牛由来Salmonella enterica serovar Typhimuriumの分子疫学および薬剤耐性に関する研究

Title

牛由来Salmonella enterica serovar Typhimuriumの分子疫学お

_{よび薬剤耐性に関する研究( 本文(Fulltext) )}

Author(s)

菅原, 克

Report No.(Doctoral

Degree)

博士(獣医学) 乙第130号

Issue Date

2014-03-13

Type

博士論文

Version

ETD

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/49051

※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。

牛 由 来

Salmonella enterica

serovar Typhimuriumの

分 子 疫 学 お よ び 薬 剤 耐 性 に 関 す る 研 究

2013年

岐 阜 大 学 大 学 院 連 合 獣 医 学 研 究 科

菅 原 克

目 次

緒 言

1 第 一 章

福 島 県 で 分 離 さ れ た 牛 由 来

Salmonella Typhimuriumの

分 子 疫 学 的 解 析

6 序 論 6 材 料 お よ び 方 法 7 １ 使 用 菌 株 7 ２ 薬 剤 感 受 性 試 験 7 ３ 分 離 株 の フ ァ ー ジ 型 別 8

４ Polymerae chain reaction（ PCR）に よ る 遺 伝 子 検 出 8

５ プ ラ ス ミ ド プ ロ フ ァ イ ル 8

６ プ ラ ス ミ ド 制 限 酵 素 断 片 長 多 型 （ RFLP） 解 析 8

７ 薬 剤 耐 性 プ ラ ス ミ ド 伝 達 性 試 験 9

８ Pulse-field gel electrophoresis (PFGE) に よ る 遺 伝 子 型 解 析 9

９ gyrA遺 伝 子 の 塩 基 配 列 解 析 10 結 果 10 １ 同 一 農 場 で 分 離 さ れ た 菌 株 の 比 較 と 2004年 分 に 離 さ れ た 農 場 間 の 疫 学 調 査 10 ２ 分 離 株 の 表 現 型 別 11 ３ 分 離 株 の 遺 伝 子 型 別 お よ び プ ラ ス ミ ド 解 析 11 ４ 塩 基 配 列 解 析 13 考 察 13 図 表 18

第 二 章 国 内 で 初 め て 分 離 さ れ た 牛 由 来 広 域 セ フ ァ ロ ス ポ リ ン 系

薬 剤 耐 性

Salmonella Typhimurimの 性状 解 析

24 序 論 24 材 料 お よ び 方 法 25 １ 分 離 株 に つ い て の 疫 学 的 概 要 25 ２ 使 用 菌 株 25 ３ 薬 剤 感 受 性 試 験 25 ４ 分 離 株 の フ ァ ー ジ 型 別 26 ５ β ラ ク タ マ ー ゼ 検 出 試 験 26 ６ プ ラ ス ミ ド プ ロ フ ァ イ ル 26 ７ プ ラ ス ミ ド 伝 達 性 試 験 27 ８ PCR 27 ９ サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 27 10 PFGE解 析 28 結 果 28 １ 分 離 株 の 表 現 型 別 28 ２ PCRに よ る 遺 伝 子 検 索 と 分 離 株 の PFGE解 析 29 ３ プ ラ ス ミ ド お よ び ト ラ ン ス コ ン ジ ュ ガ ン ト 解 析 29 考 察 31 図 表 35

第 三 章 福 島 県 の 肉 用 牛 育 成 農 場 か ら 分 離 さ れ た 複 数 の

薬 剤 耐 性 型 を 示 す

Salmonella Typhimuriumの 解 析

43 序 論 43 材 料 お よ び 方 法 44 １ 分 離 農 場 の 疫 学 的 概 要 44 ２ 使 用 菌 株 44 ３ 薬 剤 感 受 性 試 験 44 ４ 分 離 株 の フ ァ ー ジ 型 別 45 ５ プ ラ ス ミ ド プ ロ フ ァ イ ル 45 ６ PFGE 45 ７ プ ラ ス ミ ド 伝 達 性 試 験 45 ８ ト ラ ン ス フ ォ ー マ ン ト の 作 出 46 ９ PCR 46 10 サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン 47 結 果 47 １ 分 離 株 の 表 現 型 別 47 ２ 分 離 株 の 遺 伝 子 型 別 48 ３ ト ン ラ ン ス コ ン ジ ュ ガ ン ト の 解 析 48 ４ ト ラ ン ス フ ォ ー マ ン ト の 解 析 49 考 察 50 図 表 55

総 括

64

謝 辞

67

引 用 文 献

68

略 語 一 覧

ABPC： ア ン ピ シ リ ン AmpC： Ambler class C

ATCC： American type culture collection CAZ： セ フ タ ジ ジ ム

CEZ： セ フ ァ ゾ リ ン CFPM： セ フ ェ ピ ム CFX： セ フ ォ キ シ チ ン

CLSI： Clinical and Laboratory Standard Institute CP： ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル

CTF： セ フ チ オ フ ル

CTRX： セ フ ト リ ア キ ソ ン

DSM： ジ ヒ ド ロ ス ト レ プ ト マ イ シ ン DT： definitive phage type

ERFX： エ ン ロ フ ロ キ サ シ ン

ESC： 広 域 ス ペ ク ト ラ ム セ フ ァ ロ ス ポ リ ン GM： ゲ ン タ マ イ シ ン

JVARM： Japanese Veterinary Antimicrobial Resistance Monitoring KM： カ ナ マ イ シ ン

NA： ナ リ ジ ク ス 酸

OTC： オ キ シ テ ト ラ サ イ ク リ ン PCR： polymerase chain reaction

PFGE： pulsed-field gel electrophoresis

RDNC： reacted but did not conform with clear phage types RFLP： 制 限 酵 素 断 片 長 多 型

SGI1：Salmonella genomic island 1

SM： ス ト レ プ ト マ イ シ ン SUL： サ ル フ ァ 剤

TC： テ ト ラ サ イ ク リ ン TMP： ト リ メ ト プ リ ム

1

緒 言

サ ル モ ネ ラ はSalmonella enterica，S. bongoriお よ び S. subterraneaの3

菌 種 に 分 け ら れ る （74）。S. entericaは さ ら に6亜 種 に 分 け ら れ ， そ の う ち

ヒ ト を は じ め 各 種 ほ 乳 類 や 鳥 類 か ら 分 離 さ れ る も の は ， 主 にS. enterica

subsp. entericaに 属 し て い る （35， 44）。S. enterica subsp. entericaは ，

Kauffmann-Whiteの 抗 原 構 造 表 （ 35） に 基 づ く O抗 原 お よ び H抗 原 に よ り 2500以 上 の 血 清 型 に 型 別 さ れ ， 血 清 型 に よ り 宿 主 動 物 種 と 病 原 性 に 差 異 が

あ る 。 特 定 の 宿 主 に 病 原 性 を 示 す 代 表 的 な 血 清 型 と し て ，S. enterica

serovar Typhiお よ びS. enterica serovar Abortusequiが あ り ，前 者 は ヒ ト に ，

後 者 は 馬 に 限 定 し て 強 い 病 原 性 を 発 揮 し ，敗 血 症 な ど の 強 い 全 身 性 症 状 を 引 き 起 こ す 。 一 方 ， ヒ ト や 動 物 に 感 染 す る 代 表 的 な 血 清 型 と し て ，S. Typhimuriumお よ びS. Enteritidisが あ る（ 54，87）。こ の 2菌 種 は 幅 広 い 宿 主 域 の た め ，代 表 的 な 食 中 毒 菌 と し て も 認 識 さ れ て お り ，家 畜 衛 生 の み な ら ず 公 衆 衛 生 上 の 観 点 か ら も 注 視 す べ き 菌 で あ る 。 牛 の サ ル モ ネ ラ 症 は ，サ ル モ ネ ラ の 多 く の 血 清 型 に よ り 引 き 起 こ さ れ る が ，

国 内 に お い て はS. Dublin，S. Enteritidisお よ びS. Typhimuriumに よ る も

の が 家 畜 伝 染 病 予 防 法 に 規 定 さ れ る 届 出 伝 染 病 に 指 定 さ れ て お り ，S. Typhimuriumが 国 内 外 問 わ ず 高 率 で 分 離 さ れ て い る （ 8， 13， 61， 83）。 症 状 と し て は 発 熱 ，下 痢 を 主 徴 と し ，時 に 肺 炎 や 流 産 も 認 め ら れ ，急 性 症 状 の 場 合 で は 敗 血 症 に よ り 死 亡 す る 例 も あ る 。1990年 以 前 の 本 症 は 哺 乳 牛 や 育 成 牛 の 下 痢 や 肺 炎 を 引 き 起 こ す 疾 病 と し て 認 識 さ れ て い た が ，1990年 代 に な る と ， 搾 乳 牛 に そ の 発 生 が 多 く み ら れ る よ う に な っ た （3, 13， 69， 71）。 そ の 発 生 の 多 く はS. Typhimuriumに よ る 感 染 で ， さ ら に 単 発 で は な く ， 牛

2

群 全 体 に 発 症 を 引 き 起 こ す た め ， 経 済 的 な 被 害 は 甚 大 と な っ た （13， 19，

73）。 一 方 で ， 搾 乳 牛 の サ ル モ ネ ラ 症 が 増 加 し た 同 時 期 にS. Typhimurium

の 性 状 に 変 化 が あ っ た こ と が 明 ら か と な っ た 。 欧 米 諸 国 に お い て ，S.

