IRUCAA@TDC : 「顎骨疾患プロジェクトからの情報発信」１０．遺伝疾患における遺伝子治療：低ホスファターゼ症の酵素補充遺伝子治療

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Available from http://ir.tdc.ac.jp/

Title

「顎骨疾患プロジェクトからの情報発信」１０．遺伝疾

患における遺伝子治療：低ホスファターゼ症の酵素補充

遺伝子治療

Author(s)

笠原, 正貴; 高橋, 有希; 新谷, 誠康; 東, 俊文

Journal

歯科学報, 119(6): 469-474

URL

http://doi.org/10.15041/tdcgakuho.119.469

Right

Description

はじめに

「顎骨疾患プロジェクトからの情報発信」は，本

号で１０回目となる。本稿では，東京歯科大学生化学

講座・東 俊文教授をラボリーダーとする「分子・

細胞ラボ」より「遺伝子治療」の概説を行うととも

に，我々の取り組みの中の１つ，先天性遺伝疾患の

１つである「低ホスファターゼ症」の研究について

紹介する。

１．遺伝子治療

遺伝子治療とは，疾病の治療を目的として遺伝子

または遺伝子を導入した細胞を患者の体内に投与す

る治療法である

１）

（図１）。その対象は，重篤な遺伝

疾患や，がんなどの生命を脅かす疾患，または身体

機能を著しく損なう疾患である。

世界で初めての遺伝子治療は，アデノシンデアミ

ナーゼ（ADA）欠損症に対して米国で行われた

２）

（図

２）。ADA 欠損症は，常染色体劣性遺伝の原発性

免 疫 不 全 症 で あ る。ADA 遺 伝 子（２０番 染 色 体 q

１３．

１１）の変異による ADA 欠損が病因で，蓄積する

代謝産物が主に免疫細胞，特に未熟な T 細胞に対

して細胞毒として働き，進行性に免疫不全を引き起

こす。その病態は，生後間もなくから発症する重篤

な易感染性，リンパ球減少，低ガンマグロブリン血

症などを主徴とする重症複合免疫不全症（SCID）で

ある。ADA 欠損症は全 SCID の約１５％を占め，X

連鎖重症複合免疫不全症（X-SCID）に次いで２番目

に多い疾患である。また，常染色体劣性型の SCID

のうち約１／３を占める。１９９０年，NIH のグループ

が酵素補充療法と併用しながらレトロウイルスベク

ターを用い，末梢血 T 細胞を標的として本疾患患

歯学の進歩・現状

「顎骨疾患プロジェクトからの情報発信」

１０．遺伝疾患における遺伝子治療：

低ホスファターゼ症の酵素補充遺伝子治療

笠原正貴

１）２）３）

高橋有希

１）２）３）

新谷誠康

１）２）４）

東 俊文

１）２）５） キーワード：私立大学研究ブランディング事業，顎骨疾患 プロジェクト，遺伝子治療，低ホスファター ゼ症 １）_{東京歯科大学口腔科学研究センター} ２）_{東京歯科大学研究ブランディング事業} ３）_{東京歯科大学薬理学講座} ４）_{東京歯科大学小児歯科学講座} ５）_{東京歯科大学生化学講座} （２０１９年９月１２日受付，２０１９年１０月７日受理） http : //doi.org/１０.１５０４１/tdcgakuho.１１９.４６９ 連絡先：〒１０１‐００６１ 東京都千代田区神田三崎町２−９−１８ 東京歯科大学薬理学講座 笠原正貴 Masataka KASAHARA１）２）３）_，

Aki NAKAMURA-TAKAHASHI１）２）３）_，

Seikou SHINTANI１）２）４）_{，Toshifumi AZUMA}１）２）５） _{: Report}

from the Jaw Bone Disease Project １０ : Gene therapy of hypophosphatasia（１）_{Oral Health Science Center, Tokyo}

