IRUCAA@TDC : Cigarette smoke condensate modulates migration of human gingival epithelial cells and their interactions with Porphyromonas gingivalis

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Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/

Title

Cigarette smoke condensate modulates migration of

human gingival epithelial cells and their

interactions with Porphyromonas gingivalis

Author(s)

今村, 健太郎

Journal

歯科学報, 116(5): 410-411

URL

http://hdl.handle.net/10130/4149

Right

Description

博士（歯学）・第２０７８号（甲第１２９１号）・平成

２７年３月３１日

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４１０歯科学報 Vol．１１６，No．５（２０１６）いまむらけんたろう氏名（本籍）

今

村

健太郎

（東京都）学位の種類博士（歯学）学位記番号第２０７８号（甲第１２９１号）学位授与の日付平成２７年３月３１日学位授与の要件学位規則第４条第１項該当

学位論文題目 Cigarette smoke condensate modulates migration of human gingival epithelial cells and their interactions with

Porphyromonas gingivalis

掲載雑誌名 JournalofPeriodontalResearch 第５０巻３号４１１－４２１頁２０１５年論文審査委員（主査）村松敬教授（副査）新谷誠康教授齋藤淳教授石原和幸教授加藤哲男教授論文内容の要旨１．研究目的喫煙は歯周病の重大なリスクファクターである。喫煙が歯周組織に及ぼす影響については，主にニコチンを中心に研究がなされてきた。しかし，タバコ煙が宿主細胞に及ぼす影響，とくに歯周病原細菌の存在下における影響については，未だ明らかにされていない。そこで本研究では，タバコ煙濃縮液への暴露と Porphy romonas gingivalis 感染がヒト歯肉上皮細胞の機能，とくに遊走能および細菌の宿主細胞への侵入能に及ぼす影 響を検討した。２．研究方法ヒト歯肉上皮細胞 Ca９-２２を１０％FBS 添加 MEM にてコンフルエントに達するまで培養した。各種濃度のニコチンまたはタバコ煙濃縮物（CSC）を２４h 作用させた後，細胞の生死をトリパンブルー排除試験，細胞増殖能を WST-１，創傷閉鎖能（遊走能）を wound healing assay にて評価を行った。細胞形態の変化は，位相差顕微鏡および共焦点レーザー顕微鏡（CSLM）にて解析した。また，integrin の発現局在を CSLM にて観察し， mRNA 発現をリアルタイム RT-PCR を用いて定量した。以上の実験は， P. gingivalis ATCC ３３２７７の感染下 （MOI＝１００，２h）でも行った。 P. gingivalis の Ca９-２２への侵入能は antibiotic protection assay および CSLM

にて評価した。３．研究成績および結論喫煙者の唾液中濃度に相当するニコチン濃度の範囲において，Ca９-２２の細胞生死と増殖能に変化は認められなかった。CSC 濃度０．１－５０µg/ml では遊走能に濃度依存性の促進が認められ，位相差顕微鏡では細胞形態に，CSLM では細胞骨格に変化が観察された。２５０µg/ml（ニコチン濃度約６．０µg/ml 相当）以上の CSC 濃度では遊走能の抑制が認められたことから，CSC は濃度により歯肉上皮細胞に二相性の影響を及ぼすことが示唆された。一方， P. gingivalis を感染させると遊走能は全体的に抑制され，CSC による促進傾向は認められな かった。また，遊走能を促進させた CSC 濃度において，scratch 側に近接した細胞における integrin α３の発現の亢進が観察され，さらに mRNA 量も約２倍の増加を示した。一方， P. gingivalis を感染させると遊走能， integrin α３の発現は全体的に抑制され，CSC による促進傾向は認められなかった。低濃度 CSC の暴露によ ― ６６ ―

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４１１歯科学報 Vol．１１６，No．５（２０１６）り P. gingivalis の Ca９-２２への侵入は亢進した。 以上の結果より，CSC は濃度によりヒト歯肉上皮細胞の遊走能に二相性の影響を及ぼし，これには細胞骨格と integrin 発現の変化が関与していることが示唆された。さらに，このような影響は P. gingivalis 感染によ り修飾されることが確認された。論文審査の要旨本研究は，歯周炎の環境面でのリスクファクターとして重要な喫煙が歯周病原細菌と宿主細胞との相互作用に及ぼす影響について検討することを目的に行われた。その結果，タバコ煙濃縮物（CSC）は濃度によりヒト歯肉上皮細胞の遊走能に二相性の影響を及ぼし，そのメカニズムとしては細胞骨格と integrin 発現の変化が関与していることが示唆された。さらに，この影響は Porphyromonas gingivalis 感染により修飾されることが明 らかとなった。本審査委員会では，１．参考とした唾液中のニコチン濃度は喫煙後，どれくらいで測定されているのか，２．アクチンのリアレンジメントの関与について，阻害実験は行ったか，３．CSC 添加なしで P. gingivalis 感

染により wound closure の減少がみられないのはなぜか，４．高濃度 CSC で P. gingivalis の侵入が減少して いるが，これは喫煙の利点と考えてよいか，５．他の細胞では同様の結果が得られるか，といった質問および指摘があった。これらに対して，１．引用文献では最後の喫煙から９時間後に測定されており，これはニコチンの half-life を考慮した wash-out period とされている，２．Cytochalasin D 等を使用した阻害実験が考えられるが，これについては講座の過去の研究および他の研究で既に確認されている，３．減少はみられたが有意差はなかった。 P. gingivalis の strain の違いや感染時間等の影響もあると考える，４．細菌の侵入が減少した としても，高濃度 CSC では細胞骨格や形態自体が著しく変化し，遊走能も低下しており，これらの点からは生体には負の影響であると認識している，５．CSC の影響は細胞の種類により異なる可能性があり，今後他の細胞を使用し検討する必要がある，と概ね妥当な回答が得られた。さらに用語の統一や論文の構成，とくに考察の論理展開についての指摘があり，修正が行われた。以上より，本研究で得られた結果は今後の歯学の進歩，発展に寄与するところ大であり，学位授与に値するものと判定した。 ― ６７ ―