Typhimurium definitive phage type 104（ DT104） に よ る 食 中 毒 が 増 加 し

公 衆 衛 生 上 大 き な 問 題 と な っ た（33，39）。世 界 各 地 で 分 離 さ れ た DT104は ， 互 い に 遺 伝 学 的 に 近 縁 で あ る と と も に ， ア ン ピ シ リ ン （ABPC）， ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル（CP），ス ト レ プ ト マ イ シ ン（ SM），サ ル フ ァ 剤（ SUL）お よ び テ ト ラ サ イ ク リ ン （TC） の ５ 剤 に 対 し て 耐 性 を 示 し た 。 多 剤 耐 性 DT104 は ，世 界 各 国 で 同 時 期 に 牛 に お い て 急 速 に 分 離 さ れ る よ う に な り(39)，米 国 で は1986年 か ら 1991年 の 同 割 合 が 13％ だ っ た の に 対 し ， 1991年 か ら 1996 年 ま で で64％ と な っ た と 報 告 さ れ て い る（ 15）。日 本 国 内 に お い て も ，1990 年 代 か ら 牛 由 来 多 剤 耐 性DT104の 分 離 率 の 上 昇 が 確 認 さ れ て お り ， 1981年 か ら1990年 ま で に 分 離 さ れ た 牛 由 来 5剤 耐 性S. Typhimurium13株 の う ち ， DT104は 皆 無 で あ っ た の に 対 し ，1991年 か ら 1998年 で は 49株 中 31株（ 63％ ） が 分 離 さ れ て い た （69）。 し か し ，高 率 に 分 離 さ れ て い た 牛 由 来DT104分 離 率 が 近 年 低 下 傾 向 に あ る 。 国 内 で は ， 牛 由 来DT104の 比 率 は 1999年 か ら 2000年 ま で 71.9%だ っ た の に 対 し（29），2002年 か ら 2005年 で は 30.8%と な り ，分 離 率 が 有 意 に 減 少 し て い る （47）。 ま た ， 英 国 で は 牛 由 来 DT104の 比 率 が 1995年 か ら 1998年 ま で 80％ 台 で 推 移 し て い た の に 対 し ，2009年 か ら 2011年 で は 20‐ 30％ と な っ た （83）。デ ン マ ー ク に お い て も ，1998年 か ら 2000年 で は 約 30％ だ っ た 牛 由 来 DT104の 比 率 が 2001年 か ら 2004年 の 間 で は ，10‐ 20％ で あ っ た と 報 告 さ れ て い る （10, 11， 27）。 分 離 菌 株 の フ ァ ー ジ 型 変 化 に 伴 い ， 国 内 の 牛 由 来S. Typhimuriumの 薬 剤

3 耐 性 型 の 変 化 も 確 認 さ れ た 。1999年 か ら 2001年 の 分 離 株 で は ， DT104の 多 く を 占 め て い たABPC, CP, ジ ヒ ド ロ ス ト レ プ ト マ イ シ ン （ DSM） お よ び オ キ シ テ ト ラ サ イ ク リ ン （OTC） 耐 性 株 が 全 体 の 74％ だ っ た の に 対 し ， 2002 年 か ら2005年 で は ， 上 記 の 4剤 の 耐 性 パ タ ー ン は 30％ と 減 少 し た （ 47）。 一 方 ，1999年 か ら 2001年 で は 1.9%だ っ た ABPC, DSM, OTCお よ び カ ナ マ イ シ ン （KM） 耐 性 株 が 2002年 か ら 2005年 で は 46％ と 増 加 し た （ 47）。 し か し ， 3剤 以 上 の 耐 性 を 示 す 国 内 の 牛 由 来S. Typhimurium多 剤 耐 性 株 の 割 合 は ， 1999年 か ら 2001年 で は 78％ ，2002年 か ら 2005年 で は 86％ と 増 加 傾 向 に あ り ， 依 然 と し て 非 常 に 高 率 で あ っ た （47）。 ア メ リ カ 農 務 省 の 調 査 に お い て も ， 5剤 以 上 に 耐 性 を 示 す 牛 由 来 サ ル モ ネ ラ の 割 合 は ， 1999年 に 約 8％ で あ っ た の に 対 し ，2010年 に は 23.1％ で あ り 、他 の 家 畜（ 豚：7.2％ 、鶏：9％ 、七 面 鳥：9.3％ ）と 比 べ 、高 い 比 率 で 多 剤 耐 性 株 が 分 離 さ れ て い る（ 82）。こ の よ う に ， 牛 由 来 サ ル モ ネ ラ の 多 剤 耐 性 化 が 顕 著 と な っ て お り ， 牛 がS. Typhimuriumに 代 表 さ れ る 多 剤 耐 性 サ ル モ ネ ラ 感 染 環 の 温 床 と な っ て い る 可 能 性 が 指 摘 さ れ て い る （78）。 サ ル モ ネ ラ の 型 別 方 法 は 表 現 型 別 法 と 遺 伝 子 型 別 法 が あ り ， 代 表 的 な も の と し て 前 者 は ， フ ァ ー ジ 型 別 ，薬 剤 耐 性 型 別 が あ り ，後 者 はpulsed-field gel

electrophoresis（ PFGE） ， プ ラ ス ミ ド プ ロ フ ァ イ ル ， amplified fragment length polymorphismが あ る（ 5，58，72，78，84）。な か で も ， PFGEは

識 別 能 力 が 高 く ，代 表 的 な 方 法 と し て 用 い ら れ て い る（77）。Tamamuraら

（78） は 過 去 33年 間 に 北 海 道 で 分 離 さ れ た 牛 サ ル モ ネ ラ 症 由 来S. Typhimu-

riumに つ い て ，PFGEを 用 い て 型 別 し ，9型（ Ⅰ ‐ Ⅸ ）に 分 類 し て い る 。こ の

う ちDT104を 含 む ク ラ ス タ ー I型 が 2000年 以 降 減 少 傾 向 に あ り ， 新 た に 出 現

4 さ ら に ， ク ラ ス タ ー Ⅶ に 属 す る 菌 株 の97％ は 4剤 以 上 耐 性 を 示 す 多 剤 耐 性 株 で あ り ，そ の う ち16％ は 我 が 国 の 家 畜 衛 生 分 野 に お け る 薬 剤 耐 性 モ ニ タ リ ン グ で 報 告 さ れ て い な か っ た セ フ ァ ゾ リ ン（CEZ）耐 性 を 示 し て い た（ 8，28, 29， 47， 78, 79） 。 ヒ ト の 非 チ フ ス 性 サ ル モ ネ ラ 症 で 症 状 が 消 化 器 に 限 局 さ れ て い る 場 合 ， 抗 生 物 質 の 治 療 は 必 要 な い と さ れ て い る が ， 乳 幼 児 や 高 齢 者 ， 免 疫 不 全 者 が 感 染 し た 場 合 に は ， 抗 生 物 質 投 与 が 必 要 と な る （9， 40） 。 そ の 際 ， 治 療 薬 と し て 薬 剤 耐 性 率 が 低 く ， 広 域 抗 菌 剤 で あ る ニ ュ ー キ ノ ロ ン や 広 域 ス ペ ク ト ラ ム セ フ ァ ロ ス ポ リ ン （ESC） が 選 択 さ れ る が ， 小 児 の 場 合 ， ニ ュ ー キ ノ ロ ン に は 関 節 軟 骨 の 損 傷 作 用 が あ る た め ，ESCが 選 択 さ れ る（ 14，30，40）。そ の た め ，ESC耐 性 サ ル モ ネ ラ の 出 現 は ， 公 衆 衛 生 上 非 常 に 重 要 な 問 題 で あ る （7） 。 こ の よ う に ， 近 年 牛 由 来S. Typhimuriumは 遺 伝 子 型 お よ び 表 現 型 の 変 化 が 確 認 さ れ て お り ， 高 い 多 剤 耐 性 傾 向 を 示 し ， 幅 広 い 宿 主 域 に 病 原 性 を 示 す 本 菌 の 流 行 株 に つ い て ， 薬 剤 耐 性 メ カ ニ ズ ム や フ ァ ー ジ 型 ， 遺 伝 子 型 な ど を 解 析 す る こ と は ， 公 衆 衛 生 な ら び に 家 畜 衛 生 上 非 常 に 重 要 な 情 報 と な る 。 本 研 究 で は ，第 一 章 で1992年 か ら 2004年 ま で に 福 島 県 下 14農 場 か ら 分 離 さ れ た 牛 由 来S. Typhimuriumに つ い て ， 分 子 疫 学 的 手 法 を 用 い て 株 間 の 比 較 を 行 っ た 。さ ら に ，2004年 に 福 島 県 で 多 発 し た 牛 サ ル モ ネ ラ 症 の 各 農 場 分 離 株 間 に つ い て 比 較 を 行 い ， 伝 播 の 可 能 性 に つ い て 検 討 し た 。 第 二 章 で は ， 国 内 で 初 め て 分 離 さ れ た 牛 由 来ESC耐 性S. Typhimuriumに つ い て ，ESC耐 性 の 機 序 ， 遺 伝 子 型 の 特 徴 や フ ァ ー ジ 型 等 の 解 析 を 実 施 し ， ESC耐 性S. Typhimuriumの 性 状 を 明 ら か に し た 。 第 三 章 で は ，第 二 章 でESC耐 性S. Typhimuriumが 分 離 さ れ た 育 成 農 場 で ，

5

短 期 間 の う ち に 分 離 さ れ た 複 数 の 薬 剤 耐 性 型 を 示 すS. Typhimuriumに つ い

て ， こ れ ら の 株 が 農 場 内 で 複 数 株 存 在 し た こ と に よ る の か ， あ る い は 単 一 株 か ら 派 生 し た も の な の か ， 単 一 株 由 来 で 派 生 し た の で あ れ ば ， ど の よ う な 変 化 に よ り 派 生 し た の か を 分 子 疫 学 的 手 法 を 用 い て 検 証 し た 。

6

第 一 章

福 島 県 で 分 離 さ れ た 牛 由 来

Salmonella

Typhimuriumの分子疫学的解析

序 論

牛 の サ ル モ ネ ラ 症 は サ ル モ ネ ラ の 多 く の 血 清 型 の 感 染 に よ り 発 症 す る が ，

国 内 に お い て はSalmonella enterica serovar Dublin，S. Enteritidisお よ び

S. Typhimuriumに よ る も の が 家 畜 伝 染 病 予 防 法 に 規 定 さ れ る 届 出 伝 染 病 に 指 定 さ れ て い る 。 中 で も 国 内 外 問 わ ず 宿 主 域 が 広 いS. Typhimuriumが 高 率 で 分 離 さ れ て い る （8， 13， 61）。S. Typhimuriumに よ る サ ル モ ネ ラ 症 は 哺 乳 牛 や 育 成 牛 の 下 痢 や 肺 炎 を 引 き 起 こ す 疾 病 と し て 認 識 さ れ て い た が ，1990 年 代 に 入 り ， 搾 乳 牛 の 発 生 が 多 く み ら れ る よ う に な っ た （13， 69， 71）。 ま た ， 同 時 期 に 分 離 さ れ るS. Typhimuriumの 性 状 に 変 化 が あ っ た こ と こ と も 確 認 さ れ て お り ，ア ン ピ シ リ ン(ABPC)，ク ロ ラ ム フ ェ ニ コ ー ル (CP)，ス ト レ プ ト マ イ シ ン(SM)， サ ル フ ァ 剤 (SUL)お よ び テ ト ラ サ イ ク リ ン (TC)の 5剤 に 耐 性 を 示 すS. Typhimuriumフ ァ ー ジ 型 DT104に よ る 食 中 毒 が 欧 米 で 増 加 し ， 世 界 各 国 の 牛 に お い て も 急 速 に 分 離 さ れ る よ う に な っ た （3， 15， 33， 69）。 近 年 ，S. Typhimuriumの 多 剤 耐 性 化 が 欧 米 で 顕 著 で あ り（ 33，39），こ の よ う な 多 剤 耐 性 菌 の 流 行 は 公 衆 衛 生 な ら び に 家 畜 衛 生 上 脅 威 と な っ て い る 。 本 章 で は1992年 か ら 2004年 に か け て 福 島 県 下 14農 場 （ A~N農 場 ） か ら 分 離 さ れ たS. Typhimuriumに お け る フ ァ ー ジ 型 ， 遺 伝 子 型 ， 薬 剤 耐 性 型 等 に つ い て 解 析 し ，2004年 の 牛 サ ル モ ネ ラ 症 多 発 事 例 で の 農 場 間 伝 播 の 可 能 性 に つ い て 検 討 し た 。