Dental College,２）_{Tokyo Dental College Research}

Brand-ing Project,３）_{Department of Pharmacology, Tokyo Dental}

College,４）_{Department of Pediatric Dentistry, Tokyo}

Den-tal College,５）_{Department of Biochemistry, Tokyo Dental}

College）

図１ 遺伝子治療

４６９

者に遺伝子治療を実施した

２）

。本邦でも北海道大学

で，ADA 欠 損 症 に 対 し て 遺 伝 子 治 療 が 行 わ れ

た

３）

。しかしながら，いずれも顕著な治療効果は認

められなかった。

遺伝子治療の初めての成功例は，仏国のネッカー

小児病院・小児免疫科のグループが X-SCID 患者に

行った症例である

４）

。X-SCID は，X 連鎖性劣性遺

伝の原発性複合免疫不全症で，IL2RG 遺伝子（X 染

色体 q１３．

１）の変異による共通

γ 鎖を介するシグナ

ル伝達不全が病因である。本疾患は，B 細胞の成

熟，T 細胞・NK 細胞への分化，抗体産生能に障害

が生じ，重篤な免疫不全となる。１９９０年に米国で行

われた世界初の遺伝子治療は，患者の体内から取り

出したリンパ球に正常遺伝子を導入し，繰り返し投

与する方法であったのに対し，X-SCID 患者に行っ

た遺伝子治療では，患者の骨髄造血幹細胞を取り出

したのち，レトロウイルスベクターを用いて，正常

遺伝子を導入してから患者に投与する方法であっ

た。この方法は，１回の投与でも造血幹細胞が正常

機能を回復したリンパ球を継続的に作り出せるため

に，患者は 長 期 に わ た っ て 免 疫 機 能 を 回 復 で き

た

４）

。この成功例から，遺伝子導入する細胞と遺伝

子導入用ベクターを追求することで，遺伝子治療は

次世代の医療となり得ることが期待された。しかし

ながら，X-SCID 遺伝子治療後に白血病を発症した

重篤な副作用例が報告された

５，６）

。そのため，遺伝子

治療の臨床研究はしばらく停滞を余儀なくされた。

停滞していた臨床研究は２００９年に，レンチウイル

スベクターを用いた副腎白質ジストロフィーに対し

て行われた遺伝子治療の報告

７）

で，再び注目される

ことになる。その後，新たな研究の方向性の１つと

して，アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターを用い

た遺伝子治療研究が活性化してきた。AAV ベク

ターによる初めての遺伝子治療は，血友病 B に対

して行われた

８）

_{。この治療では，AAV ベクターを}

静 脈 内 投 与 し て 行 わ れ た。そ の 結 果，患 者６名

中，４名で凝固因子の投与が中止でき，２名におい

ても，その投与回数を減らすことができた

８）

。

以上の様に，現在までに遺伝子治療には数種の治

療用ベクターが用いられている。それらの特徴を図

３にまとめた。ベクターとは，ラテン語の「運び

屋」を語源とする用語である。ウイルスには，感染

した細胞に自己の遺伝子を導入して，宿主細胞の機

能を利用することで増殖する性質がある。この性質

を利用して遺伝子治療が行われる。すなわち，ウイ

ルスを「運び屋」として治療に必要な遺伝子を宿主

細胞に導入することで，治療遺伝子を自己の細胞で

発現させることが遺伝子治療である。AAV はパル

ボウイルスの１種で，ウイルスの中で最も小型の一

本鎖 DNA ウイルスである。加熱，プロテアーゼ，

界面活 性 剤 な ど に 対 し て 抵 抗 性 を 示 す。そ し て

AAV ベクターは，ヒトに対して病原性がないこと

が有利な点であり，また遺伝子発現期間が長期に渡

ることも利点の１つである。次に，この AAV ベク

ターを用いた我々の研究，先天性遺伝疾患の１つで

１９９０年：世界で初めての遺伝子治療の実施（米国） １９９５年：日本で初めての遺伝子治療の実施 １９９９年：アデノウイルスベクターの大量投与による過剰免疫反応での死亡事故（米） ２０００年：遺伝子治療，初めての成功例：X 連鎖重症複合免疫不全症（X-SCID）（仏） ２００２年：X-SCID 遺伝子治療で，レトロウイルスベクターの挿入変異により白血病発症（仏） ２００９年：副腎白質ジストロフィーの遺伝子治療（レンチ ex vivo：造血幹細胞）（仏） ２０１１年：血友病 B の遺伝子治療（米） ２０１２年：EU で初めて遺伝子治療薬の製造販売承認 GlyberaⓇ ：家族性リボ蛋白質リパーゼ欠損症治療薬 図２ 遺伝子治療の歴史 図３ 主な遺伝子治療用ベクターの種類と特徴 ４７０ 笠原，他：先天性遺伝疾患の遺伝子治療 ― ２ ―

