Title Studies on the Roles of MicroRNA-145 in Canine and HumanCancers( 内容と審査の要旨(Summary) ) Author(s) 山田, 名美 Report No.(Doctoral Degree) 博士(獣医学) 甲第403号 Issue Date 2013-09-24 Type 博士論文 Version ETD URL http://hdl.handle.net/20.500.12099/47367 ※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。
氏名（本（国）籍） 山 田 名 美（岐阜県） 主 指 導 教 員 名 岐阜大学 教授 丸 尾 幸 嗣 学 位 の 種 類 博士（獣医） 学 位 記 番 号 獣医博甲第４０３号 学 位 授 与 年 月 日 平成２５年９月２４日 学 位 授 与 の 要 件 学位規則第３条第１項該当 研 究 科 及 び 専 攻 連合獣医学研究科 獣医学専攻 研究指導を受けた大学 岐阜大学
学 位 論 文 題 目 Studies on the Roles of MicroRNA-145 in Canine and Human Cancers (MicroRNA-145 のイヌおよびヒト悪性腫瘍における機能解析 に関する研究) 審 査 委 員 主査 岐 阜 大 学 教 授 柳 井 徳 磨 副査 帯 広 畜 産大 学 教 授 大 石 明 広 副査 岩 手 大 学 教 授 宇 塚 雄 次 副査 東 京 農 工大 学 教 授 渋 谷 淳 副査 岐 阜 大 学 教 授 丸 尾 幸 嗣 学位論文の内容の要旨 本学位論文は，悪性腫瘍のうちイヌ口腔内メラノーマおよびヒト大腸癌を取り上げ，それ ら に 対 す る microRNA （ miRNA ； miR ） -145 の 役 割 に つ い て 検 討 し て い る 。 最 近 ， microRNA(miRNA)はヒト腫瘍のメカニズム解析のために注目され，活発に研究が行われてい る機能性低分子である。ヒトの miRNA は現在 1500 種類以上存在するといわれており，しか もその多くが種をこえて広く保存されている。miRNA は mRNA の翻訳を負に制御することで， 遺伝子発現を調節している。最近の研究では，ヒト腫瘍における各種 miRNA の発現異常と その機能が明らかになりつつあり，それに伴い miRNA は腫瘍の診断や治療，予後因子とし て有用であるという報告が多数みられている。今回検討した miR-145 はヒトの様々な腫瘍 で発現が顕著に低下しているがん抑制性 miRNA の一つであり，そのがん抑制メカニズムと して，miR-145 によるfasin-1，c-Myc などのがん遺伝子の発現抑制が報告されている。前 記のように miRNA が広く種を越えて保存されていることから，ヒトで用いられている研究 手法がイヌにおいても応用可能であると考えられる。しかも，イヌの腫瘍における miRNA 研究はほとんど進んでいない。したがって，本研究では miR-145 の標的遺伝子に着目し， その遺伝子の機能解析を通してイヌおよびヒト悪性腫瘍における miR-145 の役割について 解明している。 第１章では，イヌ口腔内メラノーマにおける fascin-1 と腫瘍の悪性度，罹患犬の臨床ス テージ，予後との関連を解析している。これまでの報告から，イヌ正常口腔粘膜と比較し て，イヌ口腔内メラノーマ細胞株，臨床組織でともに miR-145 が有意に発現低下している こと，細胞株に miR-145 を導入すると有意な抗がん活性が認められることが示され，その メカニズムとしてイヌにおいても miR-145 がfascin-1 と c-Myc を標的遺伝子としている可 能性を報告している（Noguchi et al. 2011）。そこでイヌメラノーマの臨床病理検体を用
いて fascin-1 の発現を免疫組織化学的に評価した。その結果，fascin-1 の発現は非進行 がん症例 stageⅡⅠ+群と比較すると，進行がん症例 stageⅢ+Ⅳ群で有意に高かった。また， 症例の原発巣のサイズ（T1-T3）で分類し，骨浸潤像（X-ray，CT 所見），リンパ節転移所 見（細胞診），遠隔転移所見（X-ray，CT 所見）といった浸潤がん所見の有無との関連を調 べたところ，T2 群において，浸潤がん所見がある症例で有意に高かった。さらに，fascin-1 強発現群は低−中発現群と比較して有意に生存期間が短かった。これらの結果から，miR-145 の標的遺伝子であるfascin-1 は，イヌメラノーマの悪性動態に深く関与している可能性が 示された。 第２章では，すでに Akao らによってヒト大腸癌マウス移植モデルに対してin vivo で抗 がん活性が報告されている miR-145 を用いて，そのメカニズムについてヒト大腸癌細胞株 DLD-1 および WiDr を用いて in vitro で詳細に検証した。ヒト大腸癌は発癌初期における Wnt/β-catenin シグナルの恒常的活性化がイニシエーターとなって癌化が進行する。また， miR-145 の発現低下は発癌初期から認められていることも報告されている。しかし， miR-145 の発現低下と Wnt/β-catenin シグナルの活性化との関連は不明である。そこで， miR-145 の Wnt/β-catenin シグナルにおける役割に着目し検証した。その結果，miR-145 を導入した DLD-1，WiDr 細胞で有意な細胞増殖抑制を示し，その原因としてβ-catenin の 核内移行の抑制および下流のc-Myc，CyclinD1 の発現低下にあることを明らかにした。さ らに，β-catenin の核内移行抑制メカニズムとして，catenin δ−1 の制御を介した間接的 制御メカニズムの存在が示唆された。miR-145 はcatenin δ-1 を標的とすることで大腸癌 の Wnt/β-catenin シグナルを抑制し，抗がん活性を示すことを明らかにした。 以上より，イヌおよびヒト悪性腫瘍において miR-145 の発現低下は腫瘍の進行や悪性度， 発癌に重要な役割を果たしていることを明らかにした。現在 miR-145 の補充療法の臨床応 用に向けて，ヌクレース耐性を獲得させた人工 miR-145 の作製と，in vitro および in vivo での抗がん活性を検証する研究が進行中である。