7 材 料 お よ び 方 法 １ 使 用 菌 株 1992年 か ら 2004年 に 福 島 県 下 ， 異 な る A‐ N農 場 の 計 14農 場 で 発 生 し た 牛 サ ル モ ネ ラ 症 か ら 分 離 さ れ たS. Typhimuriumを 用 い た 。 使 用 菌 株 は 1農 場 毎 に 異 な る 個 体 か ら 分 離 さ れ た3株 ， 計 42株 を 用 い ， 各 農 場 か ら 分 離 さ れ た 代 表 株 （A農 場 ： 4-70株 ， B農 場 ： 4-117株 ， C農 場 ： 6-95株 ， D農 場 ： 7-63株 ， E農 場 ： 7-82株 ， F農 場 ： 7-115株 ， G農 場 ： 7-131株 ， H農 場 ： 10-112株 ， I 農 場 ：16-74株 ， J農 場 ： 16-99株 ， K農 場 ： 16-117株 ， L農 場 ： 16-120株 ， M農 場：16-132株 ，N農 場：16-144株 ）を 表 1に 示 し た 。な お ，菌 株 は 使 用 す る ま で25％ グ リ セ ロ ー ル 加 ト リ プ ト ソ イ ブ ロ ス（ 日 水 製 薬 ，東 京 ）に て － 80℃ で 保 存 し た 。 2 薬 剤 感 受 性 試 験

平 板 寒 天 希 釈 法 に よ る 最 小 発 育 濃 度 の 測 定 はClinical and Laboratory

Standards Institute（ CLSI）（59）に 基 づ き 実 施 し た 。な お ，Staphylococcus

aureus American type culture collection（ ATCC） 29213, Enterococcus

faecalis ATCC 29212, Escherichia coli ATCC 25922 お よ び Pseudomonas

aeruginosa ATCC 27853 を 標 準 管 理 菌 株 と し て 用 い た 。 供 試 薬 剤 は ABPC，

セ フ ァ ゾ リ ン （CEZ）， セ フ チ オ フ ル （ CTF）， SM， KM， TC， CP， SUL，

ト リ メ ト プ リ ム （TMP）， ナ リ ジ ク ス 酸 （ NA） お よ び エ ン ロ フ ロ キ サ シ ン

（ERFX ） の 11 薬 剤 を 用 い た 。 ブ レ イ ク ポ イ ン ト は CTF お よ び ERFX で は

Esakiら （ 28） と Ishiharaら （ 41） の 報 告 に 準 じ て 設 定 し ， そ の 他 の 薬 剤 に

8

3 分 離 株 の フ ァ ー ジ 型 別

分 離 株 の フ ァ ー ジ 型 別 は 国 立 感 染 症 研 究 所 に 依 頼 し ，英 国 のPublic health

Laboratory Service の 手 法 （ 4） に 基 づ き 実 施 し た 。

4 Polymerase chain reaction（ PCR） に よ る 遺 伝 子 検 出

分 離 菌 株 の 鋳 型DNAは Instagene Matrix（ Bio-rad，Hercules，CA）を 用

い て ， 添 付 説 明 書 に 従 い 抽 出 し た 。PCR反 応 に つ い て はS. Typhimurium の 特 異 遺 伝 子 で あ る リ ン ゴ 酸 デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ 遺 伝 子（mdh），薬 剤 耐 性 遺 伝 子 に 関 連 す るclass Ⅰ integlon ， DT104 関 連 株 に 特 異 的 に 存 在 す る 16S ‐ 23S rRNAス ペ ー サ ー 領 域 配 列（ DT104特 異 配 列 ），サ ル モ ネ ラ 病 原 性 プ ラ ス ミ ド 上 の 病 原 性 関 連 因 子（spvC），DNAジ ャ イ レ ー ス の 1つ で あ るgyrAに つ い て ， 表2に 示 し た プ ラ イ マ ー と 文 献（ 24，49，53，55，65，67）に 従 い 実 施 し た 。 5 プ ラ ス ミ ド プ ロ フ ァ イ ル

プ ラ ス ミ ドDNAは Kadoと Liuの 方 法 （ 45） に よ り 抽 出 し ， 1％ ア ガ ロ ー ス

ゲ ル を 用 い 電 気 泳 動 を 行 い ，エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ イ ド に よ り 染 色 し ，UV光 下 で

確 認 し た 。 な お ， プ ラ ス ミ ド サ イ ズ マ ー カ ー と し て ， BAC-Tracker

Supercoiled DNA ladder (Epicentre Biotechnologies ， Madison， WI） お よ びsupercoiled DNA ladder（ New England BioLabs, Beverly， MA） を 用 い た 。

6 プ ラ ス ミ ド 制 限 酵 素 断 片 長 多 型 （ RFLP） 解 析

9

制 限 酵 素SalI（ 東 洋 紡 , 大 阪 ）も し く は ， EcoRI（ 東 洋 紡 ）に よ り 37℃ で 2時

間 消 化 し ， 電 気 泳 動 後 エ チ ジ ム ム ブ ロ マ イ ド 染 色 し ，UV光 下 に て 観 察 し た 。

な お ，DNAサ イ ズ マ ー カ ー と し て λ DNA HindⅢ digestを （ New England

BioLabs） 用 い た 。

7 薬 剤 耐 性 プ ラ ス ミ ド 伝 達 性 試 験

供 与 株 は 表 １ に 示 し た 農 場 毎 の14株 ， 受 容 株 は 大 腸 菌 XL1-blue株 （ NA耐

性 ）を 用 い ，Tryptic Soy Broth（ Becton Dickinson, Sparks，NV）に ，37℃

で 一 夜 ， 前 者 は0.5 ml静 置 培 養 ， 後 者 は 2 ml振 盪 培 養 を そ れ ぞ れ 行 っ た 。 こ の 両 者 を 混 合 し た 菌 液 を ，37℃ で 8時 間 培 養 し ， さ ら に 室 温 に て 24時 間 静 置 培 養 を 実 施 し た 。 そ の 後 ， 混 合 培 養 液 を 薬 剤 含 有 （NA： 100 µg/mlと ABPC ま た はSM： 50 µg/ml） の DHL培 地 （ 栄 研 化 学 ， 東 京 ） に 接 種 し ， 37℃ 24時 間 培 養 し た 。 発 育 し た コ ロ ニ ー を 継 代 後 ， プ ラ ス ミ ド プ ロ フ ァ イ ル ， 薬 剤 感 受 性 試 験 ，RFLP解 析 を 実 施 し た 。

8 Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)に よ る 遺 伝 子 型 解 析

ゲ ノ ムDNAは Akibaら の 方 法 （ 2） に よ り 抽 出 し ， XbaIも し く は BlnI（ と

も に タ カ ラ バ イ オ ，滋 賀 ））で 消 化 し た 。PFGEに は CHEFF DR Ⅲ（ Bio-rad）

を 用 い ，1％ megabase agarose gel （ Bio-rad） に て 0.6 V/cm， パ ル ス タ イ

ム5 ‐ 50 秒 の 条 件 下 で 22 時 間 電 気 泳 動 し た 。 DNA サ イ ズ マ ー カ ー は

Lambda Ladder PFG Marker（ New England BioLabs）を 使 用 し た 。 PFGE

泳 動 像 は Bio Numerics software (Applied Maths BVBA ，

Sint-Martens-Latem，Belgium)を 用 い て 解 析 し ，系 統 樹 解 析 は ，unweighted pair group method arithmetic mean（ UPGMA）法 を 用 い て 実 施 し た 。な お ，

10

過 去 の 報 告 （81） か ら ， 80 ％ 以 上 の 類 似 度 を 示 し た 株 を 同 一 群 と し た 。

9 gyrA遺 伝 子 の 塩 基 配 列 解 析

16-117 株gyrAのPCR増 幅 産 物 は ， ABI Prism BigDye Terminator v3.1

Cycle Sequencing Kit（ Applied Biosystems, Foster City, CA）を 用 い ，ABI 3100 DNA Genetic Analyzer（ Applied Biosystems） に よ り 塩 基 配 列 解 析 を

行 い ， Basic Local Alignment Serach Tool （ BLAST ：

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ ） に て ， 得 ら れ た 塩 基 配 列 に つ い て S.

Typhimurium LT2株 （ Gene Accession Number： AE006468.1） と の 相 同 性 を 検 索 し た 。 結 果 1 同一農場で分離された菌株の比較と2004年に分離された農場間の疫学調査 試 験 に 供 し た 各 農 場 由 来3株 は ， 下 記 に 記 載 さ れ た 結 果 に お い て ， 代 表 株 （A農 場 ： 4-70株 ， B農 場 ： 4-117株 ， C農 場 ： 6-95株 ， D農 場 ： 7-63株 ， E農 場：7-82株 ，F農 場：7-115株 ，G農 場：7-131株 ，H農 場：10-112株 ，I農 場 ： 16-74株 ， J農 場 ： 16-99株 ， K農 場 ： 16-117株 ， L農 場 ： 16-120株 ， M農 場 ： 16-132株 ， N農 場 ： 16-144株 ） と す べ て 一 致 し た 結 果 と な っ た 。 2004年 に サ ル モ ネ ラ 症 が 発 生 し た 6農 場 （ I， J， K， L， Mお よ び N農 場 ） を 調 査 し た 結 果 ，Iお よ び N農 場 は 同 系 統 の 農 業 組 合 に 所 属 し ，集 乳 車 ，臨 床 獣 医 師 お よ び 飼 料 会 社 が 同 一 で あ り ， 疫 学 的 関 連 性 が 認 め ら れ た 。 そ の 他 の 農 場 間 で は 疫 学 的 関 連 性 が 確 認 さ れ な か っ た 。牛 サ ル モ ネ ラ 症 発 生 時 期 は ，I お よ びJ農 場 の 発 生 期 間 内 に Lお よ び N農 場 と M農 場 が 続 発 し た 。 ま た ， I， L

11

お よ びN農 場 間 と Jお よ び M農 場 間 の 距 離 は そ れ ぞ れ 7‐ 10 kmで あ っ た 。

2 分 離 株 の 表 現 型 別

薬 剤 耐 性 型 は6種 類 に 分 類 さ れ（ ① ABPC, SM, TC, CPお よ び SUL耐 性 ，②

ABPC, SM, KM, TC, CPお よ び SUL耐 性 ，③ ABPC, SM, TCお よ び SUL耐 性 ， ④SMお よ び SUL耐 性 ，⑤ ABPC, SM, KM, TCお よ び SUL耐 性 ，⑥ ABPC, SM, TC, CP, SULお よ び NA耐 性 ）， 4剤 以 上 耐 性 を 示 す 多 剤 耐 性 株 が G農 場 以 外 の 13農 場 (92.9%)と 大 多 数 を 占 め て い た（ 表 １ ）。ま た ，薬 剤 耐 性 型 は DT104に