ある「低ホスファターゼ症」の遺伝子治療研究につ

いて紹介する。

２．低ホスファターゼ症

低 ホ ス フ ァ タ ー ゼ 症（hypophosphatasia：HPP）

とは，組織非特異的アルカリホスファターゼ（tissue

-nonspecific alkaline phosphatase：TNALP）の活性

低下により，骨や歯などの硬組織の石灰化障害を主

徴とする先天性遺伝疾患である。主症状として，硬

組織の石灰化不全，痙攣発作，呼吸困難，乳歯の早

期脱落がみられるが，病型は様々で致死性のものか

ら軽症の歯限局型のものまで幅広く認められる。

これまでに HPP には有効な治療法がないとされ

てきたが，近年，骨親和型 TNALP（bone-targeted

TNALP with deca-aspartates at the C terminus：

TNALP-D１０）を使用した酵素補充療法の有効性が

認められ，２０１５年，本邦で HPP 治療薬が承認され

た。しかし，この酵素補充で治療効果を得るために

は長期間の反復投与（週３回の皮下注射）が必要であ

り，HPP 患者のほとんどが低年齢であることを考

えると非常に負担が大きい。したがって HPP 治療

に際しては，ウイルスベクターの単回投与により，

TNALP を長期的に補充できる遺伝子治療を研究す

る必要があると考えている。

これまでに，様々なウイルスベクターを使用した

研究が，HPP モデルマウス（Akp 2

−／−

_{マウス）に対し}

て行われてきた

９−１１）

。組織非特異的プロモーターに

よるウイルスベクターを全身投与する酵素補充療法

は，多くの臓器で治療遺伝子が過剰に発現するた

め，安全性に課題が残る。そこで私たちは，筋特異

的プロモーターである筋肉クレアチンキナーゼプロ

モーター（MCK プロモーター）制御下で TNALP-D

１０を発現する AAV ベクターを構築し，HPP に対

する遺 伝 子 治 療 の 有 効 性，安 全 性 の 検 討 を 行 っ

た

１２）

。

遺伝子導入効率および発現効率を改善するため，

治療用ベクターとしてゲノムパッケージング様式

は self-complementary（sc）を，血 清 型 は８型 AAV

（AAV８）を選択し，MCK プロモーター制御下に

TNALP-D１０を発現する scAAV８-MCK-TNALP-D

１０を作製した。生後１日齢の Akp 2

−／−

新生仔マウス

に scAAV８-MCK­TNALP-D１０

（２．

５×１０

１２

v.g.／個

体，総量各２０μl）を左右大腿四頭筋に筋肉内投与

し，３か月後に解析を行った。そして，血中 ALP

濃度の維持，行動量，ベクターの分布および各臓器

中の ALP 活性について検討した。骨の形態に関し

ては X 線撮影，マイクロ CT 撮影，そして，組織

学的解析としてアルシアンブルー染色，H&E 染

色，ALP 染色を行い，治療効果を検討した

１２）

_。

治療マウス群の血中 ALP 活性は３か月に渡り，

１．

０U/ml 以 上 の 濃 度 が 維 持 さ れ た。未 治 療 Akp

2

−／−

マウスの生存率は１か月以内であったが，治療

マウスの９０％は３か月まで生存した（図４）。１か月

齢での行動量解析では，治療マウス群は正常マウス

図４ 血中 ALP 濃度の維持と延命効果 歯科学報 Vol．１１９，No．６（２０１９） ４７１ ― ３ ―

群と同程度まで，活動量の改善がみられた。ベク

ター分布を調べたところ，骨格筋以外にも心臓や肝

臓にベクターが導入されたが，各臓器の ALP 活性

を検討したところ，心臓や肝臓での発現は著しく抑

制され，骨格筋で顕著に発現していた（図５）。治療

マウス群では，ALP 活性が骨組織でも認められた