審 査 結 果 の 要 旨
本論文は，イヌ口腔内メラノーマおよびヒト大腸癌における microRNA-145 の機能解析に 関するものである。本論文は２章からなっており，第１章はイヌ口腔内メラノーマにおけ る fascin-1 と腫瘍の悪性度，罹患犬の臨床ステージ，予後との関連を解析した。なぜなら， fascin-1 はこれまでの報告から，miR-145 がfascin-1 と c-Myc を標的遺伝子としている可 能性が示唆されているからである。そこでイヌメラノーマの臨床病理検体を用いて fascin-1 の発現を免疫組織化学的に評価した。その結果，miR-145 の標的遺伝子である fascin-1 は，イヌメラノーマの悪性動態に深く関与している可能性が示された。
第２章では，ヒト大腸癌細胞株 DLD-1 および WiDr を用いて，miR-145 の Wnt/β-catenin シグナルにおける役割について検証した。その結果，miR-145 を導入した DLD-1，WiDr 細 胞で有意な細胞増殖抑制を示し，その原因としてβ-catenin の核内移行の抑制および下流 のc-Myc，CyclinD1 の発現低下にあることを明らかにした。さらに，β-catenin の核内移 行抑制メカニズムとして，catenin δ−1 の制御を介した間接的制御メカニズムの存在が示 唆された。miR-145 は catenin δ-1 を標的とすることで大腸癌の Wnt/β-catenin シグナ ルを抑制し，抗がん活性を示すことを明らかにした。
以上より，イヌおよびヒト悪性腫瘍において miR-145 の発現低下は腫瘍の進行や悪性度， 発癌に重要な役割を果たしていることを明らかにした。
文として十分価値があると認めた。 基礎となる学術論文
１）題 目：Fascin-1 expression in canine cutaneous and oral melanocytic tumours 著 者 名：Yamada, N., Mori, T., Murakami, M., Noguchi, S., Sakai, H., Akao, Y.and Maruo, K.
学術雑誌名：Veterinary Comparative Oncology 巻・号・頁・発行年：10（4）：303-311，2012
２）題 目：Tumor-suppressive microRNA-145 targets catenin δ-1 to regulate Wnt/β-catenin signaling in human colon cancer cells
著 者 名：Yamada, N., Noguchi, S., Mori, T., Naoe, T., Maruo, K. and Akao, Y. 学術雑誌名：Cancer Letters
巻・号・頁・発行年：In press （Available on line 7 March 2013） 既発表学術論文
１）題 目：MicroRNA-143 functions as a tumor suppressor in human bladder cancer T24 cells
著 者 名：Noguchi, S., Mori, T., Hoshino, Y., Maruo, K., Yamada, N., Kitade, Y., Naoe, T. and Akao, Y.
学術雑誌名：Cancer Letters
巻・号・頁・発行年：307 (2) : 211-220, 2011
２）題 目：Comparative study of anti-oncogenic microRNA-145 in canine and human malignant melanoma
著 者 名：Noguchi, S., Mori, T., Hoshino, Y., Yamada, N., Nakagawa, T., Sasaki, N., Akao, Y. and Maruo, K.
学術雑誌名：The Journal of Veterinary Medical Science 巻・号・頁・発行年：74 (1) 1-8, 2012
３）題 目：Microvesicles released from hormone-refractory prostate cancer cells facilitate mouse pre-osteoblast differentiation
著 者 名：Itoh, T., Ito, Y., Ohtsuki, Y., Ando, M., Tsukamasa, Y., Yamada, N., Naoe, T. and Akao, Y.
学術雑誌名：Journal of Molecular Histology 巻・号・頁・発行年：43 (5) 509-515, 2012
４）題 目：Replacement treatment with microRNA-143 and -145 induces
synergistic inhibition of the growth of human bladder cancer cells by regulating PI3K/Akt and MAPK signaling pathway
著 者 名：Noguchi, S., Yasui, Y., Iwasaki, J., Kumazaki, M., Yamada, N., Naito, S. and Akao, Y.
学術雑誌名：Cancer Letters