特 徴 的 なABPC, SM, TC, CPお よ び SULの 5剤 耐 性 が 6農 場（ A，C，D，E，F

お よ びH農 場 ， 42.9％ ） と 最 も 多 か っ た （ 表 1）。 な お ， CEZ， CTF， TMPお よ びERFXの 4剤 に つ い て は ， 耐 性 株 が 確 認 さ れ な か っ た 。 フ ァ ー ジ 型 別 で はDT104に 典 型 的 な 5薬 剤 耐 性 型 が 分 離 さ れ た 6農 場 （ A， C，D，E，Fお よ び H農 場 ）に 加 え ，そ の 他 の 薬 剤 耐 性 型 を 示 し た 4農 場（ I， K，Lお よ び N農 場 ）の 計 10農 場（ 71.4％ ）で DT104と 型 別 さ れ た 。ま た ，DT208 と 型 別 さ れ た も の が2農 場（ Jお よ び M農 場 ，12.3％ ），フ ァ ー ジ 型 別 不 能 お よ び い く つ か の フ ァ ー ジ に は 感 受 性 を 示 し た が ， 既 知 の 型 別 に 該 当 し な い も の （RDNC： reacted but did not conform with clear phage types ） が そ れ ぞ れ1農 場 （ Bお よ び G農 場 ） で 確 認 さ れ た （ 表 1）。

3 分 離 株 の 遺 伝 子 型 別 お よ プ ラ ス ミ ド 解 析

PCRに よ り 各 遺 伝 子 を 検 索 し た 結 果 ，mdhは す べ て の 株 で 増 幅 産 物 が 確 認

さ れ ，class I integlonで は 1000お よ び 1200 bpが 検 出 さ れ た も の が 10農 場（ A，

C，D，E，F，H，I，K，Lお よ び N農 場 ，71.4％ ）で ，1000 bpの み が 2農 場 （Jお よ び M農 場 ，12.3％ ）で 確 認 さ れ た（ 表 1）。DT104特 異 配 列 で あ る 162

12

bpの 増 幅 産 物 は ，10農 場（ A，C，D，E，F，H，I，K，Lお よ び N農 場 ，71.4％ ）

で 確 認 さ れ ，spvCはB農 場 以 外 の 13農 場（ 92.9％ ）で 増 幅 産 物 が 認 め ら れ た 。

プ ラ ス ミ ド プ ロ フ ァ イ ル で は5つ の 型 に 分 類 さ れ（ ① 95 kbp，② 190, 45, 7.2

お よ び3.5 kbp， ③ 95, 3.3お よ び 2.4kbp， ④ 95お よ び 4.3kbp， ⑤ 165kbp），

95 kbpプ ラ ス ミ ド の み を 保 有 す る も の が 9農 場 （ A， C， D， E， F， H， I， L

お よ びN農 場 ，64.3％ ）と 最 も 多 か っ た（ 表 1）。そ の 他 で は ，165 kbpプ ラ ス ミ ド 単 独 保 有 が2農 場 （ Jお よ び M農 場 ， 12.3％ ）， 190 kbpと 他 3つ の 低 分 子 プ ラ ス ミ ド を 保 有 す る も の がB農 場 で ， 95 kbpと 他 2つ も し く は 1つ の 低 分 子 プ ラ ス ミ ド を 保 有 す る も の が2農 場（ Gお よ び K農 場 ，12.3％ ）で 確 認 さ れ た (表 1)。 薬 剤 耐 性 プ ラ ス ミ ド 伝 達 性 試 験 で はB農 場 由 来 株（ 4-117株 ）を 供 給 株 と し て 用 い た 試 験 の み で ， ト ラ ン ス コ ン ジ ュ ガ ン ト が 得 ら れ た 。 得 ら れ た ト ラ ン ス コ ン ジ ュ ガ ン ト は 供 給 株 の190 kbpプ ラ ス ミ ド（ 図 1，矢 印 ）と 同 等 の プ ラ ス ミ ド を 保 有 し ， ト ラ ン ス コ ン ジ ュ ガ ン ト の 薬 剤 耐 性 試 験 で は ， 供 給 株 と 同 じABPC, SM, KM, TC, CPお よ び SULの 6薬 剤 に 耐 性 を 示 し て い た 。 ま た ， こ の プ ラ ス ミ ド と95 kbpお よ び 165 kbpの RFLP解 析 を 実 施 し た 結 果 ，95 kbp と165 kbpプ ラ ス ミ ド が SalI消 化 像 で 10本 中 8本（ 図 2A），EcoRI消 化 像 で 7本 中4本 （ 図 2B） の バ ン ド が 一 致 し ， 190 kbpプ ラ ス ミ ド は 他 の 2つ と 泳 動 像 が 大 き く 異 な っ て い た 。

PFGE解 析 で は XbaIで 3つ （ X1~3： 図 3A）， BlnIで 4つ （ B1~4： 図 3B） の

ク ラ ス タ ー に 分 類 さ れ た 。 該 当 す る 株 が 最 も 多 い ク ラ ス タ ー はX1お よ び B1

で ， 共 通 し た10株 が こ れ ら の ク ラ ス タ ー に 分 類 さ れ ， さ ら に 前 者 で は 2つ ，

13

4 塩 基 配 列 解 析

NA 耐 性 が 確 認 さ れ た 16-117 株 の gyrA に つ い て ， BLAST に よ りS.

Typhimurium LT2株 （ Gene Accession Number： AE006468.1） と 比 較 し た

結 果 ，87番 目 の ア ス パ ラ ギ ン 酸 （ Asp87） が ア ス パ ラ ギ ン Asnに 置 換 さ れ て い る こ と が 確 認 さ れ ， そ の 他 は 一 致 し て い た (図 4)。 考 察 本 章 で は1農 場 毎 に 3株 解 析 し た が ，農 場 毎 の 3株 は 薬 剤 耐 性 型 ，PFGE型 等 の す べ て の 性 状 が 一 致 し た 。 こ の こ と は ， 各 農 場 の 牛 サ ル モ ネ ラ 症 は 農 場 内 に 単 一 の 株 が 侵 入 し た こ と に よ り 発 生 し た と 推 測 さ れ た 。 フ ァ ー ジ 型 別 で は ， 福 島 県 に お い て も1992年 に は DT104が 分 離 さ れ （ A農 場 ）， そ の 後 も 多 数 を 占 め た こ と が 確 認 さ れ た （ 表1）。 こ の こ と は ， DT104 が 国 内 の 牛 由 来 株 で1990 年 代 初 期 に 分 離 さ れ ， そ の 後 増 加 し た と い う Sameshimaら （ 69） の 報 告 と 一 致 し た 。

PCRに て 検 索 し た Integlonと は ，DNA鎖 切 断 と 再 結 合 に 関 与 す る integrase の 下 流 に 様 々 な 遺 伝 子 断 片 を 挿 入 蓄 積 す る 単 位 で あ り ， 現 在 ク ラ ス Ⅰ ‐ Ⅳ の 4種 類 が 報 告 さ れ て い る（ 50）。DT104の 多 剤 耐 性 遺 伝 子 は classⅠ integlonに

担 わ れ て お り ，DT104 の 一 般 的 な 耐 性 パ タ ー ン で は ， 染 色 体 上 に ２ つ の

integlonが 存 在 す る （ 37）。 DT104の integlon 3’-末 端 領 域 に は サ ル フ ァ 剤 耐

性 遺 伝 子 ，PCR増 幅 産 物 の 1000 bpは SM耐 性 遺 伝 子 で あ るaadAが ，1200 bp

に はABPC耐 性 遺 伝 子 で あ るblaPS E1が コ ー ド さ れ ，CP耐 性 遺 伝 子 (floR)と TC

耐 性 遺 伝 子(tetR)は ， こ の 2つ の integlon間 に 存 在 し ，ひ と ま と め に さ れ て い

14 可 能 で あ り ， 家 畜 衛 生 分 野 で は ， ほ ぼ 実 施 さ れ て い な い の が 現 状 で あ る 。 本 章 に お い て ，DT104に 特 徴 的 な 2つ の integlon増 幅 産 物（ 1000 kbpお よ び 1200 kbp） が 確 認 さ れ ， そ れ ら で は DT104特 異 配 列 を 標 的 と し た PCRに つ い て も す べ て の 株 で 陽 性 で あ っ た （ 表1）。 こ の こ と か ら ， integlonお よ び DT104特 異 配 列 を 標 的 と し たPCRの 実 施 は DT104の ス ク リ ー ニ ン グ 検 査 と し て 応 用 可 能 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 フ ァ ー ジ 型 別 検 査 でDT104と 型 別 さ れ た 株 は ，す べ て 95 kbpの プ ラ ス ミ ド を 保 有 し（ 表1），2つ の 制 限 酵 素 を 用 い た PFGE解 析 に お い て も ，す べ て の 株 が そ れ ぞ れ 同 じ ク ラ ス タ ー 内（X1お よ び B1）に 属 し て い た 。ま た ，X1で は 2 つ の プ ロ フ ァ イ ル に 細 分 化 さ れ た の に 対 し ，B1で は 4つ の プ ロ フ ァ イ ル に 分 類 さ れ た （ 図3）。 6カ 国 か ら 分 離 さ れ た DT104の 遺 伝 子 型 別 で は す べ て の 株

で ，95 kbpプ ラ ス ミ ド を 保 有 し て お り ， PFGEで は XbaIよ り BlnIの 識 別 能 力

が 高 か っ た と 報 告 さ れ て い る （12， 56）。 こ の こ と は ， 本 章 の DT104遺 伝 子

解 析 結 果 と 一 致 し て お り ，国 内 に お い て 分 離 さ れ たDT104に お い て も BlnIを

用 い たPFGE解 析 が 有 用 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。

DT104の 薬 剤 耐 性 に つ い て は こ の 株 の 典 型 的 な 薬 剤 耐 性 型 で あ る ABPC, SM, TC, CPお よ び SULの 5剤 耐 性 の 他 に ，ABPC, SM, TCお よ び SULの 4剤 耐 性 株 ，ABPC, SM, TC, CP, SULお よ び NAの 6剤 耐 性 株 に つ い て も DT104と 型

別 さ れ た（ 表1）。国 内 で は CP感 受 性 ４ 耐 性 DT104の 報 告 は さ れ て い な い（ 23，

47，49）。DT104の 多 剤 耐 性 はSalmonella genomic island 1 (SGI1)と 呼 ば れ

る 染 色 体 上 の 約43 kbpの 領 域 に 存 在 し て い る （ 51）。 そ の 3’側 ， 約 13 kbpは

class I integlon構 造 を と っ て お り ，In104と も 呼 ば れ る（ 51）。SGI1に は In104

内 の 変 異 に 基 づ く バ リ ア ン ト が 報 告 さ れ て お り（17），16-74株 ，16-120株 お

15 れ る バ リ ア ン ト 保 有 株 の 薬 剤 耐 性 型 と 一 致 す る 。SGI1-Eは 分 子 内 に お け る IS6100転 移 に 基 づ くfloR遺 伝 子 の 不 活 化 と ，そ れ に 引 き 続 くIS6100配 列 を 介 し た 相 同 組 換 え に よ り 派 生 し た の で は な い か と 考 え ら れ て い る （17）。 他 の DT104と 同 じ PFGE型 に 属 し た 16-74株 ， 16-120株 お よ び 16-144株 に つ い て も ，上 記 の 変 異 に よ りfloR遺 伝 子 が 不 活 化 し た 結 果 ，CP感 受 性 と な っ た の で は な い か と 考 え ら れ た 。 オ ー ル ド キ ノ ロ ン 系 で あ るNA に 耐 性 を 示 し た 16-117 株 に つ い て は ， gyrA遺 伝 子 の 変 異 が 確 認 さ れ た （ 図4）。 キ ノ ロ ン 系 薬 剤 耐 性 は DNAジ ャ イ

