を 小 胞 子 培 養 す る こ と に よ り 約 1 0 0 0 程 度 の 不 定 胚 が 得 ら れ る こ と が わ か っ た ． 始 め の6 回 の 約 1 ヶ 月 間 の 培 養 で 約 2 8 0 の 不 定 胚 ， 続 く 9 回 の 約 1 ヶ 月 間 の 培 養 で 6 0 0 の 不 定 胚 ， そ の 後 の 11 回 約 3 ヶ 月 の 培 養 で 約 9 0 の 不 定 胚 が 得 ら れ た こ と は ， 2 ヶ 月 ま で は ， 不 定 胚 発 生 効 率 が 比 較 的 高 く ，2 ヶ 月 を 越 え る と 発 生 率 が 低 下 す る こ と を 示 唆 し て い る ． ま た ， こ の 試 験 に お い て は B A 濃 度 の 異 な る 3 種 類 の 培 地 を 用 い て 小 胞 子 培 養 を 行 っ た が ， 最 適 な 濃 度 は 培 養 日 に よ り 異 な り ， 一 定 の 傾 向 は 認 め ら れ な か っ た こ と か ら ， 培 地 よ り も 植 物 材 料 の 影 響 が 大 き い も の と 考 え ら れ た ． 実 際 に 育 種 に 利 用 す る 際 に は ， 培 地 のB A 濃 度 を 3 段 階 程 度 に す れ ば ， 材 料 植 物 の 影 響 を 回 避 で き る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た ． 不 定 胚 か ら 倍 加 半 数 体 を 得 る ま で に は ， 不 定 胚 か ら の 幼 植 物( シ ュ ー ト ) 再 分 化 ， 発 根 ， 順 化 ， 半 数 体 の 倍 加 処 理 ， 自 殖 種 子 の 採 種 と い っ た 段 階 が あ る( 詳 細 な