が，大腿骨の長さは正常マウス群と同程度までの回

復はなかった。また，マイクロ CT 解析で治療マウ

ス群の大腿骨成長板部の皮質骨や骨梁配列の不整が

認められ，骨密度が低下していた（図６）。組織染色

で同部位を確認した結果，治療マウス群は成長板軟

骨細胞の異常増殖，変性および変性類骨様組織を認

めた。ALP 染色では，限局的に染色されたが，正

常個体に比べ弱く不十分であることがわかった

１２）

。

さらに，我々は下顎骨における治療効果の解析も

行ったが

１３）

，組織学的では治療マウスにおいて歯槽

骨頂の低形成や歯根膜細胞の配列不整，無細胞セメ

ント質の部分的な欠如，マラッセの上皮遺残が認め

られ，石灰化が不十分であった（図７）。

おわりに

我々の研究で，HPP マウスにおける筋特異的プ

図５ ベクター分布量と各臓器での ALP 活性 図６ 大腿骨成長板の形態と骨密度 ４７２ 笠原，他：先天性遺伝疾患の遺伝子治療 ― ４ ―

ロモーター下での遺伝子治療は，血中 ALP 活性の

維持，延命効果，行動量の正常化に関して効果があ

り，安全な方法であることが確認できた。しかしな

がら，HPP 治療マウスの骨・歯周組織の形態が完

全に回復しないことが示された。その原因として，

骨局所の ALP 分布量が不十分であることが示唆さ

れた。そのため現在，骨の回復不全の改善に向け

て，免疫寛容誘導やコドン至適化，さらに活性が高

い筋特異的プロモーターである spc５-１２，CK８，

CK９などを使用することを検討の上，AAV ベク

ターによる ALP 発現量を高め，骨局所 ALP 分布

量を改善させることを，まず第一の目標として研究

を行っている。さらには，骨局所の酵素補充量を増

加させることに加え，細胞治療（幹細胞，iPS 細胞）

を組み合わせることや，胎児治療などについても検

討を行っている。

本研究は「文部科学省私立大学研究ブランディング事業」 および「JSPS 科研費 JP１６H０７２１３」の助成を 受 け て 行 わ れ た。 著者の利益相反：開示すべき利益相反はない。 文 献 １）遺伝子治療等臨床研究に関する指針（平成３１年２月２８日 一部改正）．［accessed ２０１９−１１−１５］ https : //www.mhlw.go.jp/content/０００５６１７８８.pdf

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Nari-sawa S, Maeda T, Millán JL, Shimada T : Prolonged sur-vival and phenotypic correction of Akp 2−／−

hypophos-phatasia mice by lentiviral gene therapy, JBMR, ２６：１３５ 図７ セメント質形成不全

歯科学報 Vol．１１９，No．６（２０１９） ４７３

−１４２，２０１１．

１０）Matsumoto T, Miyake K, Yamamoto S, Orimo H, Mi-yake N, Odagaki Y, Adachi K, Iijima O, Narisawa S, Mil-lán JL, Fukunaga Y, Shimada T : Rescue of severe in-fantile hypophosphatasia mice by AAV-mediated sus-tained expression of soluble alkaline phosphatase, Hum Gene Ther, ２２：１３５５−１３６４，２０１１．

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４７４ 笠原，他：先天性遺伝疾患の遺伝子治療