レ ー ス で あ るgyrA，gyrB，parC お よ びparE領 域 に お け る 遺 伝 子 の 変 異 が

耐 性 メ カ ニ ズ ム に 関 与 し て お り ， サ ル モ ネ ラ に お い て ，gyrAが 特 に 重 要 で

あ る と 考 え ら れ て い る （25，36）。こ の GyrAの 主 要 な ア ミ ノ 酸 が 1箇 所 置 換

す る こ と に よ っ て ，NAな ど の オ ー ル ド キ ノ ロ ン 系 薬 剤 に 耐 性 を 獲 得 し ， ニ

ュ ー キ ノ ロ ン 系 薬 剤 の 感 受 性 も 低 下 す る（63，66）。こ の こ と か ら ，16-117

株 で は ，GyrAの Asp87が Asnへ 置 換 さ れ た こ と に よ り ， NA耐 性 を 獲 得 し た

と 考 え ら れ る 。Esakiら （ 29） は 国 内 に お け る 牛 由 来 DT104 NA耐 性 株 は す

べ てGyrAの Asp87が Glyに 置 換 し た も の と 報 告 し て お り ，本 章 の 結 果 と は 異

な っ て い た 。 ニ ュ ー キ ノ ロ ン 耐 性S. Typhimuriumで は 今 回 確 認 さ れ た ア ミ

ノ 酸 置 換 に 加 え さ ら にGyrAで Ser83→ Phe， ParCで Ser80→ Argと ３ ア ミ ノ

酸 の 同 時 置 換 が 報 告 さ れ て い る （52）。 ニ ュ ー キ ノ ロ ン 系 薬 剤 の 乱 用 に よ っ

て 本 章 で 認 め ら れ たNA耐 性 株 が ，さ ら にgyrAやparCの 変 異 を 蓄 積 し ，ニ ュ

ー キ ノ ロ ン 系 薬 剤 に 耐 性 を も つ 可 能 性 が あ る 。 キ ノ ロ ン 耐 性 S.

Typhimuriumは 世 界 的 な 規 模 で 増 加 が 確 認 さ れ て お り （ 9）， ニ ュ ー キ ノ ロ

ン 系 薬 剤 は ヒ ト の サ ル モ ネ ラ 症 の 第1選 択 薬 で あ る こ と か ら も （ 4， 10)， 今

16 1993年 に 分 離 さ れ た 4-117株（ B農 場 ）は プ ラ ス ミ ド 伝 達 性 試 験 か ら ABPC, SM, KM, TC, CPお よ び SUL耐 性 遺 伝 子 が 存 在 す る 190 kbp 薬 剤 耐 性 プ ラ ス ミ ド 保 有 株 で あ る こ と が 確 認 さ れ た （ 表1， 図 1）。 ま た ， こ の 株 は 病 原 性 プ ラ ス ミ ド に 存 在 す るspvC遺 伝 子 が 検 出 で き ず ，RFLP解 析 に お い て も 190 kbp 薬 剤 耐 性 プ ラ ス ミ ド と ST特 異 的 病 原 性 プ ラ ス ミ ド で は ， 異 な る 泳 動 像 を 示 し た （ 図2）。 こ の こ と か ら ， 190 kbpプ ラ ス ミ ド は サ ル モ ネ ラ 病 原 性 プ ラ ス ミ ド と 全 く 異 な る 薬 剤 耐 性 プ ラ ス ミ ド で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 2004年 に 分 離 さ れ た Jお よ び M農 場 由 来 株 （ 16-99株 ， 16-132株 ） は ， フ ァ ー ジ 型DT208と 型 別 さ れ た （ 表 1）。 1980年 か ら 2000年 に 国 内 で ヒ ト お よ び 家 畜 か ら 分 離 さ れ たS. Typhimurium 221株 の 型 別 結 果 で は ， DT208は 3 株 の み 確 認 さ れ ， 本 章 と 同 様 のABPC, SM, KM, TC, SUL耐 性 に つ い て は ， 1株 の み で あ っ た（ 43）。本 章 で 分 離 さ れ た DT208（ 16-99株 ，16-132株 ）は ， 病 原 性 プ ラ ス ミ ド 上 のspvC 遺 伝 子 が 確 認 さ れ た こ と ， プ ラ ス ミ ドRFLP解 析 か ら ， こ の 分 離 株 が 保 有 す る165 kbp プ ラ ス ミ ド が 95 kbp S. Typhimurium特 異 的 病 原 性 プ ラ ス ミ ド と 近 縁 な プ ラ ス ミ ド で あ っ た こ と か ら ， こ の 株 は サ ル モ ネ ラ 病 原 性 プ ラ ス ミ ド に 何 ら か の 遺 伝 子 が 挿 入 さ れ た 165kbp病 原 性 プ ラ ス ミ ド を 保 有 し て い た と 考 え ら れ た 。 2004年 に 分 離 さ れ た I， Lお よ び N農 場 と Jお よ び M農 場 か ら 分 離 さ れ た 株 は ，そ れ ぞ れ の 農 場 間 で 表 現 型 お よ び 遺 伝 学 的 性 状 に つ い て す べ て 一 致 し て い た （ 表1）。 農 場 間 の 疫 学 調 査 で は Iお よ び N農 場 間 に の み 関 連 が 認 め ら れ た だ け で あ っ た が ，I， Lお よ び N農 場 と Jお よ び M農 場 で 牛 サ ル モ ネ ラ 症 発 生 時 期 が 一 致 し て い た 。 こ の こ と か ら ，I， Lお よ び N農 場 間 と Jお よ び M農 場 間 で ，そ れ ぞ れ 同 一 株 の 伝 播 に よ り 牛 サ ル モ ネ ラ 症 が 発 生 し た と 考 え ら れ ， 疫 学 的 関 連 性 が 見 出 せ な いIお よ び L農 場 間 も し く は Lお よ び N農 場 間 と Jお

17 よ びM農 場 間 に お い て も ，発 生 農 場 か ら の サ ル モ ネ ラ の 伝 播 の 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。こ の こ と か ら ，サ ル モ ネ ラ を 保 菌 し て い る 可 能 性 が あ る 野 鳥 や ネ ズ ミ の よ う な 野 生 動 物 侵 入 防 止 や 農 場 周 辺 の 消 石 灰 散 布 や 靴 底 消 毒 等 の 徹 底 に よ り ，飼 養 衛 生 管 理 を 向 上 し ，伝 染 病 の 侵 入 防 止 に 努 め る こ と が 重 要 で あ る と 考 え ら れ た 。 以 上 ，4剤 以 上 耐 性 を 示 す 株 の 分 離 率 は 14株 中 13株 と 非 常 に 高 率 で あ り ， 国 内 のDT104に つ い て 典 型 的 な 5剤 耐 性 の み な ら ず CP感 受 性 4剤 耐 性 株 や NA 耐 性 株 の 国 内 の 存 在 に つ い て 明 ら か に し た 。 ま た ，DT104の ス ク リ ー ニ ン グ 検 査 法 と し て ，integlonと DT104特 異 配 列 を タ ー ゲ ッ ト に し た PCRが 有 用 で あ る こ と ，PFGEで は BlnIで 識 別 能 力 が 高 い こ と を 明 ら か に し た 。 サ ル モ ネ ラ の 農 場 間 伝 播 で は ， 牛 サ ル モ ネ ラ 症 発 生 農 場 間 の 疫 学 的 関 連 性 が 見 出 せ な く と も 農 場 間 伝 播 が 起 こ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 今 後 ， サ ル モ ネ ラ の 薬 剤 耐 性 モ ニ タ リ ン グ を 充 実 し ， 耐 性 菌 出 現 状 況 を 把 握 す る と と も に ， 飼 養 衛 生 対 策 の 徹 底 に よ り 農 場 内 外 の サ ル モ ネ ラ の 伝 播 を 防 止 し ， 菌 へ の 抗 生 剤 暴 露 を 最 小 限 に 抑 え る 必 要 が あ る 。

18 表1 1992年から2004年に福島県で分離されたS. Typhimuriumの性状 mdh classⅠ integron（bp） DT104特異 配列 spvC A 4-70 1992 　ABPC, SM, TC, CP, SUL DT104 95 ＋ 1000, 1200 ＋ ＋ B 4-117 1993 　ABPC, SM, KM, TC, CP, SUL UT 190, 45, 7.2, 3.5 ＋ － － － C 6-95 1993 　ABPC, SM, TC, CP, SUL DT104 95 ＋ 1000, 1200 ＋ ＋ D 7-63 1993 　ABPC, SM, TC, CP, SUL DT104 95 ＋ 1000, 1200 ＋ ＋ E 7-82 1993 　ABPC, SM, TC, CP, SUL DT104 95 ＋ 1000, 1200 ＋ ＋ F 7-115 1993 　ABPC, SM, TC, CP, SUL DT104 95 ＋ 1000, 1200 ＋ ＋ G 7-131 1993 　SM, SUL RDNC 95, 3.3, 2.4 ＋ － － ＋ H 10-112 1993 　ABPC, SM, TC, CP, SUL DT104 95 ＋ 1000, 1200 ＋ ＋ I 16-74 1993 　ABPC, SM, TC, SUL DT104 95 ＋ 1000, 1200 ＋ ＋ J 16-99 1993 　ABPC, SM, KM, TC, SUL DT208 165 ＋ 1000 － ＋ K 16-117 1993 　ABPC, SM, TC, CP, SUL, NA DT104 95, 4.3 ＋ 1000, 1200 ＋ ＋ L 16-120 1993 　ABPC, SM, TC, SUL DT104 95 ＋ 1000, 1200 ＋ ＋ M 16-132 1993 　ABPC, SM, KM, TC, SUL DT208 165 ＋ 1000 － ＋ N 16-144 1993 　ABPC, SM, TC, SUL DT104 95 ＋ 1000, 1200 ＋ ＋ プラスミド (kbp) 分離年 _{薬剤耐性パターン}a) PCRによる検出c) 分離 農場 分離株 ファージ型b)

a) ABPC：ｱﾝﾋﾟｼﾘﾝ, SM：ｽﾄﾚﾌﾟﾄﾏｲｼﾝ, KM：ｶﾅﾏｲｼﾝ, TC：ﾃﾄﾗｻｲｸﾘﾝ, CP：ｸﾛﾗﾑﾌｪﾆｺｰﾙ, SUL：サルファ剤, NA：ﾅﾘｼﾞｸｽ酸 b) UT： ファージ型別不能 RDNC：いくつかのファージには感受性を示したが，既知の型別に該当しない

19 表2 PCRプライマー

標的配列または

遺伝子

塩基配列（5’→3’）

増幅産物（bp）

引用文献

mdh

TGCCAACGGAAGTTGAAGTG

216

53

CGCATTCCACCACGCCCTTC

classⅠinteglon

GGCATCCAAGCAGCAAGC

1000, 1200

55

AAGCAGACTTGACCTGAT

DT104特異配列

a)

GTCAGCAGTGTATGGAGCGA

162

49, 65

AGTAGCGCCAGGACTCGTTA

spvC

TTGTAGCTGCTTATGATGGGGCGG

472

67

TGGAGAAACGACGCACTGTACTGC

gyrA

CGTTGGTGACGTAATCGGTA

251

24

CCGTACCGTCATAGTTATCC

a) 16S-23S rRNAスペーサー領域に存在するDT104関連株の特異配列の増幅

20

図1 異 な る 泳 動 像 を 示 し たS. Typhimuriumの プ ラ ス ミ ド プ ロ フ ァ イ ル

Ⅰ ：BAC-Tracker Supercoiled DNA ladder， Ⅱ ： 4‐ 70株 （ 95 kbp）， Ⅲ ：

4‐ 117株 （ 190， 45， 7.2， 3.5 kbp）， Ⅳ ： 7－ 131株 （ 95， 3.3， 2.4 kp）

Ⅴ ：16－ 99株 （ 165 kbp）， Ⅵ ： 16－ 117株 （ 95， 4.3 kbp） Ⅶ ： supercoiled

21

図2 190 kbp， 95 kbpお よ び 165 kbpプ ラ ス ミ ド の SalI(A)お よ び EcoRI(B)

消 化 に よ るRFLP像

Ⅰ ：190 kbp 薬 剤 耐 性 プ ラ ス ミ ド ， Ⅱ ： 95 kbpプ ラ ス ミ ド ， Ⅲ ： 165 kbp

22

図3 1992年 か ら 2004年 に 福 島 県 で 分 離 さ れ たS. Typhimuriumの

23 図4 16-117株 とS. Typhimurium LT2株 のgyrAの 比 較 Ⅰ ：S. Typhimurium LT2株 gyrA（ 上 段 ： ア ミ ノ 酸 ， 下 段 ： 塩 基 配 列 ） Ⅱ ：16-117株 gyrA（ 上 段 ： 塩 基 配 列 ， 下 段 ： ア ミ ノ 酸 ） 下 線 部 ： 塩 基 配 列 変 異 ， ア ミ ノ 酸 置 換 部 位 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86

Val Gly Asp Val Ile Gly Lys Trp His Pro His Gly Asp Ser Ala Val Trp

GTT GGT GAC GTA ATC GGT AAA TAC CAT CCC CAC GGC GAT TCC GCA GTG TAT GTT GGT GAC GTA ATC GGT AAA TAC CAT CCC CAC GGC GAT TCC GCA GTG TAT

Val Gly Asp Val Ile Gly Lys Trp His Pro His Gly Asp Ser Ala Val Trp

87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103

Asp Thr Ile Val Arg Met Ala Gln Pro Phe Ser Leu Arg Trp Met Leu Val

GAC ACC ATC GTT CGT ATG GCG CAG CCA TTC TCG CTG CGT TAC ATG CTG GTG AAC ACC ATC GTT CGT ATG GCG CAG CCA TTC TCG CTG CGT TAC ATG CTG GTG

Asn Thr Ile Val Arg Met Ala Gln Pro Phe Ser Leu Arg Trp Met Leu Val

104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 Asp Gly Gln Gly Asn Phe Gly Ser Ile Asp Gly Asp Ser Ala Ala Ala

GAT GGT CTG GGT AAC TTC GGT TCT ATT GAC GGC GAC TCC GCG GCG GCA GAT GGT CTG GGT AAC TTC GGT TCT ATT GAC GGC GAC TCC GCG GCG GCA

Asp Gly Gln Gly Asn Phe Gly Ser Ile Asp Gly Asp Ser Ala Ala Ala

120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 144 145 Met Arg Trp Thr Glu Ile Arg Leu Ala Lys Ala Ala His Glu Leu Met

ATG CGT TAT ACG GAG ATC CGT CTG GCG AAA ATC GCC CAC GAA CTG ATG ATG CGT TAT ACG GAG ATC CGT CTG GCG AAA ATC GCC CAC GAA CTG ATG

Met Arg Trp Thr Glu Ile Arg Leu Ala Lys Ala Ala His Glu Leu Met

146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 Ala Asp Leu Glu Lys Glu Thr Val Arg Phe Val Asp Asn Trp Asp Gly

GCC GAT CTC GAA AAA GAG ACG GTG GAT TTC GTG GAT AAC TAT GAC GGT GCC GAT CTC GAA AAA GAG ACG GTG GAT TTC GTG GAT AAC TAT GAC GGT

Ala Asp Leu Glu Lys Glu Thr Val Arg Phe Val Asp Asn Trp Asp Gly アミノ酸番号 Ⅰ Ⅱ アミノ酸番号 アミノ酸番号 アミノ酸番号 アミノ酸番号 Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅱ Ⅱ Ⅱ Ⅱ

24

第 二 章

国 内 で 初 め て 分 離 さ れ た 牛 由 来 広 域 セ フ ァ ロ ス ポ

リ ン 系 薬 剤 耐 性

Salmonella

Typhimuriumの性状解析

序 論

第 一 章 で は1990年 代 か ら DT104に よ る 牛 サ ル モ ネ ラ 症 が 発 生 し た こ と を 改 め て 明 ら か に し ，DT104の ス ク リ ー ニ ン グ 検 査 法 に つ い て 示 し た 。さ ら に ， 国 内 で 典 型 的 な5薬 剤 耐 性（ ABPC, SM, TC, CPお よ び SUL耐 性 ）と は 異 な る DT104が 存 在 し た こ と ，疫 学 的 関 連 性 の な い 農 場 間 で の 牛 サ ル モ ネ ラ 症 の 伝 播 に つ い て 示 唆 し ， 飼 養 衛 生 意 識 の 向 上 に よ る 伝 染 病 侵 入 防 止 の 重 要 性 に つ い て 示 し た 。 ヒ ト の 非 チ フ ス 性 サ ル モ ネ ラ 症 で ， 乳 幼 児 や 高 齢 者 が 感 染 し た 場 合 に は ， 抗 生 物 質 投 与 が 必 要 と な り ， 特 に 小 児 の 場 合 ， ニ ュ ー キ ノ ロ ン に は 関 節 軟 骨 の 損 傷 作 用 が あ る た め ，ESCが 選 択 さ れ る こ と が 多 い （ 7， 14， 30， 40） 。 そ の た め ，ESC耐 性 サ ル モ ネ ラ の 出 現 は 公 衆 衛 生 上 ， 非 常 に 重 要 な 問 題 で あ

る 。 国 内 で は ，Japanese Veterinary Antimicrobial Resistance Monitoring

（JVARM） と 呼 ば れ る 家 畜 衛 生 分 野 で の 薬 剤 耐 性 モ ニ タ リ ン グ が 行 わ れ て い る 。こ の 調 査 で1999年 か ら 2005年 ま で に 分 離 さ れ た 牛 由 来 サ ル モ ネ ラ に お い て ，セ フ ァ ロ ス ポ リ ン 系 薬 剤 に つ い て は す べ て 感 受 性 で あ っ た が（8，28, 29， 47） ， 2007年 ， 福 島 県 に お い て 異 な る 2つ の 牛 サ ル モ ネ ラ 症 発 生 農 場 で ESC 耐 性S. Typhimuriumが 分 離 さ れ た 。 本 章 で は 国 内 で 初 め て 分 離 さ れ た 牛 由 来ESC耐 性S. Typhimuriumに つ い て ，ESC耐 性 の 機 序 ， 遺 伝 子 型 の 特 徴 や 表 現 型 別 を 明 ら か に し ， 諸 外 国 で 報 告 さ れ て い る 株(21， 23， 32， 57)と の 比 較 ， 検 討 を 行 っ た 。

25 材 料 お よ び 方 法 1 分 離 株 に つ い て の 疫 学 的 概 要 供 試 株 と し て ，S. Typhimurium 19-80株 お よ び L-3695株 を 用 い た 。 19-80株 は 2007年 7月 福 島 県 で ，搾 乳 牛 の 牛 サ ル モ ネ ラ 症 下 痢 便 か ら 分 離 さ れ た 。 症 状 は 発 熱 ， 乳 量 低 下 ， 下 痢 お よ び 流 産 が 確 認 さ れ ， 牛 群 全 体 に 広 が っ た 。 当 該 農 場 は 過 去3年 間 ， 牛 の 導 入 が な か っ た 。 L-3695株 は 2007年 11月 福 島 県 で ，交 雑 種 育 成 農 場 の 子 牛 下 痢 便 か ら 分 離 さ れ た 。症 状 は2週 齢 か ら 3ヶ 月 齢 の 子 牛 で 下 痢 ，敗 血 症 が 認 め ら れ た 。当 該 農 場 は 通 年 隔 週 毎 に 山 形 県 か ら 子 牛 を10頭 程 度 導 入 し て い た 。 こ の2つ の 農 場 間 の 距 離 は 約 55 kmで あ り ，農 場 間 の 疫 学 的 関 連 性 は 確 認 さ れ な か っ た 。 ま た ， 両 農 場 と も に 過 去 に 牛 サ ル モ ネ ラ 症 の 発 生 は な く ， 牛 サ ル モ ネ ラ 症 と 診 断 さ れ る 前 に ，CEZの 投 与 を 実 施 し て い た 。 2 使 用 菌 株 19-80株 お よ び L-3695株 は DHL寒 天 培 地 （ 栄 研 ） の コ ロ ニ ー 形 態 を 基 に 分 離 し ， 既 報 の 生 化 学 性 状 検 査 （26）に 基 づ き 同 定 し た 。サ ル モ ネ ラ 血 清 型 別 はKauffmann-Whiteの 抗 原 構 造 に 基 づ く 分 類（ 64）に 従 い ，サ ル モ ネ ラ O抗 原 お よ びH抗 原 の 抗 血 清（ デ ン カ 生 研 ，東 京 ）を 用 い た 方 法 に よ り 決 定 し た 。 な お ，分 離 株 は 試 験 に 供 す る ま で ，25％ グ リ セ ロ ー ル 加 ト リ プ ト ソ ー ヤ 培 地 （ 日 水 製 薬 ） に て －80℃ で 保 存 し た 。 3 薬 剤 感 受 性 試 験 平 板 寒 天 希 釈 法 に よ る 最 小 発 育 濃 度 の 測 定 はCLSI（ 59）に 基 づ き 実 施 し た 。

26

な お ，S. aureus ATCC 29213, E. faecalis ATCC 29212, E. coli ATCC 25922

お よ び P. aeruginosa ATCC 27853 を 標 準 管 理 菌 株 と し て 用 い た 。供 試 薬 剤

は ，ABPC， CEZ， セ フ ォ キ シ チ ン （ CFX）， CTF， セ フ タ ジ ジ ム （ CAZ），

セ フ ト リ ア キ ソ ン （CTRX）， セ フ ェ ピ ム （ CFPM）， SM， KM， ゲ ン タ マ イ

シ ン （GM），TC， CP，NAお よ び ERFXの 14薬 剤 を 用 い た 。ブ レ イ ク ポ イ ン

ト はCFTお よ び ERFXで は ， 既 知 の 報 告 （ 28， 41） に 準 じ て 設 定 し ， そ の 他

の 薬 剤 に つ い て は ，CLSI（ 60） に 基 づ き 設 定 し た （ 60）。

4 分 離 株 の フ ァ ー ジ 型 別

国 立 感 染 症 研 究 所 に 依 頼 し ， 英 国 のPublic health Laboratory Service の

手 法 （4） に 基 づ き 実 施 し た 。 5 β ラ ク タ マ ー ゼ 検 出 試 験 分 離 株 の β ラ ク タ マ ー ゼ 型 別 はP/Cア ー ゼ テ ス ト（ 日 水 製 薬 ）に よ り ，19-80 株 お よ びL-3695株 を 試 験 紙 に 接 種 し ，ぺ ニ シ リ ナ ー ゼ お よ び セ フ ァ ロ ス ポ リ ナ ー ゼ 産 生 能 を 確 認 し た 。 6 プ ラ ス ミ ド プ ロ フ ァ イ ル

プ ラ ス ミ ドDNAは Kadoと Liuの 方 法（ 45）に よ り 抽 出 し ， 1％ ア ガ ロ ー ス

ゲ ル を 用 い ，電 気 泳 動 を 行 い ，エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ イ ド に よ り 染 色 しUV光 下 に

て 観 察 し た 。 な お ， プ ラ ス ミ ド サ イ ズ マ ー カ ー と し て ，BAC-Tracker

Supercoiled DNA ladder （ Epicentre Biotechnologies）， S. Typhimurium

16-74株 95 kbpプ ラ ス ミ ド 保 有 お よ びS. Typhimurium 16-99株 保 有 165 kbp

27

7 プ ラ ス ミ ド 伝 達 性 試 験

供 与 株 と し て19-80株 ，L-3695株 を ，受 容 株 と し て 大 腸 菌 ML1410株（ NA，

リ フ ァ ン ピ シ ン 耐 性 ）を 用 い 実 施 し た（1）。方 法 は Tryptic Soy Broth（ Becton

Dickinson） に て 37℃ で 一 夜 ， 前 者 は 0.5 ml静 置 培 養 ， 後 者 は 2 ml振 盪 培 養 を そ れ ぞ れ 行 っ た 。 こ の 両 者 を 混 合 し た 菌 液 を37℃ で 8時 間 培 養 し ， さ ら に 室 温 に て24時 間 静 置 培 養 を 実 施 し た 。そ の 後 ，混 合 培 養 液 を 薬 剤 含 有（ リ フ ァ ン ピ シ ン ：100 µg/ml， CEZ： 50 µg/ml） の DHL培 地 （ 栄 研 化 学 ） に 接 種 し ，37℃ で 24時 間 培 養 し た 。 得 ら れ た ト ラ ン ス コ ン ジ ュ ガ ン ト に つ い て は ， 薬 剤 感 受 性 試 験 ， プ ラ ス ミ ド プ ロ フ ァ イ ル ， 制 限 酵 素PstIを 用 い た プ ラ ス ミ ドRFLPお よ びblaCMY-2遺 伝 子 プ ロ ー ブ を 用 い た サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を 実 施 し た 。 8 PCR

PCRで は 表 3に 記 載 さ れ て い るblaCMY-2，blaTEM -1，spvBお よ び プ ラ ス ミ ド

の レ プ リ コ ン タ イ ピ ン グ に 関 わ る 遺 伝 子 （IncFIB, IncFIIA, IncI1 お よ び

IncA/C） に つ い て 実 施 し た （ 20， 48）。 そ れ ぞ れ の PCRに よ る 増 幅 産 物 は ， ABI Prism BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit （ Applied Biosystems ） を 用 い ， ABI 3100 DNA Genetic Analyzer （ Applied Biosystems）に よ り 塩 基 配 列 解 析 を 行 い ，BLASTに よ り 既 報 の 遺 伝 子 と の 相 同 性 を 確 認 し た 。

9 サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン

28

Switzerland) を 用 い て ，spvB，IncFIIA， I ncFIB， IncA/C， IncI1お よ び

blaCMY-2遺 伝 子 の ジ ゴ キ シ ゲ ニ ン 標 識DNAプ ロ ー ブ 作 製 し ，Gキ ャ ピ ラ リ ー ブ

ロ ッ タ ーCセ ッ ト（ TAITEC，埼 玉 ）を 用 い た 下 降 式 バ ッ ト 法 に よ り メ ン ブ ラ

ン に 転 写 さ せ たDNAか ら 上 記 の 遺 伝 子 を 検 出 し た 。分 子 量 マ ー カ ー は ，DNA

molecular-weight marker Ⅱ DIG-labeled， DNA molecular-weight marker IV DIG-labeled (Roche Diagnostics)， 2.5-kbpDNA ladder (タ カ ラ バ イ オ ) ，

S. Typhimurium 16-74 株 保 有 95kbp プ ラ ス ミ ド お よ びS. Typhimurium

16-99株 保 有 165kbpプ ラ ス ミ ド を 用 い た 。

10 PFGE解 析

ゲ ノ ムDNAを Akibaら の 方 法 （ 2） に よ り 抽 出 し ， XbaI（ タ カ ラ バ イ オ ）

も し く はBlnI（ タ カ ラ バ イ オ ）で 消 化 し た 。PFGEは ，CHEFF DR Ⅲ（ Bio-rad）

を 用 い ，1％ megabase agarose gel （ Bio-Rad）に て ，0.6 V/cm，パ ル ス タ

イ ム5 ‐ 50 秒 の 条 件 下 で 22 時 間 電 気 泳 動 し た 。 DNA サ イ ズ マ ー カ ー は ，

Lambda Ladder PFG Marker（ New England BioLabs） を 使 用 し た 。

結 果 1 分 離 株 の 表 現 型 別 薬 剤 感 受 性 試 験 で は19-80株 お よ び L-3695株 は CEZの み な ら ず ， ESCで あ るCFX, CTF, CAZお よ び CTRXに つ い て も 耐 性 を 示 し た （ 表 4）。 そ の 他 の 薬 剤 で は ，19-80株 は ABPC, SM, KMお よ び TCに ， L3695株 は ABPC, SM, KM, GM, TCお よ び CPに 耐 性 を 示 し た 。 フ ァ ー ジ 型 別 で は 19-80株 お よ び L-3695 株 と も に フ ァ ー ジ 型 別 は 不 能 で あ り ， β ラ ク タ マ ー ゼ 試 験 で は 両 株 か ら ペ ニ

29

シ リ ナ ー ゼ お よ び セ フ ァ ロ ス ポ リ ナ ー ゼ の 両 酵 素 が 検 出 さ れ た 。

2 PCRに よ る 遺 伝 子 検 索 と 分 離 株 の PFGE解 析

19-80株 と L-3695株 と も にblaC MY-2，blaT EM-1お よ びspvB 遺 伝 子 が 検 出 さ

れ た （ 表5）。 PCRに よ る プ ラ ス ミ ド の レ プ リ コ ン タ イ ピ ン グ で は ， 19-80株

がIncFIB， IncFIIAお よ び IncI1と 型 別 さ れ ， L-3965株 が IncFIB， IncFIIA

お よ びIncA/Cと 型 別 さ れ た （ 表 5）。

PFGE解 析 で は XbaIに よ る 消 化 像 で 19-80株 お よ び L-3695株 が そ れ ぞ れ 16

お よ び17の DNA断 片 が 28 kbpか ら 770 kbpの DNAサ イ ズ の 範 囲 で 確 認 さ れ

た 。 一 方 ，BlnI で は 19-80株 お よ び L-3695 株 で 10お よ び 9の DNA断 片 が 85

kbpか ら 790 kbpの DNAサ イ ズ の 範 囲 で 確 認 さ れ た 。 両 株 間 の DNA断 片 像 の

比 較 で はXbaIお よ び BlnIと も に ，3本 の DNA断 片（ XbaI：155 kbp，388 kbp

お よ び503 kbp， BlnI ： 104 kbp， 145 kbpお よ び 160 kbp） で バ ン ド の 相 違

が 確 認 さ れ た （ 図5）。

3 プ ラ ス ミ ド お よ び ト ラ ン ス コ ン ジ ュ ガ ン ト 解 析

19-80株 は 95 kbpと 165 kbpの 2つ の プ ラ ス ミ ド を 保 有 し て お り ， サ ザ ン ハ

イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の 結 果 か ら ，95 kbp プ ラ ス ミ ド か ら IncI1 お よ び

blaCMY-2，165 kbpプ ラ ス ミ ド か ら IncFIIA，IncFIBお よ びspvBが 検 出 さ れ た

（ 表5，6，図 6）。 一 方 ，L-3965株 は 165 kbpと 190 kbpの 2つ の プ ラ ス ミ ド を

保 有 し て お り ，サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の 結 果 か ら ，190kbpプ ラ ス ミ

ド か らIncA/Cお よ びblaCMY-2，165 kbpプ ラ ス ミ ド か ら 19-80株 の 165 kbpと 同

様 にIncFIIA，IncFIBお よ びspvBが 検 出 さ れ た（ 表5，6，図 6）。ま た ，分 子

30 は ，IncFIIA，お よ びspvB ，165 kbpプ ラ ス ミ ド 保 有S. Typhimurium 16-99 株 で はIncFIIA， IncFIBお よ びspvBが 検 出 さ れ た （ 表5， 6， 図 6）。 プ ラ ス ミ ド 伝 達 性 試 験 で は19-80株 お よ び L-3695株 の 両 株 か ら ト ラ ン ス コ ン ジ ュ ガ ン ト が 得 ら れ た 。 な お ，19-80株 お よ び L-3695株 か ら 得 ら れ た ト ラ ン ス コ ン ジ ュ ガ ン ト を そ れ ぞ れ19-80TCお よ び L-3695TCと し た 。19-80TCは 95 kbpプ ラ ス ミ ド を 保 有 し ，PCRお よ び サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン か ら

IncI1お よ びblaCMY-2が 検 出 さ れ た（ 表5，6，図 6）。一 方 ，L-3695TCは 190 kbp

プ ラ ス ミ ド を 保 有 し ，PCRお よ び サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン か ら IncA/C お よ びblaCMY-2が 検 出 さ れ た 。 ま た ， β ラ ク タ マ ー ゼ 遺 伝 子 の 検 出 で は 19-80TCお よ び L-3695TCと も にblaCMY-2遺 伝 子 が 検 出 さ れ （ 表5， 6， 図 6）， β ラ ク タ マ ー ゼ 検 出 試 験 で は ， セ フ ァ ロ ス ポ リ ナ ー ゼ の み 検 出 さ れ た 。 薬 剤 感 受 性 試 験 で は19-80TCお よ び L-3695TCと も に セ フ ァ ロ ス ポ リ ン 系 で あ るCEZお よ び CFXに 耐 性 を 示 し ， L-3965TC株 で は さ ら に SM， GM， TC お よ びCPに 耐 性 を 示 し た （ 表 4）。 ト ラ ン ス コ ン ジ ュ ガ ン ト のPstI を 用 い た プ ラ ス ミ ド RFLP 解 析 で は ， 19-80TCが 保 有 す る 95 kbp IncI1プ ラ ス ミ ド と L-3695TCが 保 有 す る IncA/C プ ラ ス ミ ド は 全 く 異 な る 泳 動 像 を 示 し た（ 図7A）。ま た ，こ の プ ラ ス ミ ド RFLP で のblaC MY-2プ ロ ー ブ を 用 い た サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン で は ，19-80TC で0.8 kbpお よ び 2.5 kbpに ， L-3695TCで は 12.5 kbpお よ び 0.8 kbpに シ グ ナ ル が 観 察 さ れ た （ 図7B）

31 考 察 本 章 で 解 析 し たS. Typhimuriumは 第 4世 代 セ フ ァ ロ ス ポ リ ン を 除 く ESC に 耐 性 を 示 し ， そ の 他 ア ミ ノ グ リ コ シ ド 系 ， テ ト ラ サ イ ク リ ン 系 な ど 多 く の 薬 剤 に 耐 性 を 示 し た （ 表4）。 ま た ， β ラ ク タ マ ー ゼ 検 査 で は 両 株 と も に ペ ニ シ リ ナ ー ゼ お よ び セ フ ァ ロ ス ポ リ ナ ー ゼ が 検 出 さ れ ，PCRで はblaCMY-2お よ びblaT EM -1の β ラ ク タ マ ー ゼ 遺 伝 子 が 確 認 さ れ た （ 表5）。 ESC耐 性 に 関 与 す

る β ラ ク タ マ ー ゼ の 代 表 的 な も の と し て ，Ambler class Aの 基 質 拡 張 型 β ラ

ク タ マ ー ゼ とAmbler class Cの AmpC β ラ ク マ タ ー ゼ が あ る （ 16， 18）。 前

者 に 関 連 す る 遺 伝 子 はTEM， SHVお よ び CTX-M型 が あ る が ， 本 章 で 確 認 さ れ たblaTEM -1は ペ ニ シ リ ナ ー ゼ 産 生 に 関 わ る 遺 伝 子 で あ り ， ペ ニ シ リ ン や ABPCな ど の ペ ニ シ リ ン 系 薬 剤 を 分 解 し ， ESCは 分 解 で き な い こ と が 知 ら れ て い る （7， 18， 42）。 一 方 ， 後 者 に 関 連 す る 遺 伝 子 は セ フ ァ ロ ス ポ リ ナ ー ゼ を 産 生 す るCMY，ACCお よ び型 が あ り ，こ れ ら は CFXな ど の セ フ ァ マ イ シ ン 系 やESCを 分 解 す る が ，CFPMな ど の 第 4世 代 セ フ ァ ロ ス ポ リ ン は 分 解 で き な い （34， 46， 62， 86）。 こ の こ と か ら ， 19-80株 お よ び L-3695株 と も

に ，blaTEM -1は ペ ニ シ リ ン 系 薬 剤 耐 性 に 関 与 し ，AmpC β ラ ク タ マ ー ゼ で あ るblaCMY-2に よ り ，セ フ ァ マ イ シ ン 系 お よ びESCに 耐 性 と な っ た こ と が 示 唆 さ れ た 。 19-80株 お よ び L-3695株 が 保 有 す る 165 kbpプ ラ ス ミ ド に は ，サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の 結 果 か らspvB，IncFIB， IncFIIAが 検 出 さ れ た （ 表 6）。 本 章 で 用 い たPCR に よ る プ ラ ス ミ ド レ プ リ コ ン タ イ ピ ン グ で は S. Typhimuriumの 95 kbp病 原 性 プ ラ ス ミ ド は IncFIIAに 型 別 さ れ （ 20），spvB な ど の 病 原 性 に 関 与 す る 遺 伝 子 が 存 在 し て お り （68）， 分 子 量 マ ー カ ー と し

32 て 用 い た95 kbpプ ラ ス ミ ド 保 有 株 で は IncFIBは 検 出 さ れ な か っ た（ 図 6）。よ っ て ， 確 認 さ れ た165 kbpプ ラ ス ミ ド は ， 95 kbp S. Typhimurium病 原 性 プ ラ ス ミ ド とIncFIBプ ラ ス ミ ド が 結 合 し た こ と に よ り ， 165 kbpに サ イ ズ ア ッ プ さ れ た も の と 推 察 さ れ た 。 プ ラ ス ミ ド 伝 達 性 試 験 に よ り ，19-80お よ び L-3695株 か ら そ れ ぞ れ ト ラ ン ス コ ン ジ ュ ガ ン ト(19-80TCお よ び L-3695TC)が 得 ら れ ， こ れ ら の 株 は CEZ, CFXに 耐 性 を 示 し て お り ，blaCMY-2遺 伝 子 が 検 出 さ れ た （ 表4， 5）。 19-80TC お よ びL-3695TCは そ れ ぞ れ 95 kbpと 190 kbpプ ラ ス ミ ド を 保 有 し て お り ， PCRお よ び サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン の 結 果 か ら ， 95 kbp， 190 kbpプ

ラ ス ミ ド は そ れ ぞ れIncI1と IncA/Cと 決 定 さ れ ，両 プ ラ ス ミ ド にblaCMY-2遺 伝

子 が 存 在 し て い た （ 表6， 図 6）。 こ の こ と か ら ， 19-80株 お よ び L-3695株 は blaCMY-2を 乗 せ た 自 己 伝 達 可 能 な 薬 剤 耐 性 プ ラ ス ミ ド を 保 有 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。さ ら に ，190 kbpプ ラ ス ミ ド を 保 有 す る L-3695TCは セ フ ァ ロ ス ポ リ ン 系 薬 剤 に 加 え ，SM， GM， TCお よ び CPに 耐 性 を 示 し て い た 。 こ の こ と か ら ，190 kbp IncA/Cプ ラ ス ミ ド は 多 剤 耐 性 に 関 与 す る こ と が 示 唆 さ れ た 。Matasejeら（ 57）は ，カ ナ ダ で 分 離 さ れ た CFX耐 性 サ ル モ ネ ラ が 保 有

す る 代 表 的 なblaCMY-2遺 伝 子 保 有 プ ラ ス ミ ド はIncI1お よ び IncA/Cプ ラ ス ミ

ド で あ る と 報 告 し て お り ， 本 章 で 解 析 し た プ ラ ス ミ ド の レ プ リ コ ン タ イ ピ ン グ と 一 致 し た 。

blaCMY-2が 存 在 す る プ ラ ス ミ ド の 性 状 を 確 認 す る た め ，PstIに よ り ，プ ラ ス

ミ ド を 消 化 し ，blaCMY-2標 識 プ ロ ー ブ で サ ザ ン ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を 実 施

し た 。 そ の 結 果 ，95 kbp IncI1プ ラ ス ミ ド で は 2.5 kbpお よ び 0.8 kbpに ，190

kbp IncA/Cプ ラ ス ミ ド で は 12.5 kbpお よ び 0.8 kbpの 位 置 に そ れ ぞ れ シ グ ナ

33

blaCMY-2を 乗 せ た プ ラ ス ミ ド の 性 状 と 一 致 し た （21， 32）。

制 限 酵 素XbaIお よ び BlnIを 用 い た PFGE解 析 で は ， 両 酵 素 と も に そ れ ぞ れ 3本 の バ ン ド の 相 違 が 確 認 さ れ た（ 図 5）。PFGEで の 2か ら 3本 の バ ン ド の 相 違

は ， 近 縁 な 株 で あ る と さ れ て い る こ と か ら （80）， こ の 両 株 間 は ， 同 じ 遺 伝

子 型 に 属 し ， 遺 伝 学 的 に 近 縁 な 株 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。

分 離 株 の フ ァ ー ジ 型 別 で は ど ち ら の 分 離 株 も 型 別 不 能 で あ っ た 。Davisら

（23）に よ る と ，米 国 北 西 部 地 域 に お い て ，2000年 か ら 2006年 の 間 に フ ァ ー

ジ 型 別 不 能 で 同 じPFGE型 に 属 す 牛 由 来S. Typhimurium（ TYP035，TYP187）

の 増 加 が 報 告 さ れ て お り ， こ れ ら の 株 の 半 数 以 上 がESC耐 性 株 で あ っ た 。

19-80 株 お よ び L-3695 株 と Davis ら (23) が 報 告 し た PFGE 型 TYP035 お よ び TYP187と の PFGEを 比 較 し た と こ ろ ， 19-80株 と TYP035は 非 常 に 類 似 し て

い る 可 能 性 が 示 さ れ た(図 8)。ESC耐 性 株 は 公 衆 衛 生 上 非 常 に 重 要 で あ り ，流 行 の 有 無 を 確 認 す る こ と が 必 要 で あ る こ と か ら ， 各 国 で 分 離 さ れ たESC耐 性 S. Typhimuriumに つ い て ， 分 子 疫 学 的 手 法 を 用 い た 比 較 検 討 が 必 要 と 考 え ら れ た 。 ESC耐 性 株 が 分 離 さ れ た 2つ の 農 場 間 に ， 疫 学 的 関 連 性 は 認 め ら れ な か っ た が ， 両 農 場 と も に 下 痢 ， 発 熱 等 の 症 状 を 示 し て い た 牛 サ ル モ ネ ラ 症 発 症 牛 は ， 本 症 と 診 断 さ れ る 前 に ， セ フ ァ ロ ス ポ リ ン 系 薬 剤 で あ るCEZの 投 与 さ れ

て い た 。Suら （ 76） は ， 患 者 の 傷 口 か ら 分 離 さ れ たSalmonella Anatusお よ

びEscherichia coliが ，ESCで あ る CTRX投 与 2週 間 後 に 両 菌 が CTRXに 耐 性 を

示 し た こ と を 報 告 し た 。 上 記 の 報 告 は 抗 生 物 質 の 投 与 が 微 生 物 側 の 選 択 圧 の 上 昇 に つ な が り ， 薬 剤 耐 性 菌 選 択 の 一 助 と し て 働 く 可 能 性 を 証 明 し て お り ，

blaCMY-2が 自 己 伝 達 可 能 な プ ラ ス ミ ド 上 に 存 在 し て い た こ と か ら ，本 章 の2症